Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

نشكر مركز المعلوماتية الحيوية وعلم الجينوم وظيفية (CBFG) في جامعة ميامي للدعم التقني. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ميامي منحة بدء (YT)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (YT: IOS 0950964).

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

<html> هناك عدد من القضايا الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار لضمان نجاح رني، بما في ذلك طول وتركيز جزيئات الرنا المزدوج الجديلة، والمنافسة بين جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة (عند محاولة متعددة نهدم)، وإمكانية خارج الهدف آثار (OTE). طول الرنا المزدوج الجديلة طول جزيئات الرنا المزدوج الجديلة يؤثر على كفاءة الاستجابة النظامية رني، مع الرنا المزدوج الجديلة أطول كونها أكثر كفاءة لتحريك رني 7،14،15 (على الرغم من أن الحد أطول من الرنا المزدوج الجديلة غير معروف حاليا). طول الرنا المزدوج الجديلة يجب أن يكون أطول من 50 نقطة للحث على فعالية رني في T. كاستانيم 7. الرنا المزدوج الجديلة بين 150 نقطة أساس و 500 نقطة أساس على ما يبدو مثاليا للتجارب رني. على الرغم من أن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة أطول يمكن أن تستخدم أيضا، سيكون لديهم فرصة زيادة OTE وخطوة استنساخ الجين سوف يصبح من الصعب على نحو متزايد. الرنا المزدوج الجديلة تركيز ve_content &quot;&gt; درجات مختلفة من ضربة قاضية الجينات يمكن أن يتحقق اعتمادا على تركيز الرنا المزدوج الجديلة. 1 ميكروغرام / ميكرولتر يبدو أن تركيز انطلاق معقولة، والتي غالبا ما تنتج النمط الظاهري شبه فارغة (قد تختلف اعتمادا على الجينات (ق) من الفائدة ). رني لا يمكن أن يؤديها مع تركيز أعلى (على سبيل المثال، 7-8 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على النمط الظاهري رني أقوى. رني مع التخفيف التسلسلي الرنا المزدوج الجديلة يمكن أن تكون أحيانا مفيدة لإنتاج سلسلة من الظواهر hypomorphic (التكميلي بيانات توموياسو وآخرون 2009 8، وبوراس-كاستلز بيانات غير منشورة). رني المنافسة ضربة قاضية متعددة الجينات يمكن أن يتحقق في T. كاستانيم عن طريق حقن جزيئات الرنا المزدوج الجديلة عدة مختلفة في نفس الوقت. ومع ذلك، فمن المعروف أيضا أن وجود عدة جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة موجودة داخل الكائن الحي غالبا ما يؤدي إلى المنافسة بين dsRNAs للوصول إلى مكونات رني <sتصل&gt; 7،14. من المهم استخدام نفس الطول ونفس التركيز لجميع الرنا المزدوج الجديلة عند محاولة متعددة الجينات لتجنب ضربة قاضية الرنا المزدوج الجديلة واحد خارج المنافسة الآخرين (على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة لإجراء مزيد من التعديلات على طول الرنا المزدوج الجديلة والتركيز عند مستويات التعبير تختلف بشكل كبير بين الجينات المستهدفة). نحن، فضلا عن غيرهم، أجرت بنجاح ضربة قاضية مزدوجة وثلاثية (على سبيل المثال، توموياسو وآخرون 2005 16، توموياسو وآخرون 2009 17، ويانغ وآخرون 2009 18). على الرغم من ذلك ممكنا، الرباعي رني (أو أكثر) قد تكون صعبة، لأنه من المحتمل أن يسبب انخفاض كبير في كفاءة رني لجميع الجينات الأربعة المستهدفة. حالا تستهدف OTE هو القلق المتأصل للنهج القائم رني. طريقة واحدة للحد من OTE في تحديد المناطق المستهدفة في الجينات التي تشترك تسلسل مماثلة مع جينات أخرى وتجنب هذه المناطق عند تصميم الرنا المزدوج الجديلة. تحليل بسيط BLAST ضد T. كاستانيم توقع مجموعة الجينات يمكن التعرف على هذه المناطق. العديد من الأدوات على الانترنت تسمح أيضا تقييم OTE المحتملين (مثل E-رني 19). أداء رني لمنطقتين غير متداخلة من الجين المستهدف هو وسيلة سهلة وفعالة للقضاء على احتمال تلك التي لوحظت هي سبب الظواهر التي OTE. يتم التقليل من إمكانية OTE إذا رني لمنطقتين غير متداخلة تنتج نفس الظواهر (ما لم تشترك في المنطقتين غير متداخلة تسلسل مماثل). تقييم الجينات ضربة قاضية بوسائل غير المظهرية يحلل غالبا ما يكون حاسما في البيانات المتعلقة رني الحالية بشكل فعال. بطريقتين رئيسيتين لتقييم ضربة قاضية الجينات هي QRT-PCR وتحليل لطخة الغربي. QRT-PCR هو وسيلة مريحة لقياس مستوى مرنا الهدف، واستخدمت في العديد من الدراسات المتعلقة رني بما في ذلك تلك الموجودة في T. كاستانيم (انظر ميلر وآخرون 2012 7 على سبيل المثال). Howevإيه، ويجب اتخاذ الحذر، كما رأينا مؤخرا بعض الحالات التي يكون فيها مستوى مرنا الهدف بواسطة رني التنظيم حتى (على الرغم من أن المنتج هو بروتين ينظم أسفل) (بوراس-كاستلز بيانات غير منشورة). ومن غير المعروف حاليا ما إذا كان هذا مرنا رني الناجم عن التنظيم يمكن أن يكون واسع النطاق أو فريدة من نوعها لجينات معينة. تحليل لطخة الغربي هو طريقة أخرى لتأكيد ضربة قاضية الجين. هذه الطريقة غير موثوق بها تماما كما أنه يقيس كمية من البروتين المنتج النهائي. اشتراط وجود الأجسام المضادة المحددة ضد البروتين المنتج من الجين المستهدف هو الجانب السلبي لهذا النهج. وباستخدام قياسات مستقلة متعددة بالإضافة إلى تحليل المظهري زيادة ثقة البيانات المظهرية التي حصل عليها التحليل القائم رني. منذ بدايته في T. كاستانيم، وقد استخدمت في المقام الأول رني لدراسة وظيفة الجين في التنمية وتشكيل نمط. هذه T. وكانت دراسات التنموية كاستانيم ناجحة للغاية في characterizing الوظائف المحفوظة تطويريا وتباعدت من الجينات (مراجعة في دينيل 2008 1 وKlingler و2004 2). دراسات ومع ذلك، استنادا رني في T. كاستانيم لا تقتصر على البيولوجيا التطورية. على سبيل المثال، رني يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجين في مجموعة واسعة من الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، بما في ذلك التسامح الإجهاد، والافتراس والعدوان، واختيار رفيقة، وأنماط النشاط، وآليات الدفاع. واحد صعوبة تطبيق رني إلى هذه السياقات هي احتمالات الآثار عديد المظاهر. في كثير من الأحيان، فإن جينات الفائدة لديها مجموعة متنوعة من الأدوار في جميع أنحاء T. كاستانيم دورة الحياة، مما يجعل إزالة الجينات من دون آثار المظهري غير مقصودة الصعبة. ومع ذلك، فإن القدرة على أداء بسهولة رني في مجموعة متنوعة من المراحل يمكن أن يكون في كثير من الأحيان استراتيجية فعالة لتجنب هذه الآثار عديد المظاهر. على سبيل المثال، وأداء رني في البالغين بدلا من اليرقات أو العذارى قد تسمح لنا بالتغلب على عزيزمالت الفتك الناجمة عن ضربة قاضية الجين خلال النمو المبكر. المرونة للاستجابة رني في T. كاستانيم مما يجعل هذا الطراز خيارا جذابا للتكيف رني إلى تجارب من وظيفة الجين في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية. ت. نظام كاستانيم هو أيضا مثالية للاستخدام في مختبر التدريس. T. كاستانيم يمكن تربيتها بسهولة على الدقيق / خليط الخميرة في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) دون subculturing المتكرر، وتقنيات رني في T. كاستانيم بسيطة بما فيه الكفاية لأن تتكيف مع مختبر مع الشباب والعلماء التعلم. كما رني أصبح تقنية أساسية في مجموعة متنوعة من المجالات البيولوجية، فمن الأهمية بمكان أن يتعرض الطلاب لهذه التقنية. طبيعة مستقيم الى الامام لتقنية رني اليرقات في T. يشجع كاستانيم أيضا المزيد من الطلاب للمشاركة في البحوث، مما يجعل T. كاستانيم مرشح رئيس لالفصول الدراسية الموجهة للنظام وراثي. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، تكتسب شعبية في مختلف مجالات البيولوجيا ويرجع ذلك جزئيا إلى سهولة أداء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) 1-3. الجينات ضربة قاضية التقنيات المستندة إلى رني تسمح للعلماء لإجراء تحليلات الخسارة من وظيفة دون اللجوء إلى استخدام الأساليب الوراثية المعقدة. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة من خلال حقن بسيطة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (الرنا المزدوج الجديلة) في الخنفساء تجويف الجسم 4-6. ضربة قاضية للجينات متعددة في وقت واحد هي أيضا مجدية في T. كاستانيم عن طريق حقن اثنين أو أكثر من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة مختلفة في نفس الوقت 7،8. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتولد سلسلة من الظواهر hypomorphic عن طريق الحد من تركيز حقن الرنا المزدوج الجديلة 8. هذه الميزات تجعل التقنيات الوراثية العكسية على أساس رني بدائل جذابة لعلم الوراثة إلى الأمام التقليدية في T. كاستانيم. منذ تقريباكل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للخارج الخلية جزيئات الرنا المزدوج الجديلة 9، وهذا الأسلوب يسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هذا التقرير يركز على أداء رني في T. كاستانيم، العديد من الإجراءات الموضحة هنا تنطبق على غيرها من الحشرات. لذلك، هذا البروتوكول هو مفيد لأولئك الذين يرغبون في إجراء تحليلات الخسارة من وظيفة في سياقاتها الاهتمام T. كاستانيم، وكذلك للباحثين الذين يرغبون في تطبيق تقنية رني استنادا إلى الحشرات الأخرى. حقن الرنا المزدوج الجديلة إلى يرقات يسمح التحليل الوظيفي في مجموعة متنوعة من مراحل حياة الخنفساء، بما في ذلك اليرقات، العذراء، والكبار مراحل 4،5،10. لقد ذكرت سابقا لدينا بروتوكول رني العام اليرقات بما في ذلك إجراءات البيولوجيا الجزيئية 11. في التقرير الحالي، ونحن نركز على وصف الإجراءات حقن الرنا المزدوج الجديلة، والتي هي أفضل وأوضح البصري مع مساعديه. نحن نقدمإجراءات مفصلة خطوة بخطوة حقن فضلا عن أمثلة حقن الجيدة والسيئة. هذا البروتوكول يكمل البصرية البروتوكول السابق، وعند الجمع، وتقديم وجهة نظر أكثر شمولا من الإجراءات رني اليرقات في T. كاستانيم. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش المعلمات لجزيئات الرنا المزدوج الجديلة التي يمكن أن تؤثر على نجاح رني، وتطبيق المقايسات مقرها رني للبحوث الفسيولوجي، فضلا عن تطبيق البروتوكول رني اليرقات في المختبر التدريس.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

خنفساء الطحين الحمراء، خنفساء الدقيق كاستانيم، ويوفر ذخيرة من الأدوات التجريبية للدراسات الجينية والتنموية، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل المشروح، نقل الجينات القائم على ينقول، والتدخل الفعال RNA (رني). ومن بين هذه المزايا والتقنيات القائمة على الجينات ضربة قاضية رني هي في صميم البحث كونفيوسم. T. كاستانيم تظهر استجابة قوية رني النظامية، مما يجعل من الممكن لأداء رني في أي مرحلة الحياة ببساطة عن طريق حقن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) في تجويف جسم الخنفساء. في هذا التقرير، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في T. كاستانيم. ويشمل البروتوكول (ط) عزلة المرحلة المناسبة من T. اليرقات كاستانيم للحقن، (ب) تمهيدا لإعداد الحقن، و (iii) حقن الرنا المزدوج الجديلة. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية التي توفر لنا الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة phenotypوفاق، بما في ذلك متعددة الجينات الظواهر ضربة قاضية فضلا عن سلسلة من الظواهر hypomorphic. منذ تقريبا كل T. الأنسجة كاستانيم عرضة للالرنا المزدوج الجديلة خارج الخلية، وتقنية رني اليرقات تسمح للباحثين لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة في سياقات متنوعة، بما في ذلك الأساس الجيني للاستجابات عضوي للبيئة الخارجية. بالإضافة إلى ذلك، بساطة هذه التقنية تحفز مزيدا من المشاركة الطلابية في مجال البحوث، مما يجعل T. كاستانيم نظام وراثي مثالية للاستخدام في الفصول الدراسية.

واحدة من الخطوات الرئيسية للحقن الناجح هو جعل إبرة جيدة. كما هو موضح في الخطوة 6، ورأس الإبرة يجب أن تكون مكسورة قبل حقن T. كاستانيم. وترد أمثلة من الإبر جيدة وسيئة في الشكل 1. إبرة جيدة لها طرف حاد وقاسية، والتي يبلغ قطرها حوالي 0.05 مم افتتاح (الشكل 1B). ويعرض الشكل 2 حقن ناجحة (أرقام 2A و 2B)، فضلا عن العديد من حالات الحقن الفاشلة (أرقام 2C-2F). مع حقن إبرة الحجم بشكل صحيح، طرف الإبرة تخترق بشرة اليرقات مع الحد الأدنى من المقاومة (الشكل 2A)، والحل الرنا المزدوج الجديلة (الأخضر) يصب في اليرقات دون أي تسرب (الشكل 2B). لا الإفراط حقن، لأنه سوف يؤدي فيضان الحل الرنا المزدوج الجديلة حتى مع وجود الحجم بشكل صحيح حقن إبرة (الشكل2C). إذا كان رأس الإبرة رقيقة جدا، وغالبا ما يفشل طرف الإبرة لاختراق إهاب اليرقات والانحناءات، مما يجعل من الصعب حقن (الشكل 2D). إذا حدث هذا، وتقليم طرف الإبرة يساعد في بعض الأحيان. الإبر الكبيرة وغالبا ما تكون لا تزال قابلة للاستخدام، ولكن مع بعض الصعوبات في اختراق اليرقات إهاب (الشكل 2E). ومع ذلك، يتم دفع مبلغ كبير من الحل الرنا المزدوج الجديلة بسهولة من الإبرة حتى مع ضغط طفيف على حقن حقنة، مما أدى إلى فيضان الحل الرنا المزدوج الجديلة (الشكل 2F) في كثير من الأحيان. عند تنفيذ رني، فمن المهم أن يكون هناك مراقبة إيجابية لتقييم رني أن تعمل بشكل صحيح، وسيطرة سلبية للتحقق من أن لوحظ تأثير ليس له تأثير غير محدد من الرنا المزدوج الجديلة أو نتيجة لإجراءات الحقن (مثل الضرر الناجم عن طريق الحقن، أو شذوذ من التخدير بالأثير). حقن الرنا المزدوج الجديلة استهداف EYFP يمكن أن تكون بمثابةمراقبة إيجابية جيدة عند استخدام سلالة 5،7 بو-11. عندما يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة EYFP في مرحلة اليرقات الماضية، انخفاضا كبيرا في إشارة EYFP في الجناح براعم المستقبل يمكن ملاحظتها في وقت مبكر من يوم واحد حقن آخر (الشكل 3A). ضربة قاضية من EYFP كاملة بعد يومين من الحقن EYFP الرنا المزدوج الجديلة (الشكل 3B) واستمرت هذه ضربة قاضية من خلال (3C أرقام و 3D) طور العذراء وطوال حياة خنفساء إذا كان تركيز الرنا المزدوج الجديلة مرتفع بما يكفي (مثل 1 ميكروغرام / ميكرولتر) 7. يمكن أيضا EYFP الرنا المزدوج الجديلة استخدامها كعنصر تحكم السلبية كما هو تسلسل الجينات غير الذاتية، وينبغي ألا تسبب اضطرابات المورفولوجية والفسيولوجية (أرقام 3A-3D). قدمنا ​​الصور من اليرقات رني لرمزي (VG)، جين الجناح النقدي 12، ومثال آخر على كيفية EFfective هذه التقنية رني القائم على الحقن هي في T. كاستانيم. عندما يتم حقن الرنا المزدوج الجديلة لVG قبل الأخيرة في مرحلة اليرقات (مرحلة واحدة قبل مرحلة اليرقات مشاركة)، وفقدان كامل للهياكل الجناح يمكن ملاحظتها في طور العذراء (أرقام 3E و3F). الكبار مما أدى أيضا يفتقر تماما الهياكل الجناح (الأرقام الجيل الثالث 3G و3H). نتيجة رني لVG تجسد كلا متانة وطبيعة نظامية من رني في T. كاستانيم. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1: (A) أمثلة على الإبر متواصلة، جيدة، وأخرى سيئة (B) غيض من إبرة مكسورة جيدة جيدا (C) غيض من إبرة مكسورة كبير جدا وصريحا (D) غيض.. لكسر<html> ن هذا هو إبرة رقيقة جدا. أشرطة النطاق (الأحمر) هي 0.05 ملم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2:. (A) والحجم بشكل صحيح حقن إبرة إدراجها في الطور مشاركة يرقة (B) اليرقة حقن مناسب مع الحل الرنا المزدوج الجديلة الأخضر (C) تجاوز من الحل الرنا المزدوج الجديلة عند نقطة الحقن التي يسببها الإفراط في الحقن (D ) إبرة رقيقة فشله في اختراق إهاب اليرقات. (E) إبرة حقن كبيرة إدراجها في الطور مشاركة يرقة. (F) اليرقة حقن بإبرة كبيرة، مما أدى إلى فيضان وتسرب من الحل الرنا المزدوج الجديلة. تبين الأسهم الإبر.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> الشكل 3: أمثلة من رني ناجحة في T. كاستانيم. (AD) حقن اليرقات آخر نتائج EYFP الرنا المزدوج الجديلة في الحد من EYFP التعبير. (A) يرقات يوم واحد بعد الحقن. (B) اليرقات بعد يومين من الحقن. (C) مراقبة الشرانق. (D) شرانق الناتجة عن اليرقات EYFP حقن الرنا المزدوج الجديلة. الضوابط السلبية هي عازلة حقن (A، B) وdsRed حقن الرنا المزدوج الجديلة (C، D). النصال والسهام تشير EYFP التعبير أو عدم وجودها في براعم الجناح والعينين، على التوالي. (EH) القلمفي نهاية المطاف اليرقات رني لVG. (E) من نوع البرية خادرة. (F) VG رني خادرة. عدم وجود هياكل الجناح مرئيا بالفعل في مرحلة العذراء (السهم). G) من نوع البرية الكبار. (H) VG رني الكبار. الجناح الهياكل ذات الصلة مفقودة تماما (السهم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تقنيات الجينات ضربة قاضية المستندة هي في صميم البحث كونفيوسم. هنا، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في كونفيوسم كاستانيم. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية توفر الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة الظواهر، مما يسمح للباحثين لدراسة وظائف الجينات في سياقات متنوعة.

التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق،<em&gt; كونفيوسم كاستانيم</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em&gt; C. ايليجانس</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

الإدارة الفعالة لتداخل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم (RNAi) للبعوض الأنوفيلة الغامبية البالغة

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>استكشاف موارد الفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابات

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: تقييم الفطريات المسببة للأمراض الحشرية في مجموعات Monochamus alternatus البرية لتطبيقات المكافحة الحيوية في حفار خشب الغابات

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

العزلة والتحديد السلوكي وتقييم الإمراضية للفطريات المسببة للأمراض الحشرية من حفار خشب الغابة

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...