Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00
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著者らは、フローサイトメトリーの支援をジェームズOesterlingに感謝したいと思います。この研究は、米国国立がん研究所（R01-CA178380、ZY）および米国国立衛生研究所博士研究訓練助成金（5T32CA009035-37、LWY）からの助成金によってサポートされていました。

このプロトコルにおける動物の使用は、フォックスチェイスがんセンター動物実験委員会によって承認された手順に従って行われている。 楽器、ソリューション、およびカバーガラスの作製<ol><li> ＃5細かい鉗子のクリーン二組、＃7の1組の罰金、湾曲鉗子、一つの大きな外科はさみ、1 microdissectingはさみ、1へら一あきスプーン。セルフシール滅菌袋とオートクレーブ中...

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

ここで説明顕微解剖法は、分子的および機能的分析において使用するための生細胞の純粋な集団を単離することができる最初の手順である。 Li ら9によって実証されるように、 この方法で得られたのNEPを培養し、各種実験に組み込むことができ、その高い純度で、マイクロアレイ分析のためにも使用することができる。 これは顕微解剖技術に習熟?...

小脳は、それぞれが異なる細胞型を含む、複数の細胞層から構成されている。開発中は、EGLは分子層とプルキンエ層はそれぞれ、バーグマングリアとプルキンエニューロンを含み、一方顆粒ニューロン前駆体（のGNP）が増殖して含まれています。小脳内のディープは、神経幹細胞（NSC）およびオリゴデンドロサイト1が含まれている白質を、ある。 ソニックヘッジホッグ（Shhが）小脳発生の調節において重要な役割を果たしており、特に、パッチが適用その受容体（PTC）、Shhの2-4シグナルの負の調節因子への結合を介してのGNPの増殖を促進する。 Shhシグナル伝達の異常な活性化は、髄芽腫（MB）、小児5,6で最も一般的な悪性脳腫瘍を生成します。 PTCミュータントMBトランスジェニックマウスモデルは、MBの研究のための強力なツールであり、人間のMB 7,8に似た腫瘍を発症。これらを使用したマウスは、それがのGNPはハリネズミ型MB 7起源の細胞であることが発見された。さらに、のG​​NPに加えて、私たちは最近、またMBを生じさせることができる開発する小脳のEGL内の神経前駆細胞のユニークな集団を同定した。これらの細胞は、タイプVIの中間フィラメントタンパク質、ネスチンを高レベルで発現し、9のNEPと呼ばれる。のNEPは、EGLの深部内に配置され、唯一の新生児小脳の開発中に一過的に存在している。彼らはのGNPのような顆粒細胞系譜にコミットしますが、彼 ​​らは静止状態にしてのMath1、従来のGNP 10のためのよく確立されたマーカーを発現しないように区別されます。さらに、NEPのは彼らMBの腫瘍形成のための新規の原点になりShhのシグナル伝達経路9、起動後のMBの上昇よりも効率的にのGNPを与える。 私たちは、以前に顕微解剖技術によって生後4日目（P4）での小脳のEGLからのNEPを隔離ここで9について説明した。組織の直接顕微鏡可視化を介したマイクロダイセクションは、小脳のEGLの特定の解剖を可能にします。ネスチンはまた、分子層1,7,11,12に小脳白質中のNSCによってとバーグマングリアによって発現し、それは彼らが分析を混乱さと同じように、これらの細胞は、含まれていないことが非常に重要でしているように、これが必要です。顕微解剖組織から単離された細胞は、分子分析のために直ちに使用することができ、またはそれらは、さらなる用途のために培養することができる。 具体的にはEGLをmicrodissectingにおいて補助するために、さらなるのNEPを精製する、 のMath1-GFP（緑色蛍光タンパク質）マウスは、 ネスチン-CFP（シアン蛍光タンパク質）マウスと交配した。 Math1または特異的のGNP及びGFPの発現によって発現される転写因子は、EGL 9,13においてはっきりと見える。 ネスチン-CFPマウスはCFPの核型を発現し、容易に分子層9,14に視覚化することができる。一緒に、GFPとCFP式がEGLのマイクロダイセクションのための境界を作成します（ 図1を参照）。 CFP陽性のNEPは、その後解剖しEGLsの酵素的解離に続いて、FACSによって単離した。 現在、EGLから細胞を単離するための最もよく利用される方法は、全小脳組織15,16のパーコール勾配遠心分離である。しかし、この方法は、完全に分子層と白質のネスチン+細胞集団を除外することができないのでのNEPの研究のために使用することができない。関心のある細胞を除去するためにレーザエネルギーの転送を利用するレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、異種の組織17,18内の特定の細胞を単離するために使用されるが、捕捉された細胞のみがDNA、RNAおよびタンパク質の回収のために使用されないことができる別の方法である培養することができるように。 このプロトコルは、具体的には、EGLからのNEPの生きている、純粋な集団を単離する方法を提供します。この技術は、認識可能な解剖学的アーキテクチャまたは蛍光標識された細胞/領域のいずれかを有する異なる組織タイプに適用することができる。したがって、細胞単離プロトコールにこの新規顕微解剖技術を組み込むの主な利点は、細胞が隣接する組織を汚染除去するために、特定の組織領域から単離することができ、細胞は、他のアプリケーションの分析または培養のためにすぐに収集することができることである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="572">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Neurobasal media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PDL</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ultra pure low melting temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DPBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

顕微解剖は、組織の特定の領域を分離し、隣接領域における細胞源からの汚染を排除することができる新規な技術である。この方法は、最初にネスチン発現前駆細胞（のNEP）の研究では、小脳の外部胚層（EGL）内の細胞の新たに同定された集団において利用した。蛍光活性化細胞分類（FACS）と組み合わせてマイクロダイセクションを使用して、のNEPの純粋な集団は、小脳におけるEGLにおける従来の顆粒神経細胞前駆体から及び他の汚染ネスチン発現細胞とは別に収集した。マイクロダイセクションがなければ、のNEPの機能解析は、パーコール勾配遠心分離およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとして利用可能な現在の方法では不可能でした。この技術は、認識可能な領域または蛍光標識された細胞のいずれかを含むさまざまな組織との使用のために適用することができる。最も重要なことは、このmicrodissectioの主な利点n個の技術は、単離された細胞が生きていると、他に記載された方法で、現在は不可能であるさらなる実験のために培養することができるということです。

図1Aに示すように、小脳スライスは小脳EGLは、GFP発現のGNPによって支配された分子層がCFP陽性グリア細胞によって濃縮された、P4 のMath1-GFP / ネスチン-CFPマウスから調製した。 （; 図1A点線に沿って）EGLの深部に位置しているのNEPを単離するために、スライスは、EGLと分子層の間に顕微解剖された。解剖EGLs（ 図1B）は、次いで、FACS続い酵素?...

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

ネスチン発現前駆細胞は、発展途上小脳における神経前駆細胞の新たに同定された集団である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてここで示さ顕微解剖技術を用いて、この細胞集団は、他の小脳領域から汚染を含んでいない精製することができ、さらなる研究のために培養することができる。

マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

神経科学

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...