Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, ea National Science Foundation suíço (31003A_141007). Markus Saxer prestou apoio técnico.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. 1 Configurando culturas fatia Organotípicas Entorhino-hipocampo <ol><li> Prepare entorhino-hipocampal culturas organotípicas (EHOSCs) de pós-natal filhotes dia 4 (P4) do mouse usando o método de incubação 4,11 estática. Aqui, utilizam ratinhos C57BL6 e CB6F1. <ol><li...

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Com os métodos aqui apresentados, hipocampo culturas organotípicas de fatias pode ser utilizado como uma ferramenta versátil para estudar alterações plásticas no tecido neural após a lesão. Enquanto as culturas organotípicas de fatias tenha sido utilizado no passado para o estudo de reacções neuronais após isquemia 6, 7, o novo aspecto do estudo simultâneo de alterações vasculares aumenta significativamente as aplicações potenciais do presente método. A indução de hipoxia ou OGD por si só...

O sistema nervoso central é particularmente sensível a uma perda ou redução do fornecimento de oxigénio e glicose pela vasculatura. Mesmo um tanto curta interrupção do fornecimento de sangue para o cérebro pode induzir uma perda permanente da função das áreas cerebrais relevantes que levam às síndromes típicas tempos. Além da perda de neurônios nas áreas afetadas primários, há normalmente uma perda neuronal atraso adicional através de danos secundários. Infelizmente, até agora, nenhum tratamento neuroprotector para a redução da morte neuronal secundária estava disponível um. Os esforços de pesquisa para estudar os mecanismos de lesão secundária se baseiam na utilização de modelos animais de isquemia cerebral como a oclusão da artéria cerebral média e de várias técnicas de oclusão trombótica (para uma revisão recente ver 2). Em paralelo, também devido a limitações e preocupações éticas com o uso de modelos animais, cultura fatia organotípica de vários tecidos do sistema nervoso central têm sido utilizados que permitam o study de reações neuronais para vários tipos de lesões 3-5. Para estudar a reacção neuronais sob condições que imitam a lesão cerebral isquémica, o sistema modelo de privação de oxigénio glicose (OGD) foi desenvolvido. Neste modelo, as culturas de fatia são temporariamente expostos a um meio que carece de glicose, tendo sido equilibrada com o gás de azoto na ausência de oxigénio. Com um tal tratamento, é possível induzir a lesão neuronal e perda, que é bastante semelhante ao observado após lesão isquémica in vivo de 6, 7. No hipocampo, um tal tratamento induz a perda neuronal em CA1 especificamente, mas não no área CA3 ou do giro dentado do hipocampo. Em contraste, o estudo de reacções vasculares em culturas de fatias até agora não tem sido amplamente realizadas. Uma razão óbvia é a falta de circulação e de vasos sanguíneos de perfusão no modelo de cultura de fatia. Contudo, mostrámos previamente que é possível manter bvasos Lood em CNS fatia culturas por vários dias 8, 9. O objetivo geral deste método é monitorar não só o destino dos neurônios após POG, mas estender o estudo para o destino e remodelação da vasculatura que é uma parte importante da resposta a uma lesão. Até agora, os estudos têm exigido a utilização de experiências com animais (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). No protocolo apresentado aqui, vamos detalhar como tais estudos podem ser feitos em culturas fatia organotypic entorhino-hipocampal desafiou tanto a hipóxia ou por lesões excitotóxicos seguida da análise de ambos os sobrevivência e vasos sanguíneos reações neuronais. Este protocolo é baseado em um estudo publicado anteriormente sobre o assunto 10 e pode ser útil para qualquer laboratório interessado em interações neurovasculares no SNC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Lesão cerebral isquêmica é uma das condições mais comuns e devastadoras que comprometem a função cerebral adequada e muitas vezes leva a persistir déficits funcionais nos pacientes afetados. Apesar dos esforços de pesquisa intensiva, ainda não existe uma opção de tratamento eficaz disponível, que reduz a lesão neuronal e protege os neurônios nas áreas isquêmicas da morte secundário atrasado. A investigação nesta área, tipicamente envolve a utilização de modelos animais e elaborados problemáticos. Culturas fatia organotípica Entorhino-hipocampal desafiados com privação de oxigênio e glicose (POG) são estabelecidos em modelos in vitro que mimetizam isquemia cerebral. O aspecto inovador deste estudo é que as alterações dos vasos sanguíneos do cérebro são estudadas, além de alterações neuronais ea reação tanto do compartimento neuronal e compartimento vascular podem ser comparados e correlacionados. Os métodos apresentados neste protocolo ampliar substancialmente as aplicações potenciais da ouabordagem da cultura fatia ganotypic. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Isto está em contraste com os experimentos em animais complexos e problemáticos induzindo acidente vascular cerebral e isquemia in vivo. Ao ampliar a análise para incluir o estudo da reação da vasculatura poderia fornecer novas maneiras de como preservar e restaurar as funções cerebrais. A abordagem da cultura fatia apresentado aqui pode se transformar em uma ferramenta atrativa e importante para o estudo da lesão isquêmica cerebral e pode ser útil para testar medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção.

Oxygen privação de glicose e hipóxia induzir a morte neuronal e redução dos vasos sanguíneos, especificamente na região CA1 do hipocampo. OGD ou privação de oxigénio e durante 15 min, sozinho induziu uma forte indução de morte celular como observado por coloração com iodeto de propídio, especificamente na área CA1 do hipocampo (Figura 3), semelhante ao descrito anteriormente 7. Com marcadores para visualizar a rede de vasos sanguíneos, verificou-se que a densi...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurociência

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

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Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

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Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...