Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Università di Basilea, Dipartimento di Biomedicina, e il Fondo nazionale svizzero (31003A_141007). Markus Saxer ha fornito supporto tecnico.

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità delle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e sono stati esaminati e autorizzati dalle autorità svizzere. 1. Impostazione culture fetta Organotipica Entorhino-ippocampali <ol><li> Preparare organotipica culture fetta entorhino-ippocampale (EHOSCs) da postnatali cuccioli giorno 4 (P4) del mouse utilizzando il metodo di incubazione statico 4,11. Qui, utilizzare C57BL6 e CB6F1...

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Con i metodi qui presentati, ippocampo culture fetta organotipica può essere utilizzato come uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l&#39;infortunio. Mentre culture fetta organotipica sono stati utilizzati in passato per studiare le reazioni neuronali dopo ischemia 6, 7, il nuovo aspetto dello studio simultaneo di cambiamenti vascolari aumenta notevolmente le potenziali applicazioni di questo metodo. L&#39;induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con ...

Il sistema nervoso centrale è particolarmente sensibile ad una perdita o riduzione di ossigeno e glucosio da parte del sistema vascolare. Anche un piuttosto breve interruzione della fornitura di sangue al cervello può indurre una perdita permanente della funzione delle aree cerebrali interessate conducono alle tipiche sindromi ictus. Oltre alla perdita neuronale nelle aree colpite primari, di solito si aggiunge la perdita neuronale ritardata attraverso danni secondari. Purtroppo fino ad oggi, nessun trattamento neuroprotettivo per la riduzione della morte neuronale secondaria era disponibile 1. Le attività di ricerca per lo studio dei meccanismi di danno secondario si basano su l&#39;uso di modelli animali di ischemia cerebrale come mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale e varie tecniche di occlusione trombotica (per una recente rassegna vedi punto 2). In parallelo, anche a causa di limitazioni e problemi etici con l&#39;uso di modelli animali, la cultura fetta organotipica di vari tessuti del sistema nervoso centrale sono stati utilizzati che permettono la study delle reazioni neuronali a vari tipi di lesioni 3-5. Per studiare la reazione neuronale in condizioni che mimano lesione cerebrale ischemico, è stato sviluppato il sistema di modello di deprivazione di ossigeno glucosio (OGD). In questo modello, culture fetta sono temporaneamente esposti a un mezzo che manca di glucosio ed è stata equilibrata con gas azoto in assenza di ossigeno. Con tale trattamento, è possibile indurre danno neuronale e la perdita che è piuttosto simile a quella osservata dopo danno ischemico in vivo 6, 7. Nell&#39;ippocampo, tale trattamento induce la perdita neuronale specificamente nel CA1, ma non nella zona CA3 e giro dentato dell&#39;ippocampo. Al contrario, lo studio delle reazioni vascolari in culture fetta finora non è stato ampiamente intrapresa. Una ragione ovvia è la mancanza di circolazione e vaso sanguigno perfusione nel modello di cultura fetta. Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che è possibile mantenere bvasi Lood in CNS fetta culture per diversi giorni 8, 9. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di monitorare non solo il destino dei neuroni dopo OGD ma estendere lo studio al destino e il rimodellamento del sistema vascolare, che è una parte importante della risposta lesioni. Fino ad ora tali studi hanno richiesto il ricorso alla sperimentazione animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Nel protocollo qui presentato, ci sarà dettaglio come tali studi può essere fatto in organotipica culture fetta entorhino-ippocampale sfidato sia con ipossia o da lesioni eccitotossici seguita da analisi di entrambe le reazioni di sopravvivenza e vascolari neuronali. Questo protocollo si basa su uno studio precedentemente pubblicato sull&#39;argomento 10 e può essere utile per qualsiasi laboratorio interessato interazioni neurovascolari nel SNC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Lesione cerebrale ischemica è tra le condizioni più comuni e devastanti compromettenti corretto funzionamento del cervello e porta spesso a persistenti deficit funzionali nei pazienti affetti. Nonostante gli sforzi di ricerca intensiva, non esiste ancora una opzione di trattamento efficace disponibile che riduce il danno neuronale e protegge i neuroni nelle aree ischemiche dalla morte secondario ritardo. La ricerca in questo settore in genere comporta l&#39;uso di modelli animali elaborati e problematici. Culture fetta organotipica Entorhino-ippocampale sfidati con deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) sono stabilite in modelli in vitro che imitano l&#39;ischemia cerebrale. L&#39;aspetto innovativo di questo studio è che i cambiamenti dei vasi sanguigni cerebrali sono studiati in aggiunta ai cambiamenti neuronali e la reazione sia del compartimento neuronale e il compartimento vascolare possono essere confrontati e correlati. I metodi presentati in questo protocollo ampliare notevolmente le potenziali applicazioni della oganotypic approccio cultura fetta. L&#39;induzione di OGD o solo ipossia può essere applicato con mezzi relativamente semplici in culture fetta organotipiche e porta a danni affidabile e riproducibile nel tessuto neurale. Ciò è in netto contrasto con i complicati e problematici esperimenti sugli animali che inducono ictus e ischemia in vivo. Ampliando l&#39;analisi per comprendere lo studio della reazione del sistema vascolare potrebbe fornire nuovi modi su come conservare e ripristinare le funzioni cerebrali. L&#39;approccio della cultura fetta presentato qui potrebbe trasformarsi in uno strumento interessante e importante per lo studio del danno cerebrale ischemico e potrebbe essere utile per testare potenziali misure terapeutiche volte a neuroprotezione.

La privazione dell&#39;ossigeno glucosio e ipossia induce la morte neuronale e la riduzione dei vasi sanguigni in particolare nella regione ippocampale CA1. OGD o ossigeno-privazione solo per 15 min indotto una forte induzione di morte cellulare come visto da propidio ioduro colorazione specificamente nell&#39;area CA1 dell&#39;ippocampo (Figura 3) analogo a quello descritto in precedenza 7. Con i marcatori di visualizzare la rete di vasi sanguigni, si è constatato che la den...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l&#39;infortunio.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

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