Name: methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans
Uploaded: 2014-11-13T14:00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. זנים, תרבות, ומיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים לטפל ולשמור על של C. elegans כפי שתוארו לעיל 19. זנים זמינים ממרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC). הערה: הזנים המשמשים בניסויים אלה היו CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) אני;-8 (e1489 IV)) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למיטוכונדריה וגרעין; PJ727 (jls01 (מיו-3 :: GFP, רול-6 (su1006)); UNC-54 :: lacZ V) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למנגנון ההתכווצות וPD55 (ccIs55 (sup-7 (st5); unc- 54 :: lacZ V)) עם חלבוני היתוך β-galactosidase המקומיים לcytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי RNAi מלאים כפי שתואר לעיל עבור ניסויי RNAi דורית 13 ולקבל חיידקי RNAi מהרצף מאומתים ספריית ORF-RNAi שנבנתה על ידי מארק ואח ידאל אל. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות זנים המכילים &lt;<html> em&gt; ccIs 4251, jls01 או ccIs 55 תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 20. השתמש transgenes אלה כדי ליצור מתח כדי להעריך מבנה המיטוכונדריה רשת, ארגון שרירן או מדינת פרוטוסטאזיס, בהתאמה. לחצות את הזנים למוטציה בי מסתכל על אחד מהתאים תת-התאיים אלה בכל בעל חיים הוא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במעכב PtdIns-3-kinase, LY-294,002 (LY) כפי שתוארו לעיל 21. בקצרה, להוסיף LY-294,002 בריכוז סופי של 160 מיקרומטר על גבי צלחות NGM OP50 הזרע יבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את כל התמונות באמצעות מסנן ה- GFP לניסויים מבוסס-GFP ומיקרוסקופ עם מסנן משולש עוקף המאפשר הדמיה של ערוצים אדומים, ירוק וכחול במקביל להערכה בפוטנציאל הממברנה vivo עם C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, נפוץ משווק כMitoTracker האדום CMXRos. לבצע ניתוח תמונה והכנת דמות בתוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. סנכרון של בעלי חיים הזחל L1 שימוש הכבידה הנפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום 1 צורך לפני, לעשות חיץ M9 - 22.04 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42.27 מ&quot;מ Na 2 4 HPO, 85.56 מ&quot;מ NaCl (ריכוזים סופיים), ולעקר ידי מעוקר. ברגע שהתקרר עד 45 מעלות צלזיוס, להוסיף סטרילי MgSO 4 עד 1 מ&quot;מ לאחר מעוקר כדי למנוע משקעים 22. לאפשר M9 להתקרר על 4 מעלות צלזיוס וaliquot לתוך צינורות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניסוי, להוסיף 3 מיליליטר חיץ M9 לצלחת 9 סנטימטר בודד עם מספרים גבוהים של זחלי L1. לשטוף את הצלחת שוב ושוב על ידי aspirating נוזל M9 וpipetting נגד פני השטח של אגר עם הצלחת שנערכה בזווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את L1 של מהצלחת ולאחר מכן להעביר את M9 למבחנת 10 מיליליטר בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר למשך 2.5 דקות, כדי לאפשר למבוגרים ולבעלי חיים בשלב זחל מאוחר יותר הגדולים יותר ליפול לתחתית המבחנה ובעלי החיים L1 הקטנים יותר להישאר ליד top של חיץ M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 500 μl העליון של M9 במבחנה באמצעות פיפטה. אז פיפטה זחלי L1 M9 המכילים לצלחת NGM חדשה שנזרע עם 500 OP50 μl מתחת היקף לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, שואף להעביר ~ 200-300 זחלי L1 לכל צלחת. צג צלחות יומיים מבגרות ובמידת צורך, לאסוף בעלי חיים על צלחות NGM OP50 טריות כדי למנוע להישרף מקור מזון OP50. הערה: זה בדרך כלל 1-3 טיפות של M9 באמצעות פיפטה P1000, אם כי זה משתנה במידה רבה בהתאם למספר L1 של על הצלחת המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מחקרים פרוספקטיביים בבעלי חיים בודדים רצויים, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, לאסוף בעלי חיים בודדים להפריד צלחות NGM זרע. העברת בעלי חיים בכל שעות 24-48 להיפרד מבעלי החיים זחל. </li></ol> 3. מבחני תנועה 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינימום של 2 שעות לפני תחילת ניסויים, להסיר aliquot 50 מיליליטר של M9 ולאפשר לאזן לטמפ &#39;החדרerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חיה מבוגר יחידה למאגר M9 50 μl על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר העיקולים גוף השמאלי וימינה ב 10 שניות, שבו שמאלה אחד ועיקול אחד ימינה שווים למכה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הספירה של תנועות גוף כדי לתת כולל של לפחות 5 מדידות שממנו ניתן לקחת ממוצע. להכפיל מספרים אלה על ידי שש לתת שיעור התנועה לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להעביר את בעל החיים חזרה לצלחת פטרי. שיטה זו מאפשרת מדידה זמנית של תנועה לאורך כל תוחלת החיים בים elegan ג. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: מבחני תנועה. ברגע שתולעים נאספים למאגר, שמאלה אחד () וימינה עיקול אחד (B) מתווספים יחד כדי לתת תנועה אחת מלאה(שבץ). 4. הדמיה של מיטוכונדריאלי רשתות וSarcomeres בגוף קיר שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הפרוטוקול זהה חל על הדמיה של שתי המיטוכונדריה וsarcomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן תולעים כפי שתואר לעיל (סעיף 1) ולגדול ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים לבגרות צעירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים (נציג של הצלחת) מהצלחות אל 20 μl M9 על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל להחליק את המכסה ולהמשיך תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מסנן GFP (460-500 ננומטר, עירור אור הכחול) ב40X הגדלה. </li></ol> 5. הערכת ממברנה פוטנציאלית על ידי שימוש צבירה Assay in vivo עם MitoTracker האדום CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן CB5600 (סעיף 1), כל שכותרתו עם GFP במיטוכונדריה של שרירים, ולגדול לבגרות מוקדמת על OP50 מכיל NGM ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl DMSO לaliquot 50 מיקרוגרם של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O כדי להפוך את פתרון מניות של 940.692 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של פתרון מניות 940.692 מיקרומטר וresuspend לתוך 199 μl M9 ליצור פתרון עבודה של 4.70 מיקרומטר (4.70346 מיקרומטר). להכין את זה בצינורות 1.5 מיליליטר חומים כי C 32 H 32 Cl 2 N 2 O הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 aliquots μl של מיקרומטר 4.70 פתרון עובד (20 תולעים בוגרות לכל 20 aliquot μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 בעלי חיים מבוגרים ל -20 μl של C 4.70 מיקרומטר 32 H 32 Cl 2 N 2 O בצינורות 1.5 מיליליטר החומים. לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, להוסיף 1 מיליליטר M9 לצינורות 1.5 מיליליטר החום המכילים תולעים, צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 10 שניות ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על שלב זה לשטוף לפני resuspending גלולה התולעת והעברת 20 μ שנותרl (המכיל תולעים) לשקופית הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של המיטוכונדריה עם 40X הגדלת שימוש במסנן מעביר משולש שמאפשר הדמיה של שני הערוצים האדומים, כחולים וירוקים בו זמנית. הדמיה באמצעות המסנן המשולש העוקף תערוכות שיתוף לוקליזציה של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O עם GFP המקומי למיטוכונדריה מופיעה ככתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלקח תמונה של המיטוכונדריה הכתומה, צילום להלבין את בעלי החיים במשך 10 שניות באמצעות אור באורך הגל 540/25 ננומטר על הגדרות מקסימום עם כל המסננים הוסרו. זה להלבין אדום בתוך המיטוכונדריה ולחשוף את ה- GFP המיטוכונדריה לבד כדי לאשר colocalization במיטוכונדריה שרירים. </li></ol> 6. הערכה של פירוק חלבוני שריר ב C. elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD55s לסנכרן (או כל זן המכיל את גן lacZ) על צלחות NGM זרע עם OP50 (סעיף 1). לגדול לבגרות צעירה ל48-60 שעות ב20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים בוגרות ל -20 μl DDH 2 O על שקופיות מיקרוסקופ. להיות זהיר כדי לנסות ולבחור רק את התולעת ולא כל חיידקים עם הבחירה. תווית שקופית מיקרוסקופ בעיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בתא הייבוש למשך 30 דקות לייבוש ולפצח את הציפורן של בעלי החיים. להבטיח חותם חזק על הייבוש באמצעות שומן סביב החותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ההתייבשות היה יעיל תחת בהיקף לנתח (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את שקופיות מיקרוסקופ באצטון קר כקרח ל3.5 דקות לאחר מכן לעזוב את שקופית מיקרוסקופ על מגבת נייר בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות, כדי לאפשר אצטון בשקופית להתאדות. בשלב זה להפשיר את חיץ X-gal וחמצון ולאפשר equilibrating לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף X-gal 2 μl 100 μl חיץ חמצון ומערבולת בעדינות כדי להבטיח זאת היא הומוגנית. זהו תמהיל אב חיץ X-gal / החמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מיקס מאסטר חיץ X-gal / חמצון לכל oאזור riginal של 20 תולעים. בדוק תחת בהיקף לנתח על מנת להבטיח את תערובת האב מכסה לחלוטין את כל בעלי החיים לחלוטין. בעדינות להטות את שקופית מיקרוסקופ כדי להעביר את תערובת האמן על אזורים שבם בעלי חיים אינם מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף מיקרוסקופ בתא לחות ל1-2.5 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים תמונה כאשר צבע כחול כהה נמצא בקיר שרירי גופם של בעלי החיים שליטה. להעריך חיות שליטה לפי היקף לנתח כל 15 דקות כדי לקבוע מתי צריכים להיות צילמו בעלי חיים. </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: הערכה של פירוק חלבוני שריר תוך שימוש במבחני β-galactosidase. בעלי חיים (א) המכילים transgene lacZ נקטפים מצלחות פטרי 20 μl DDH 2 O בשקופית מיקרוסקופ (ב &#39;). בעלי החיים מיובשים ולהיות בורה <sטרונג&gt; (C). אז בעלי חיים נשטפים באצטון (ד &#39;). ברגע שאצטון מתאדה תערובת אמן חיץ X-gal / חמצון נוספת (E). הפיתוח של צבע הכחול בבעלי החיים שליטה נבחנים במרווחים של 15 דקות (FL) מt = 0 דקות (F) ועד צבע כחול כהה מתקבל על פני האורך של בעלי החיים (L). תמונות של תולעים נלקחות בהגדלה 2.5x ב AE ו 8X בפלורידה. מתקרב C, D, F, G, ו- L הוא 4X ההגדלה המקורית.

The authors have nothing to disclose.

שריר הוא רקמה רב תכליתי, להערכה גם לתפקידה בתנועה, תמיכה וחילוף חומרים יציבות. הפיתוח והתחזוקה של שרירים בריאים דורשים התיאום של תהליכים תאיים רבים ורכיבים. או דרך נזק או מחלה, חוסר ויסות יכול להתרחש, וכתוצאה מכך מבנה שריר שינה ו / או בתפקוד. ירידת גיל הקשורים בתפקוד שרירים מציגה נטל משמעותי לתקציבי בריאות בעולם המערבי, שכן מסת שריר 1,2 ובמיוחד כוח וסבולת שרירים 3-5 מתואם שלילי עם תמותה. המדידה של היבטים הקשורים בתפקוד שרירים מתדרדר כגון מיטוכונדריה שינו או שיבוש sarcomere, יכולה לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס פיתוח שרירים כללי ובריאות. elegans aenorhabditis C (סי אלגנס) הוא BES נמטודות מיקרוסקופילא ידוע כי זה היה אורגניזם רב-תאי הראשון שיש כל הגנום שלו רצף 6, הראשון לגנים המושתקים באמצעות 7 RNAi, ומטזואניים רק כדי elegans 9 נקבע. ג השושלת כל תא 8 וneuroanatomy הוצע לראשונה כ מודל ללימוד הבקרה הגנטית של התנהגות בשנת 1974 על ידי סידני ברנר 10 ואת החשיבות של זה ואת העבודה שלאחר מכן הוכר עם הראשון של שלושה פרסי הנובל שהוענק לחוקרי C. elegans. כ -35% מC. elegans גנים זיהו orthologues בבני אדם, עם סי אלגנס להיות האורגניזם מפתח המשמש להבנת הבקרה הגנטית של התפתחות שרירים 11. כמעט בכל גן בגנום סי אלגנס יכול להיות שברה באמצעות RNAi 7,12. כך, על ידי דריסה גנים בשרירים מפותחים במלואו, מרכיבים גנטיים תורמים למחדשgulation בריאות שרירים יכול להיחקר עם פשטות היחסית 13. היכולת המשולבת לשימוש, מוטציות, ותרכובות כימיות RNAi עושה C. elegans מערכת מובילה לחקר הרגולציה הגנטית 7,14,15 של מבנה שרירים ובתפקוד עם גיל 16 ובמודלים של מחלות 17. ההשפעה של מציאה גן, מוטציה, ו / או חשיפה לחומרים כימיים במבנה שריר ו / או תפקוד ניתן למדוד באמצעות היבטים רבים. כאן אנו מתארים בקצרה טכניקות פשוטות להערכת מבנה C. elegans שרירים ובתפקוד, שרבים מהם יכולים לשמש במחקרים פרוספקטיביים של בריאות שרירים. הפיתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 18 אפשר להדמיה של שני היישוב של חלבונים ספציפיים והמבנה הכללי של האברונים ב C. elegans. כאן אנחנו מסבירים כיצד ה- GFP הביע ספציפיfically בתוך המיטוכונדריה קיר שרירים גוף, ניתן להשתמש בגרעינים, או sarcomeres כדי לקבוע אם ניוון של מבנים תת-תאיים אלה הוא הווה. כמבנה הוא לא תמיד תחליף אמין לפונקציה, אנחנו גם מסבירים כיצד השימוש בצבע קטיוני in vivo מאפשר הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה פגום שבתוך שריר. כאשר הצבעים משמשים בשילוב עם ה- GFP, שמתירים ללימודי אדריכלות ולתפקד באופן זמני לאורך כל חיים. לבסוף, אנחנו גם מסבירים כיצד הומאוסטזיס חלבונים בתוך שריר ניתן להעריך וכיצד כל אלו, ניתן להשתמש כדי לתאם שינויים בבריאות שרירים בעלי החיים שלמים באמצעות שימוש במבחני תנועה. טכניקות אלו, בשילוב עם מציאה גן, מוטציות, ו / או תרכובות כימיות לספק ארסנל רב עוצמה ללימוד כיצד גנים או תרכובות מסוימים להשפיע על בריאות שרירים בגוף חי. המקבילות במבנה, חילוף חומרים ותפקוד ברוטו של שריר בין סי אלגנס ויונקים אומר סי אלגנס הוא אורגניזם מודל מצטיין להבנת הרגולציה של שריר באורגניזמים שונים, לרבות בני אדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

שריר הוא רקמה דינמית המגיבה לשינויים בתזונה, פעילות גופנית, ומצב מחלה. אובדן מסת שרירים ובתפקוד עם מחלה וגיל הוא עול משמעותי על בריאות ציבור. בשלב זה אנו מבינים קצת על הרגולציה הגנטית של בריאות שרירים עם מחלה או גיל. סי אלגנס נמטודות הוא מודל שהוקם להבנת הרגולציה הגנומי של תהליכים ביולוגיים של עניין. קיר שרירי גוף של תולעת זו להציג מידה רבה של הומולוגיה עם השרירים של מינים מטזואניים גבוהים יותר. מאז סי אלגנס הוא אורגניזם שקוף, הלוקליזציה של ה- GFP למיטוכונדריה וsarcomeres מאפשרת הדמיה של מבנים אלה in vivo. באופן דומה, האכלת בעלי חיים צבעים קטיוני, אשר מצטברים על בסיס קיומו של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה in vivo. שיטות אלה, כמו גם הערכה של homeosta חלבון השריראחות, בשילוב עם הערכה של תפקוד שרירים בעלי החיים שלם, בצורה של מבחני תנועה, כדי לאפשר התאמה של פגמי משנה הסלולר עם פעולות פונקציונליות של ביצועי שרירים. כך, סי אלגנס מספק פלטפורמה רבת עוצמה שבה להעריך את ההשפעה של מוטציות, מציאה גן, ו / או תרכובות כימיות במבנה שרירים ובתפקוד. לבסוף, כGFP, צבעי קטיוני, ומבחני תנועה מוערכים הלא פולשני, ניתן לבצע מחקרים פרוספקטיביים של מבנה שרירים ובתפקוד בכל רחבי כמובן חיים וזה כיום לא ניתן לחקור בקלות in vivo בכל אורגניזם אחר.

מבחני תנועה לכמת פגמי תנועה ירידת תנועה היא מנבא טוב לתמותה בג elegans 16, עם ירידה בשיעורים המצביעים על בעיות במערכת העצבית-שהרירית. שינויים בתנועה, כפי שהוערך על ידי מבחני תנועה, יכולים לנבוע מRNAi נגד גן ספציפי או טיפול תרופתי (איורים 3-5) או בבעלי חיים שעברו מוטציה 13, 23. ירידה בתנועה יכולה לנבוע מפיתוח שינה לדוגמא הבאה דפיקה התפתחותית מטה של גני הובלת אלקטרונים קידוד אני מורכב, III, IV או V 24. בנוסף, ניתן לבדוק התערבויות ספציפיות על סי אלגנס מבוגרים רק כדי לחקור את ההשפעה על פיזיולוגיה פוסט-התפתחותית. לדוגמא, בעלי חיים שטופלו בRNAi נגד UNC-112, המקודדים את C. elegans orthologue של Kindlin-1 אשר מותאם לintegrin מכילהמתחמי קובץ מצורף שריר (איורים 3 ו -4), או גז-1, אשר מקודד מרכיב שלי מורכב של שרשרת העברת אלקטרונים (איור 4), להציג מתווית הפחתה בתנועה לעומת שליטה מתפקיד בגרות-48-72 שעות. זה עשויה להצביע על בעיות עם פיזיולוגיה של שרירים. באופן דומה, הפסד של תנועת 24-72 שעות הוא ציין בתגובה לטיפול במבוגרים בדרך כלל פותח עם טיפול במעכב PI3K LY-294,002 (איור 5). אפשר גם לבדוק את ההשפעה של טיפול שני RNAi, מוטציה, או תרופה בשיקום תנועה בבעלי חיים בו מוצגות תנועה מופחתת בתגובה להתערבות ראשונית. לדוגמא, 112 מוטציות unc- להציג ירידה לכימות בתנועה בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר שמוחלש בנוכחות מוטציה שנייה ב 1 לעמעם-13. לכן, מבחני תנועה יכולים לזהות שתי ההתערבויות שמשנות neuromuscuפיתוח LAR ו / או בתפקוד, כמו גם אלה המשפרים ו / או לשקם את התפקוד עצבי-שרירית. הערכה של שיבוש sarcomere לאחר שזיהה את פגם תנועה, הוא לעתים קרובות רצוי לקבוע אם הגורם לפגם התנועה יכול להיות מוסבר על ידי בעיות בעצבים, שרירים, או שניהם. Sarcomeres הם קומפלקסים רב-חלבון בתוך שריר המאפשרים התכווצות וכך להכריח את הדור ותנועה. על ידי בעלי חיים תוך ניצול להביע חלבוני היתוך GFP שרירן מקומיים למנגנון ההתכווצות, לחוטי שרירן וsarcomeres מידת השיבוש יכולה להיות שנצפתה יחסית הלא פולשני ולהבא בבעלי חיים בודדים באמצעות פיתוח ו / או בבגרות. חיות בר-סוג להציג sarcomeres ערוך המופיעים מספר שורות הירוקות מקבילות ישר בתוך כל גוף קיר שרירים (איור 3). הפרעה למערכים הרגילים אלה עשויות להיות קטנה יחסית עםsarcomeres ערוך מופיע להתאחד, במקום שנותר במקביל. פנוטיפ זה, גלוי עם UNC-112 RNAi בזמן t = 24 שעות או 48 שעות (איור 3), דומה להזרמת Z-קו של אתרים מצורפים אקטין בשריר של יונקים. באופן דומה, מנות קטנות של המערכים יכולות להתמוטט או שהם יכולים להיעלם כגון לחלוטין כטיפול בUNC-112 RNAi בזמן t = 48 שעות או t = 72 שעות (איור 3). הנוכחות של פגמי sarcomere בתוך השריר של בעלי חיים המציגים פגם תנועה (איור 3) די בכך כדי להסביר את פגם התנועה אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות בתגובה להתערבות . הערכה של מבנה מיטוכונדריאלי רשת בנוכחות פגם תנועה זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לדה התנועהfect. המיטוכונדריה מספקת את חלק הארי של אנרגיה בתאים וירידה בתנועה עשויה להיות התוצאה של מתן ATP מופחת, צמצום זמינה להתכווצות שריר האנרגיה. כך המבנה של המיטוכונדריה יכול להיבחן על ליקויים. חשוב לא לטשטש חיות עם אזיד הנתרן כפי שגורם לפיצול במיטוכונדריה מהיר; בעלי חיים בניסויים אלה היו משותקים על ידי הלחץ המופעל על ידי להחליק את המכסה. בתוך סי אלגנס wild-type קיר שרירים גוף, מיטוכונדריה נמצאות בתוך רשתות מאורגנות (איור 4) ומיטוכונדריה קיימות ופועלת כרשתית 25. שיבוש של הרשת של המיטוכונדריה מציג כפיצול של הרשת (גז-1 RNAi, איור 4) 26. פיצול עשוי להיות חמור מספיק שלא מראית עין של רשתות מאורגנות נשארה כגון טיפול עם UNC-112 RNAi (איור 4 ב ו-ג) 13. כwiשיבושי ה במבנה sarcomere, פגמים במבנה המיטוכונדריה שרירים בבעלי המציגים פגם תנועה עשויים להיות מספיק כדי להסביר את פגם התנועה אבל זה לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. לדוגמא, UNC 112-מוטציות 13 וטיפול בUNC-112 RNAi (איורים 3 ו -4) תצוגת שני sarcomeres שיבש ושבשו מבנה המיטוכונדריה. הערכה של תפקוד המיטוכונדריה Vivo פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה קובע את היכולת של המיטוכונדריה כדי ליצור כוח המניע של פרוטונים וליצור 27 ATP, ולכן היכולת להעריך את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo מציין את היכולת של בעלי החיים כי כדי לייצר ATP. כשיבושים מבניים המיטוכונדריה יכולים או לא יכולים לשנות יכולת התפקודית של המיטוכונדריה, זה עשוי להיות desirable כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בבעלי חיים בו מוצגות מבנה המיטוכונדריה שינה. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה, בכל סוגי התאים, שבו פוטנציאל קרום הוא בהווה ובמכתים את המיטוכונדריה 28 (איור 4C). במיוחד כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בשריר, אפשר להשתמש 32 C H 32 Cl 2 N 2 O ומיטוכונדריה השרירים GFP שכותרתו כדי להדגים את ההשפעות של התערבות באופן ספציפי על המיטוכונדריה שריר (איור 4C). לדוגמא, אובדן טיפול המיטוכונדריה קרום פוטנציאלי הבא עם UNC-112 RNAi מונע C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מלהיכנס למטריקס. המיטוכונדריה לכן להראות מעט, אם בכלל כתמים אדומים של המיטוכונדריה בנוסף לתיוג GFP של המיטוכונדריה (איור 4C). גם צילום הלבנה ניתן להשתמש כדי לוודא שנצפהמיטוכונדריה הן דווקא אלה בשריר (איור 4C). זיהוי של קיבולת מופחתת כדי לייצר ATP די בכך כדי להסביר את פגם תנועה שנצפה אך לא לשלול בעיות אחרות בתוך שריר, עצב, ו / או רקמות אחרות. ללא קשר, כמו כושר ייצור ATP המופחת קשור למצבי מחלה בבני אדם 29 והזדקנות 30, זיהוי פגם כזה בתגובה להתערבות מספק במה להקרנה לתרכובות ו / או טיפולי RNAi המשפרים את כושר ייצור ATP ולאחר מכן רשאית אלה תחקור יותר לעומק לפוטנציאל טיפולי. הערכה של פירוק חלבונים בנוכחות פגם תנועה וsarcomeres והמיטוכונדריה נורמלים זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לפגם התנועה. היכולת לשמור על הומאוסטזיס חלבון היא חתימה של לאבריאות mal, ואילו ירידה בסינתזה של חלבונים ו / או עלייה בפירוק חלבונים היא תוצאה של הזדקנות 31 ומצבי מחלה מרובים 32,33. לכן זה עשוי להיות רצוי לבחון את השרירים של בעלי חיים עם מום תנועה להומאוסטזיס חלבון שונה. ניתן לעשות זאת באמצעות הערכה של רמות של חלבוני שריר cytosolic. השימוש בחלבונים המקודדים על transgenically מאפשר הערכה של פרוטוסטאזיס הספציפי שרירים. לדוגמא, שימוש בבעלי החיים המכילים β-galactosidase, התמזגה לחלק N-terminal של שרירן, שמסונתזים תחת שליטתו של אמרגן שרירן ומשפרים מאפשר הערכה של תכולת חלבון שריר cytosolic 19. הנוכחות של כתם הכחול במבוגרים wild-type מדגימה את הנוכחות של β-galactosidase הפעיל והעדר פירוק חלבוני cytosolic פתולוגיים. הפסד של מכתים בתגובה לטיפול מצביע על פירוק חלבונים פתולוגיים מתרחש (איור 5 </strong&gt;), כβ-galactosidase יציב במשך 72 - לאחר בגרות 96 שעות במבוגרים wild-type 13,14,19. לדוגמא, בעלי חיים שלא טופלו wild-type להציג כתם כחול 72 שעות אינטנסיביות אחרי הבגרות, ואילו LY-249,002 חיות שטופלו להציג חוסר הכתם (איור 5). כמו בפגמים במבנה sarcomere ותפקוד המיטוכונדריה, הנוכחות של פירוק חלבוני שריר פתולוגיים די לחשבון לפגם תנועה נצפית אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: (א) UNC-112 RNAi גורם פגם תנועה משמעותי בזמן t = 72 שעות הערכה (B) של מבנה להקה ערוך בתוך קיר גוף שרירים.. בwלא, להקות בשריר מופיעים קווים ישרים כמו בבגרות צעירה (t = 0 hr) ונותרו במידה רבה אחיד עד מעבר 72 שעות של בגרות (ראה זום WT). UNC-112 RNAi גורם sarcomeres לאבד ארכיטקטורה באזורים קטנים של השריר (t = 24 שעות), התמוטט וsarcomeres החסר (t = 48 שעות), צבירה (פנל העליון t = 72 שעות וזום) ואיבוד הליניאריות של sarcomeres (פנל תחתון t = 72 שעות וזום). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4: () UNC-112 או גז 1 RNAi גורם פגם תנועת הערכה (B) של מבנה המיטוכונדריה בתוך קיר גוף שרירים.. המיטוכונדריה בשרירים מופיעה קווים ישרים ברשת כבבגרות צעירה (WT). טיפול בבעלי החיים עם UNC-112 RNAi התוצאה mitochondrפיצול ial כפי שנצפה בעבר בין 24 שעות ו -72 שעות של בגרות (מתקרב וחץ) 13. כמו כן, RNAi נגד גז -1 תוצאות בפיצול של רשתות המיטוכונדריה כפי שנצפו בעבר 26. אלה נמצאים כפערים קטנים ברשת של המיטוכונדריה בזמן t = שעה 24 והתקדמות לחוסר ארגון נרחב ב 72 שעות (ראה זום וחץ). הערכה (C) של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo. בבעלי חיים המכילים גם GFP מקומי למיטוכונדריה, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה שריר קיר גוף ומופיעים כתומים תחת מסנן משולש הגבהה מבגרות צעירה (t = 0 שעה) עד שלאחר בגרות 72 שעות. טיפול עם UNC-112 RNAi גורם לאובדן הדרגתי של פוטנציאל הממברנה כפי שמוצג ב 72 שעות שבו המיטוכונדריה שנותרה להראות פחות הצטברות של C 32 H 32 Cl 2 N 2 O לעומת WT. Photobleaching 10 seג באמצעות מלביני 540/25 ננומטר אור האדום מMitoTracker ומגלה GFP המקומי למיטוכונדריה שריר (+ אקונומיקה תמונה). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5: (א) טיפול בLY-294,002 בעלי חיים גורם פגם תנועת הערכה (B) של פירוק חלבונים באמצעות assay β-galactosidase.. הגיל המסונכרן WT זחלי L1 גדלים לבגרות צעירה ב 20 ° C (t = 0 שעה) לפני העברה לNGM זרע עם OP50 (שליטת WT) או NGM זרע עם LY-294,002 (טיפול מעכב PI3K) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס . ב, כ 20-30 בעלי חיים מוכתמים עבור פעילות β-galactosidase (הכחול) בשעה t = 0 שעה ולאחר 24 שעות, 48 שעות ו -72 שעות.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...