Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Yazarlar yardım flow sitometri James Oesterling teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (R01-CA178380, ZY) ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Doktora Sonrası eğitim bursu (5T32CA009035-37, LWY) bir hibe ile desteklenmiştir.

Bu protokolde hayvanların kullanımı Fox Chase Kanser Merkezi&#39;nde Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Göstergeler, Çözümler ve lameller 1. Hazırlık <ol><li> # 5 ince forseps temiz iki takım, 7. bir set ince kavisli forseps, büyük bir cerrahi makas, bir Microdissecting makas, bir spatula ve bir delikli kaşık. Kendi kendine yapışan bir sterilizasyon kese ve otoklav içindeki aletleri yerleştirin. Kull...

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs.">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li><li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis.">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li><li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+developmental+mechanisms+out+of+control.">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li><li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity.">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li><li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons.">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li><li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas.">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li><li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Burada anlatılan yöntem mikrodiseksiyon moleküler ve fonksiyonel analizlerde kullanım için canlı hücreler saf bir popülasyonu izole etmek mümkün ilk işlemdir. Li ve ark. 9 ile gösterildiği gibi, Bu yöntemle elde edilen NEP kültürlenmiştir ve çeşitli deneyler dahil edilir ve olduğu gibi yüksek saflıkta, aynı zamanda mikro-dizi analizi için de kullanılabilir edilebilir. Bu mikrodisseksiyon tekniğiyle ustalaşmanın zaman çok önemlidir....

Beyincik, çok hücreli bir katman, her biri farklı hücre tiplerinde meydana gelir. Moleküler tabaka ve purkinje katman sırasıyla Bergmann glia ve purkinje nöronları içeren ise gelişme sırasında, EGL granül nöron öncüleri (kişi başına milli geliri) çoğalan içerir. Beyincik içinde derin nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) ve oligodendrositleri 1 içeren beyaz madde, yatıyor. Sonic dikenli proteini (Shh) serebellar gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı ve özellikle de, kendi reseptörü olan yamalı (PTC), Shh, 2-4, sinyal bir negatif düzenleyicisi bağlanarak kişi başına milli geliri çoğalmasını teşvik eder. Sus sinyal anormal aktivasyonunun Medulloblastom (MB), çocuklarda 5,6 en sık görülen kötü huylu beyin tümörü oluşturur. Ptc mutant MB transgenik fare modelleri MB çalışma için güçlü araçlar vardır ve insan MB 7,8 benzeyen tümörler gelişebilir. Kullanarak bufarenin, bu kişi başına milli geliri kirpi tipi MB 7 kökenli hücre olduğu keşfedildi. Ayrıca, ek olarak kişi başına milli geliri, yakın zamanda da MB ortaya çıkmasına neden olabilir gelişen beyincikte de EGL içinde nöronal progenitörlerin benzersiz bir popülasyonu tespit ettik. Bu hücreler, tip VI filaman protein Nestin yüksek seviyelerde ifade etmek ve NEP 9 olarak adlandırılır. NEP EGL derin bölümü içinde yer alan ve sadece yenidoğan serebellar gelişme sırasında geçici olarak mevcut olurlar. Onlar kişi başına milli geliri olarak granül hücre soyu kararlıdır ama onlar sakin ve Math1, konvansiyonel kişi başına milli geliri 10 köklü bir işaretleyici ifade yok gibi farklıdır edilmektedir. Buna ek olarak, NEP onları MB tümörogenez için yeni bir kökeni yapar Şşş sinyal yolunun 9 aktivasyonu sonrası MB yol daha verimli kişi başına milli geliri verir. Biz daha önce mikrodisseksiyon tekniği ile doğum sonrası 4. günde (P4) de serebellar EGL gelen NEPS izoleburada 9 nitelendirdi. Dokunun direkt mikroskopik ile mikrodiseksiyon serebellar EGL belirli diseksiyon sağlar. Nestin da serebellar beyaz cevher ve moleküler tabaka 1,7,11,12 Bergmann glia ile NSC&#39;lerde ifade ve analizleri etkileyebilecek gibi o, bu hücreler dahil edilmemesi çok önemliydi gibi bu gereklidir. Microdissected dokudan izole edilen hücreler moleküler analiz için hemen kullanılabilir ya da daha fazla uygulama için kültürlenebilir. Özellikle EGL Microdissecting yardımcı olmak için ve daha fazla nepler arıtmak için Math1-GFP (yeşil floresan protein) farenin Nestin-CFP (mavi floresan protein) fareler ile çaprazlandı. Math1 spesifik kişi başına milli geliri ve GFP ifadesi ile anlatılmak istenen, transkripsiyon faktörü EGL 9,13 açıkça görülebilir. Nestin-CFP farenin CFP nükleer şeklinde ifade ve kolayca moleküler tabakanın 9,14 olarak görselleştirilebilir. Birlikte, GFP ve CFP ifade EGL mikrodiseksiyonu için sınırlarını oluşturmak (Şekil 1). CFP pozitif NEP daha sonra kesilmiş EGLs enzimatik ayrışma sonrasında, FACS ile izole edilmiştir. Şu anda, EGL hücreleri izole etmek için en çok kullanılan yöntem, tüm beyincik dokusuna 15,16 Percoll gradient santrifüjleme. Ancak bu metot, tam olarak moleküler tabakanın beyaz maddeden Nestin + hücre popülasyonlarının dahil yapamaz ve dolayısıyla neps çalışma için kullanılamaz. Ilgi hücreleri çıkarmak için lazer enerjisinin transferini kullanan lazer yakalama mikrodiseksiyon, heterojen bir doku 17,18 içinde belirli hücreleri izole etmek için kullanılabilir, ancak yakalanan hücreleri sadece DNA, RNA ve proteinin geri kazanılması için kullanılan ve değildir başka bir yöntemdir edebilmek yetiştiriciliğine. Bu protokol, özellikle EGL gelen NEP&#39;lerin bir canlı, saf bir nüfusunu yalıtmak için bir yol sağlar.Bu teknik aynı zamanda tanınan anatomik mimari veya flüoresan etiketli hücre / alanlara sahip farklı doku türlerine uygulanabilir. Bu nedenle, hücre izolasyon protokolleri, bu yeni mikrodiseksiyon tekniği içeren en büyük avantajı, hücreler, doku komşu kirletici ortadan kaldırmak için özel doku bölgeleri izole edilebilir ve hücreler, diğer uygulamalar için veya kültür analizi için hemen elde edilebilmesidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="572">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Neurobasal media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PDL</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ultra pure low melting temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DPBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Mikrodisseksiyon bir doku spesifik bölgelerini izole ve komşu bölgelerde hücresel kaynaklardan kirlenmeyi ortadan kaldırabilir yeni bir tekniktir. Bu yöntem, ilk çalışmada kullanılmıştır Nestin salgılayan progenitorlar (döküntüler), serebellar dış germinal tabakadan (EGL) hücrelerin yeni tespit edilen bir popülasyon. Floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) ile kombinasyon halinde kullanılması mikrodiseksiyon, neps saf nüfus serebellumda EGL geleneksel granül nöron habercilerden ve diğer kirletici Nestin salgılayan hücrelerin ayrı olarak toplanmıştır. Mikrodiseksiyonu olmadan, NEP&#39;lerin fonksiyonel analizleri gibi Percoll santrifüj ve lazer yakalama mikrodiseksiyon olarak kullanılabilir mevcut yöntemleri ile mümkün olmazdı. Bu teknik aynı zamanda tanınan bölgeleri veya floresan ile etiketlenmiş ya da hücreleri içeren çeşitli dokularda kullanılmak için de uygulanabilir. Bu microdissectio en önemlisi büyük bir avantajdırn, teknik izole edilmiş canlı hücreler ve başka tarif edilen yöntemler ile mümkün değil ayrıca deney için kültürlenebilir olmasıdır.

Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, serebellar dilim hangi serebellar EGL GFP ifade kişi başına milli geliri hakim ve moleküler tabaka CFP pozitif glial hücreler tarafından zenginleştirilmiş P4 Math1 GFP / Nestin-CFP farelerden hazırlandı. (Şekil 1A kesikli hattı boyunca) EGL derin kısmında bulunan lif düğümlerini izole etmek için, dilimler EGL ve moleküler tabaka arasında microdissected edildi. Disseke EGLs (Şekil 1B) daha sonra...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection at JoVE.com

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...