Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin, und dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_141007) unterstützt. Markus Saxer leistete technische Unterstützung.

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie vom 22. September 2010 des Rates durchgeführt (2010/63 / EU) und wurden überprüft und durch die Schweizer Behörden zugelassen. 1. Einrichten Organotypische Entorhino-Hippocampus-Schnittkulturen <ol><li> Bereiten entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen (EHOSCs) von postnatalen Tag 4 (P4) Maus Welpen mit der statischen Methode Inkubation 4,11. Hier verwenden C57Bl6 und CB6F1 Mäusen. <ol><li> Nehmen Sie etwa ...

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Mit den hier vorgestellten Methoden kann Hippocampus organotypischen Schnittkulturen als vielseitiges Werkzeug zur plastischen Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu untersuchen. Während organotypischen Kulturen haben in der Vergangenheit für die Untersuchung der neuronalen Reaktionen nach Ischämie 6, 7 der neuen Aspekt der gleichzeitigen Untersuchung von Gefäßveränderungen verwendet wurde erheblich erweitert die Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode. Die Induktion der OGD oder Hypoxie al...

Das Zentralnervensystem ist besonders empfindlich gegenüber einem Verlust oder Reduktion von Sauerstoff und Glucose durch die Gefäßversorgung. Selbst eine eher kurze Unterbrechung der Blutversorgung des Gehirns kann einen dauerhaften Verlust der Funktion der jeweiligen Hirngebiete, die zu den typischen Hub-Syndrome zu induzieren. Zusätzlich zu dem Verlust von Nervenzellen in den primären betroffenen Gebieten gibt es typischerweise zusätzliche verzögerten neuronalen Verlust durch Sekundärschäden. Leider bis jetzt keine neuroprotektive Behandlung zur Verringerung von Sekundär neuronalen Tod verfügbar war 1. Forschungsanstrengungen zur Untersuchung der Mechanismen der Sekundärschäden auf der Verwendung von Tiermodellen der zerebralen Ischämie wie mittleren Hirnarterie Okklusion und verschiedenen thrombotischen Verschluss Techniken beruhen (eine aktuelle Übersicht siehe 2). Parallel auch aufgrund von Einschränkungen und ethische Bedenken bei der Verwendung von Tiermodellen, organotypischen Kultur der verschiedenen ZNS-Gewebe verwendet wurden, die die stu ermöglichendy der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Art der Verletzungen 3-5. Für die Untersuchung der neuronalen Reaktion unter Bedingungen, die ischämische Gehirnverletzung zu imitieren, ist das Modellsystem von Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) entwickelt. In diesem Modell werden die Schnittkulturen vorübergehend auf einem Medium, das Glucose mangelt und wurde mit Stickstoffgas in der Abwesenheit von Sauerstoff ausgesetzt, äquilibriert worden. Bei einer solchen Behandlung ist es möglich, neuronaler Verletzung und der Verlust der eher ähnlich dem nach ischämischer Verletzung in vivo 6, 7 beobachtet induzieren. Im Hippocampus, induziert eine derartige Behandlung neuronaler Verluste insbesondere in der CA1, aber nicht in der CA3-Bereich oder dem Gyrus dentatus des Hippocampus. Im Gegensatz dazu ist die Untersuchung des vaskulären Reaktionen in Schnittkulturen bisher nicht weit verbreitet durchgeführt. Ein offensichtlicher Grund ist der Mangel an Durchblutung und Gefäßdurchblutung in der Schnittkultur-Modell. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass es möglich ist, b zu erhaltenlood Gefäße im ZNS Schnittkulturen für mehrere Tage 8, 9. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, um das Schicksal von Neuronen nach OGD nicht nur überwachen, sondern erstrecken sich die Studie mit dem Schicksal und den Umbau des Gefäßsystems, die ein wichtiger Teil der Schädigung Antwort ist. Bis jetzt solche Studien haben die Verwendung von Tierversuchen erforderlich (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al., 2001). In der hier vorgestellten Protokoll, werden wir detailliert, wie solche Studien können in entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen getan werden herausgefordert, entweder mit Hypoxie oder durch exzitotoxische Läsionen gefolgt von der Analyse der beiden neuronalen Überleben und Blutgefäßreaktionen. Dieses Protokoll basiert auf einer zuvor veröffentlichten Studie zu diesem Thema 10 und kann nützlich für jedes Labor interessiert neurovaskulären Wechselwirkungen im ZNS sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Ischämischen Hirnverletzung ist eine der häufigsten und schwersten Bedingungen Kompromisse ordnungsgemäße Funktion des Gehirns und führt zu anhaltenden funktionellen Defiziten in den betroffenen Patienten oft. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen, gibt es noch keine wirksame Behandlungsmethode verfügbar, die neuronale Verletzung reduziert und schützt Neuronen in den ischämischen Bereichen von verzögerten Sekundär Tod. Forschung in diesem Bereich umfasst typischerweise die Verwendung von aufwendigen und problematischen Tiermodellen. Entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen mit Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD) in Frage gestellt werden in vitro Modelle, die zerebrale Ischämie imitieren etabliert. Der neuartige Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass Veränderungen der Gehirnblutgefäße neben neuronalen Veränderungen und die Reaktion sowohl des neuronalen Raum und dem vaskulären Kompartiment untersucht verglichen und korreliert werden. Die in diesem Protokoll vorgestellten Verfahren die möglichen Anwendungen der wesentlichen verbreitern oderganotypic Schnittkultur-Ansatz. Die Induktion der OGD oder Hypoxie allein durch relativ einfache Mittel in organotypischen Kulturen angewendet werden und führt zu einer zuverlässigen und reproduzierbaren Schäden im Nervengewebe. Dies steht in krassem Gegensatz zu den komplizierten und problematischen Tierversuche Induktion Schlaganfall und Ischämie in vivo. Durch die Erweiterung der Analyse auf die Untersuchung der Reaktion des Gefäßsystems könnten neue Möglichkeiten auf, wie die Erhaltung und Wiederherstellung Hirnfunktionen bereitzustellen. Die Schnittkultur hier vorgestellte Ansatz könnte zu einem attraktiven und wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der ischämischen Hirnschädigung entwickeln und könnte nützlich für die Prüfung potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf die Neuroprotektion angestrebt werden.

Sauerstoff Glukose Deprivation und Hypoxie induzieren neuronalen Tod und Gefäßreduktion insbesondere im Hippocampus CA1-Region. OGD oder Sauerstoffentzug allein für 15 Minuten führte zu einer starken Induktion von Zelltod durch Propidiumiodid-Färbung spezifisch in der CA1-Region des Hippocampus (Figur 3) gesehen, ähnlich wie zuvor beschrieben 7. Mit den Markierungen von Blutgefässen zu visualisieren, wurde festgestellt, dass der Blutgefäßdichte und Organisation erschi...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...