Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Vi takker Center for Bioinformatik og Functional Genomics (CBFG) på Miami University for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af Miami University opstart tilskud (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

1. T. castaneum Aktier og dyrkning <ol><li> Beslut dig for en T. castaneum belastning skal bruges til forsøget. BEMÆRK: Flere lab-etablerede T. castaneum stammer er tilgængelige. Ga-1 (Georgien-1) er den parentale stamme af Ga-2, der blev brugt til genomsekvensering 3. Da Ga-1-deler de fleste DNA-polymorfismer (såsom enlige cellekernepolymorfi SNPs) med Ga-2, og er sundere end Ga-2 på grund af mindre indavl, er det ideelt til RNAi eksperimenter. Pu-11 er en anden praktisk belastning at bruge , da dens unikke forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) udtryk i fremtiden fløj primordier giver os mulighed for at skelne mellem den sidste larve stadie fra andre instars (se figur S4 Clark-Hachtel et al. 2013 12). Det er vigtigt at dokumentere, hvilke bille-stammen blev anvendt i forsøget, som genetiske baggrunde tilsyneladende betydeligt affect RNAi Fænotypers 13. </li><li> Forbered T. castaneum kultur mel ved tilsætning af 5% (efter vægt) af præ-sigtet ølgær til mel organisk helhed-hvede (efter blanding, opbevares kulturen mel ved -20 ° C). Alikvot mel kultur (ved stuetemperatur) i 6 ounce plast Drosophila stock flasker (ca. 40 g / flaske). </li><li> Kultur T. castaneum ved 30 ° C med 70% fugtighed. Brug en Fugtkontrolleret inkubator, hvis muligt. Tilføj 30-40 voksne pr kultur flaske (mand: kvinde-forholdet 1: 1) for at starte kulturen. BEMÆRK: Selvom skimmel er sjældent et problem ved 30 ° C, lavere temperaturer (såsom 25 ° C) med 70% fugtighed kan forårsage skimmelvækst i kulturen mel. Sænk fugtighed, hvis dette forekommer. </li><li> Overfør de voksne til en ny kultur flaske hver anden uge i subkultur (se trin 5,2-5,5 til hvordan man isolerer voksne fra kultur mel). BEMÆRK: Det tager omkring tre uger at få det sidste stadie larver. Alternatholdsvis T. castaneum kulturer kan holdes ved en lavere temperatur (20-25 ° C), men med en længere dyrkningsperiode (udviklingsmæssige tid ved 25 ° C er omtrent dobbelt så stor som ved 30 ° C). </li></ol> 2. Udarbejdelse af løsninger og instrumenter til Larver dsRNA Injection <ol><li> Syntetisere dsRNA-molekyler homologe med målgenet ved in vitro transkription. Opbevar ved -80 ° C. Se Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for detaljerede molekylærbiologiske procedurer. Se også diskussionen af ​​en række parametre, som skal tages i betragtning ved udformningen dsRNA molekyler. </li><li> Lav 10 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,6 ved 25 ° C) ved blanding af 8,5 ml 1 M Na-2 HPO 4 med 1,5 ml 1 M NaH 2 PO4. PH kontrolleres med en pH-meter og justeres i overensstemmelse hermed. </li><li> Lav 1 ml 10x injektion buffer ved at blande 10 ul 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,6 ved 25 ° C), 100 _6 L 0,5 M KCI, 100 pi af grøn mad farvestof og 790 pi dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O). Fortynd 10x injektion buffer til at 2x injektion puffer (200 pi 10x injektion buffer + 800 pi dobbeltdestilleret 2 O). Opbevar både 10x og 2x injektion buffere ved 4 ° C indtil brug. </li><li> Forbered Sticky objektglas. <ol><li> Dække en hel glasplade med en form for genanbringelig lim til larvernes injektioner. For voksne eller puppe injektioner, lave to tynde strimler af lim langs de længere kanter af dias. </li><li> Lad limen tørre i flere dage, hvilket sikrer at limen stadig tarvelige nok til at klæbe biller på glasset, mens også resterende smidige nok til at lette deres fjernelse efter injektion. BEMÆRK: Hvis limen bliver for klistret, så brug en finger, og tryk på den lim, hvilket vil reducere klæbrighed. Hver side kan indeholde op til 40 eller 50 biller, og kan genbruges, indtil det ikke sikkert at holde dyrene. Alterntivt kan dobbeltklæbende tape også anvendes, selv om båndet er undertiden ikke klæbende nok til at holde larverne. </li></ol></li><li> Lav en æterisering Basket. <ol><li> Fjern stemplet fra en 10 ml engangssprøjte og skæres sprøjten i halvdelen omkring 6 ml linje. </li><li> Kassér den nederste halvdel af sprøjten. Kort opvarme snitfladen af ​​den øverste del af sprøjten med en gasbrænder, og hurtigt skubbe smeltet plast på et stykke nylonnet at lime masken på sprøjten. Klippes overskydende maske Når plasten hærder. </li></ol></li><li> Forbered ether flaske. Tilsæt 30 ml ether i en smal mund 100 eller 250 ml glasflaske. Tilføj flere stykker silkepapir for at forbedre fordampningen af ​​ether. BEMÆRK: Ether præsenterer en brandfare, og er også skadeligt. Behandl altid æter under en emhætte. Luk låget stramt mens der ikke er i brug. BEMÆRK: Is kan anvendes som et sikrere alternativ (som i et klasseværelse indstilling), selvom sedation er mindre effektiv. </li></ol> 3. Fremstilling af Larve injektionsapparatet <ol><li> Placer en XY mekanisk etape på en dissektionsmikroskop. BEMÆRK: XY mekaniske etaper er tilgængelige fra de store mikroskop selskaber. Alternativt kan billige mikroskop etaper også bruges til de fleste Dissecting mikroskoper med visse ændringer (se Materialer tabellen for eksempel). </li><li> Placer en mekanisk nål manipulator nær XY mekaniske fase. </li><li> Saml en injektionssprøjte. Brug en fire-vejs stophane (med Luer-forbindelser) til at tilslutte en 30 ml engangssprøjte til et glas nålholder, så manipulation af injektionssprøjten uden at påvirke trykket i kanylen (se Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for det detaljerede injektionssprøjte samling). </li></ol> 4. Pulling kanyler <ol><li> Træk borsilicatglashulsfærer nåle (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm længde) med ennål aftrækker. BEMÆRK: Sutter P-87 eller P-97, skal du bruge indstillingen &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90&quot; eller følg kapitel 2 i pipetten Cookbook: Tilhænger Cell, C. elegans, Drosophila, og zebrafisk - Anbefalede programmer. De optimale indstillinger varierer afhængigt af modellen af ​​nålen aftrækker. Indstillingen for en generisk Drosophila kanyle er et godt udgangspunkt. </li><li> Opbevares trak nåle i en plastik sag (fx en plastik cd-omslag) og fastgør med aftagelig montage kit. </li></ol> 5. Isolering og Udvælgelse af larver <ol><li> Placer en # 25 sigte på en si-modtager. </li><li> Anbring indholdet i kulturen flaske (biller og kultur mel) på sigte og støvtætte indholdet straks. Efterlad ikke indholdet på sigten uden sigtning, da larverne hurtigt vil forsøge at grave sig ned gennem sigten og går i stå. Aggressivt finkæmme indholdet at lade melet faldeigennem og forlader ældre larver (typisk 6 og 7. stadiums larver), pupper og voksne (sammen med deres aflagte neglebånd, exuviae) bag på toppen af si. </li><li> Overfør de resterende i sien (biller og exuviae) for at frøet pan materialer. Hold trykke på panden for at forhindre biller i at undslippe. </li><li> Fjern exuviae og mel partikler tilbage på overfladen af ​​biller ved forsigtigt at blæse over frø pan. </li><li> Tryk på frø pan at flytte indholdet til bunden af ​​gryden. Så, lad gryden uudnyttet i flere sekunder. Vent for de voksne, som er mere mobile end andre faser, til at komme ud fra bunken. Fjern voksne ved anvendelse af en art pensel (fx 1 cm bredde). </li><li> Separat pupper ved forsigtigt at banke frø pan samtidig holde mundingen af ​​panden lidt nedad, som pupper tendens til at rulle hurtigere mod mundingen. Brug en pensel til at fjerne pupper, så kun larverne på seed panden. </li><li> Place isoleret larver i en ren petriskål. Vælg et passende tidspunkt af larver til injektion og placere dem i en separat petriskål. BEMÆRK: Tidligt sidste stadie larver (1-2 dag efter den sidste larve fældningen) er ofte egnede, når man analyserer RNAi effekt på voksne morfologier samt metamorfose. Det er dog nogle gange nødvendigt at udføre RNAi på den næstsidste (eller endnu tidligere) tidspunkt at evaluere tidlige gen-funktion (fx figur 3E-3H. Se også Clark-Hachtel et al. 2013 12). Brug pupper som en størrelse reference til identificere stadiums larver. Det sidste stadie larver er lidt længere end pupper. Alternativt kan pu-11 anvendes til at identificere den sidste stadiums larver samt bestemme tidsforløbet for udviklingen af sidste stadiums larver (figur S4 Clark-Hachtel et al. 2013 12). </li><li> Lad den valgte larver i en petriskål indtil æterisering. Anbring restenaf larver og andre etaper af biller (såsom pupper og voksne) tilbage i en kultur flaske med mel og returnere det til inkubatoren. </li></ol> 6. Fremstilling af kanyler <ol><li> Placer en tidligere trukket glas nål på et objektglas ved hjælp af enten klæbrig tack eller dobbeltklæbende tape. Ved hjælp af pincet, teste trak ende af nålen, mens du kigger gennem dissektionsmikroskop at se, hvor spidsen bøjninger. Grab området lidt mod spidsen side af, hvor nålen bøjer med pincet og drej for at bryde. </li><li> Holde gode nåle og kassér andre. Overvej en god nål som har en åbning, der er hverken for stor eller for lille (ca. 0,05 mm i diameter. Figur 1A og 1B), og er vinklet til at gøre penetration af larvestadiet neglebånd lettere (figur 1B og 2A-2B). Overvej en dårlig nål som (i) for lille, hvilket gør optagelse af dsRNA løsning i nålen vanskecult (trin 7) (figur 1D og 2D), (ii), for stor, hvilket larvernes skade og eventuel letalitet efter injektion (figur 1C og 2F), (iii) stump, hvilket gør gennemtrængning af kutikula vanskelig og stigende skade. </li><li> Stik nålen ind nåleholderen. <ol><li> Først skru spidsen af ​​nålen og placer den bagerste ende af kanylen ind i holderen drikkepenge. Derefter placere gummipakning under holderens spids (mindst 1 cm fra den bagerste ende af glasset nål). </li><li> Sæt bagsiden af ​​nålen ind i holderen, med gummipakningen helt ind i åbningen af ​​nåleholderen. Skru spidsen tilbage i holderen. </li></ol></li><li> Placer de samlede nåleholder på nålen manipulator. Hold nåleholderen tæt på vandret. Justér manipulatoren, så spidsen af ​​nålen er placeret i centrum af den opfattelse, når man ser gennem MICRoscope. </li></ol> 7. Forhåndsudsendelse dsRNA opløsning ind i Needle <ol><li> Forbered dsRNA injektionsopløsning lige før injektion ved at justere koncentrationen med Hedeselskabet 2 O og blande dsRNA opløsningen med lige volumener af 2x injektion puffer (trin 2.3). Hold den blandede opløsning på is. Se diskussion om dsRNA koncentration. </li><li> Skær spidsen af ​​en 20 ul éngangspipettespids. Afpipetteres 10 ul af opløsningen i den trimmede pipettespidsen. Fjern forsigtigt pipettespidsen fra pipetten samtidig holde væsken på spidsen ved at give modtryk. Alternativt fjern forsigtigt spidsen og derefter flytte løsningen på enden af ​​spidsen ved at give tryk ved hjælp af en finger. </li><li> Anbring pipettespidsen med dsRNA løsning på mikroskopbordet hjælp klæbrig tack med åbningen vendt mod spidsen af ​​nålen. </li><li> Ser gennem mikroskopet, flyt langsomt indlæst spids mod nålen, indtil spidsen afnålen er lige inden den indlæste pipettespidsen og i opløsningen. </li><li> Mens du ser gennem mikroskopet, forsigtigt trække sig tilbage på stemplet i injektionssprøjten til langsomt at trække dsRNA&#39;et opløsningen i nålen. BEMÆRK: Du må ikke overbelaste nålen. Da udgangen af ​​dsRNA opløsningen nærmer sig spidsen af ​​nålen, nedsætte hastigheden for at trække og stoppe indlæsning af opløsningen, før spidsen af ​​nålen ville nå luft. Hvis luft når spidsen, vil opløsningen hurtigt trukket ind i nåleholderen, hvilket resulterer i alvorlige problemer forurening. Detaljerede rengøring procedurer nåleholderen er beskrevet i Philip og Tomoyasu 2011 11 personer. </li><li> Fjern trykket fra injektionssprøjten og nålholderen ved at åbne hanen. Derefter flyttes pipettespidsen væk fra spidsen af ​​nålen. Hæv nålen op fra scenen for at undgå utilsigtet at beskadige nålen mens placere larverne på scenen. Fjern den tømte pipettespidsen fra scenen. </li></ol&gt; 8. dsRNA Injektion <ol><li> Placer larver i æterisering kurven. Brug mindre end 10 larver hvis lære teknikken. Brug 30-40 larver i en runde en gang komfortabel med teknikken. </li><li> Anbring kurven med larver i æteren flaske og luk låget. BEMÆRK: Ether præsenterer en brandfare, og er også skadeligt. Udfør dette trin under en emhætte. </li><li> Etherize larver til omkring 3 min. Kontroller larver bevægelse efter 3 min. Læg dem tilbage i æteren flaske til en anden 30 sek, hvis de stadig er i bevægelse. Må ikke etherize for mere end 5 min, da dette kan øge dødeligheden. BEMÆRK: Den optimale æterisering kan variere, afhængigt af temperatur og luftfugtighed. </li><li> Overfør æteriseret larver fra kurven til non-stick kanten af ​​et glas klæbrig dias. Brug pincet og mens du kigger gennem mikroskopet, afhente hver larver én efter én og placere dem på diaset. Læg dem på tværs og forsigtigt trykke ned deres kroppe from hoved til hale med pincet, let strække dem som du går, for at sikre, at de er fastgjort på diaset. </li><li> Placer klæbrig objektglas med larver på objektbordet. </li><li> Sæt dsRNA&#39;et indlæst nål forsigtigt ind i dorsalsiden af ​​larverne at undgå at beskadige centralnervesystemet. Også undgå ryg midterlinjen som larve hjerte er placeret her. I denne og de efterfølgende trin, skal du altid bruge scenen til at flytte larverne til nålen (i stedet for at bruge nålen manipulator at flytte nålen). BEMÆRK: Den specifikke injektionssted ligegyldigt som RNAi i T. castaneum synes at være systemisk. Det er dog som regel lettest at injicere i den dorsale side af thorax eller abdominal segmenter. </li><li> Efter indsættelse nålen ind i larverne, træk nålen lidt tilbage for at give plads til dsRNA&#39;et at indtaste larvernes kroppen hulrum. </li><li> Skub forsigtigt på injektionssprøjten, indtil larverne turn grøn (eller farven på injektionsstedet buffer) og se stretched og fuld. BEMÆRK: Hvis lære teknikken, så prøv at injicere så meget som muligt at bestemme mængden af ​​løsning, der kan injiceres i en larve uden væsentlig dødelighed. Det er generelt omkring 0,5-0,7 ul. </li><li> Fjern nålen fra larverne. Mens fjerne kanylen, let trække sig tilbage på sprøjten injektion for at undgå dsRNA&#39;et tab (også passe på ikke at trække i luft). </li><li> Injicere al larver på diaset. Sørg for at fjerne larver, der ikke var held injiceres. Komplet injektion før larver vågner (omkring 10 minutter). </li><li> Fjern dias med injiceret larver fra injektionen mikroskop og lade dias for 5 flere minutter, indtil alle larver komme fra æterisering. </li><li> Med pincet og under et dissektionsmikroskop, forsigtigt løfte larverne fra hoved til hale at frigøre dem fra den klæbrige dias. Placer nyligt udgivet larver i en ren petriskål. Lad larver på petriskålen i 10-15 minutter for at tillade injektion wound til at størkne. </li><li> Placer larver i en ny flaske med rent mel og etiket passende herunder stamme-navn, typen af ​​dsRNA injiceret koncentration af dsRNA antal larver injiceret, og datoen. </li><li> Kultur den injicerede larver ved 30 ° C med 70% fugtighed. Overhold larverne for RNAi fænotyper regelmæssigt. BEMÆRK: Det sidste stadie larver forpupper sig inden for 7 dage. Derefter vil pupper Eclose til voksne efter 7 dage (hvis der ikke er noget unormalt i timingen forårsaget af RNAi). </li></ol> 9. Bekræftelse af Knockdown og fænotypiske analyser <ol><li> Overvej vurdere effektiviteten af ​​RNAi vælte af forskellige molekylærbiologiske teknikker, såsom kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) og Western blotting. Se Miller et al. 2012 7 personer og Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for detaljeret qPCR og Western Blot-protokollen, hhv. </li><li> Analyser RNAi relaterede fænotyper. BEMÆRK: RNAi relateretfænotyper kan observeres på flere forskellige stadier og under forskellige dyrkningsbetingelser, afhængigt af de gener, der er målrettet mod. RNAi kan påvirke billen morfologi, metamorfose, fysiologi og adfærd. Hvor ofte tilstedeværelsen af ​​fænotype kontrolleres, og på hvilke betingelser biller opdrættes bør være skræddersyet til de specifikke spørgsmål, som undersøges gennem RNAi. </li></ol>

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

<html> Der er en række vigtige spørgsmål, der skal tages i betragtning for at sikre succes for RNAi, herunder længden og koncentrationen af ​​de dsRNA molekyler, konkurrence mellem forskellige dsRNA-molekyler (når de forsøger flere banke ned), og muligheden for ikke-tilsigtede effekter (OTE). dsRNA Længde Længden af dsRNA molekyler påvirker effektiviteten af den systemiske RNAi reaktion med et længere dsRNA er mere effektive til at udløse RNAi 7,14,15 (selvom længere grænse for dsRNA er i øjeblikket ukendt). DsRNA længde skal være længere end 50 bp til at inducere effektiv RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellem 150 bp og 500 bp synes at være ideelt for RNAi eksperimenter. Selvom der også kan anvendes længere dsRNA molekyler, vil de have en øget chance for OTE og gen-kloning trin bliver stadig vanskeligere. dsRNA Koncentration ve_content &quot;&gt; Forskellige grader af gen knockdown kan opnås afhængigt af koncentrationen af ​​dsRNA. 1 pg / pl synes at være en rimelig startkoncentration, som ofte frembringer en nær-nul fænotype (kan variere afhængigt af genet (generne) af interesse ). RNAi kan udføres med en højere koncentration (fx 7-8 pg / pl) for at opnå en stærkere RNAi fænotype. RNAi med en seriel fortynding af dsRNA kan undertiden være fordelagtigt at producere en række hypomorphic fænotyper (Supplemental Information Tomoyasu et al. 2009 8, og Borràs-Castells upublicerede data). RNAi Konkurrence Multiple gen knockdown kan opnås i T. castaneum ved at injicere flere forskellige dsRNA molekyler samtidigt. Imidlertid er det også kendt at have flere forskellige dsRNA-molekyler til stede i organismen ofte resulterer i konkurrence mellem dsRNAs for adgang til RNAi komponenter <sop&gt; 7,14. Det er vigtigt at bruge den samme længde, og den samme koncentration for alle dsRNA&#39;et når de forsøger flere gen knockdown at undgå en dsRNA&#39;et udkonkurrerer de andre (selv om, kan der kræves yderligere justeringer af dsRNA&#39;et længde og koncentration, når ekspressionsniveauerne meget forskellig blandt målgenerne). Vi, såvel som andre, med succes har udført dobbelt og tredobbelt knockdown (f.eks Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, og Yang et al. 2009 18). Selv om det er muligt, firedobbelt RNAi (eller flere) kan være udfordrende, da det sandsynligvis vil medføre en betydelig reduktion af RNAi effektivitet for alle fire målgener. Off-målretning OTE er en iboende bekymring for RNAi-baserede tilgange. En måde at minimere OTE at identificere regioner i målgenet, der deler lignende sekvenser med andre gener og undgå disse regioner ved udformningen dsRNA. En simpel BLAST analyse mod T. castaneum forudsagt gen sæt kan identificere sådanne regioner. Flere online værktøjer giver også evaluering af potentielle OTE (fx e-RNAi 19). Udførelse RNAi til to ikke-overlappende regioner af målgenet er en nem og effektiv måde at fjerne muligheden for, at observerede fænotyper er forårsaget af OTE. Muligheden for OTE minimeres, hvis RNAi til to ikke-overlappende regioner producere de samme fænotyper (medmindre de to ikke-overlappende regioner deler en lignende sekvens). Evaluering gen knockdown af andre end fænotypiske analyser midler er ofte kritisk for effektivt stede RNAi-relaterede data. To store måder at evaluere gen knockdown er QRT-PCR og Western blot-analyse. QRT-PCR er en bekvem måde at måle niveauet af mål-mRNA, og er blevet anvendt i mange RNAi-relaterede undersøgelser, herunder dem i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howevis, skal der udvises forsigtighed, da vi for nylig har set nogle tilfælde, hvor mål-mRNA-niveau er opreguleret af RNAi (selvom det protein produkt er nedreguleret) (Borràs-Castells upublicerede data). Det er i øjeblikket uvist, om dette RNAi inducerede mRNA opregulering kan være udbredt eller unikke for bestemte gener. Western blot-analyse er en anden måde at bekræfte gen knockdown. Denne fremgangsmåde er helt pålidelig som den måler størrelsen af ​​det endelige protein-produkt. Kravet om et specifikt antistof mod proteinet produkt af målgenet er en ulempe ved denne fremgangsmåde. Ved hjælp af flere uafhængige målinger foruden fænotypeanalyse vil øge tilliden hos de fænotypiske data opnået ved RNAi-baseret analyse. Siden sin undfangelse i T. castaneum, RNAi er primært blevet brugt til at studere genfunktion i udvikling og mønster-dannelse. Disse T. castaneum udviklingsmæssige undersøgelser har været en stor succes i karakterizing evolutionært bevaret og afveg funktioner af gener (revideret i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserede studier i T. castaneum er ikke begrænset til udviklingsmæssige biologi. For eksempel kan RNAi anvendes til at undersøge genfunktion i en lang række fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, herunder stress tolerance, rovdyr, aggression, valg af mage, aktivitetsmønstre og forsvarsmekanismer. Et vanskeligt at anvende RNAi til disse sammenhænge er sandsynligheden for, pleiotropiske effekter. Ofte vil gener af interesse har en række roller hele T. castaneum livscyklus, hvilket gør fjernelse af gener uden utilsigtede fænotypiske virkninger vanskelig. Imidlertid kan evnen til nemt at udføre RNAi på forskellige stadier ofte være en effektiv strategi til at undgå disse pleiotrope virkninger. For eksempel kan udføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillade os at omgå util-tendens dødelighed forårsaget af gen knockdown under tidlig udvikling. Fleksibiliteten af RNAi respons T. castaneum således gør denne model til et attraktivt valg for at tilpasse RNAi til eksperimenter af genfunktion i fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner. T. castaneum system er også ideel til brug i en undervisningssituation laboratorium. T. castaneum kan let dyrkes på et mel / gær blandingen ved stuetemperatur (25 ° C) uden hyppige subkultur og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til at blive tilpasset til et laboratorium med unge, læring forskere. Da RNAi er ved at blive en vigtig teknik i en række biologiske områder, er det afgørende, at de studerende er udsat for denne teknik. Den ligetil karakter larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum opfordrer også flere studerende til at blive involveret i forskning, hvilket gør T. castaneum en oplagt kandidat til et klasseværelse orienteret genetisk system. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Den røde mel bille, Tribolium castaneum, er stigende popularitet i forskellige områder af biologi dels på grund af den lethed udføre RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserede gen knockdown teknikker gør det muligt for forskerne at udføre tab af funktion analyser uden anvendelse af komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, hvilket gør det muligt at udføre RNAi på noget tidspunkt gennem simpel indsprøjtning af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ind billen kropskavitet 4-6. Samtidig knockdown af multiple gener er også muligt i T. castaneum ved at injicere to eller flere forskellige dsRNA-molekyler samtidigt 7,8. Derudover kan en række hypomorphic fænotyper genereres ved at reducere koncentrationen af injiceret dsRNA 8. Disse funktioner gør RNAi-baserede reverse genetiske teknikker attraktive alternativer til traditionelle fremadrettede genetik i T. castaneum. Da næstenalle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulære dsRNA molekyler 9, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge en lang række væv i forskellige sammenhænge. Hertil kommer, at selv om denne betænkning fokuserer på at udføre RNAi i T. castaneum, mange her beskrevne procedurer finder anvendelse på andre insekter. Derfor er denne protokol er nyttig for dem, der ønsker at udføre tab af funktion analyser i deres kontekst af interesse i T. castaneum, samt for forskere, der ønsker at anvende en RNAi-baseret teknik til andre insekter. Injektion dsRNA til larver, tillader funktionel analyse på en række bille livsstadier, herunder larve, puppe og voksne stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapporteret vores overordnede larve RNAi forsøgsprotokol inklusive molekylærbiologiske procedurer 11. I den aktuelle rapport, fokuserer vi på at beskrive de injektionsprocedurer dsRNA, der er bedst forklares med visuelle hjælpere. Vi levererdetaljerede trin-for-trin injektion procedurer samt gode og dårlige injektion eksempler. Denne visuelle protokol supplerer vores tidligere protokol, og når de kombineres, giver de en mere omfattende visning af larvernes RNAi procedurer i T. castaneum. Derudover diskuterer vi parametre for dsRNA molekyler, der kan påvirke succes RNAi, anvendelsen af ​​RNAi-baserede analyser for fysiologisk forskning, samt anvendeligheden af ​​larvestadiet RNAi-protokollen i en undervisningssituation laboratorium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Den røde mel bille, Tribolium castaneum tilbyder et repertoire af eksperimentelle værktøjer til genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser, herunder en fuldt kommenteret genom sekvens, transposon-baserede transgenese og effektiv RNA-interferens (RNAi). Blandt disse fordele, RNAi-baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi reaktion, hvilket gør det muligt at udføre RNAi enhver livsfase ved blot at injicere dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i bille kropskavitet. I denne rapport giver vi en oversigt over vores larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering af den korrekte fase af T. castaneum larver til injektion, (ii) forberedelse for indstillingen injektion, og (iii) dsRNA injektion. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver os hurtig adgang til tab af funktion phenotypes, herunder flere gen knockdown fænotyper samt en række hypomorphic fænotyper. Da næsten alle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulært dsRNA larvestadiet RNAi teknik gør det muligt for forskerne at studere en lang række væv i forskellige sammenhænge, ​​herunder genetiske grundlag for organismal svar på det udendørs miljø. Desuden enkelhed denne teknik stimulerer mere studerendes engagement i forskning, hvilket gør T. castaneum en ideel genetisk system til brug i et klasseværelse indstilling.

Et af de vigtigste skridt for en vellykket injektion er at gøre en god nål. Som beskrevet i trin 6, spidsen af nålen skal brydes inden injektion T. castaneum. Eksempler på gode og dårlige nåle er vist i figur 1. En god nål har en skarp og stiv spids, med en cirka 0,05 mm i diameter (Figur 1B). Figur 2 viser en succesfuld injektion (figur 2A og 2B) samt flere tilfælde af mislykkede injektioner (figur 2C-2F). Med en passende størrelse kanyle nålespidsen trænger larvestadiet kutikula med minimal modstand (figur 2A), og dsRNA opløsning (grøn) strømmer ind i larver uden nogen lækage (figur 2B). Må ikke over-Inject, da det vil medføre overløb af dsRNA&#39;et løsning, selv med en korrekt størrelse kanyle (Figur2C). Hvis spidsen af nålen er for tyndt, nålespidsen ofte ikke at trænge ind i larvernes kutikula og bøjninger, hvilket gør det vanskeligt injektion (figur 2D). Hvis dette sker, trimning nålespidsen undertiden hjælper. Større nåle er ofte stadig brugbar, end med nogle vanskeligheder i at trænge ind i larvernes neglebånd (Figur 2E). Imidlertid er en stor mængde af dsRNA opløsningen nemt skubbes ud fra nålen, selv med et let tryk på injektionssprøjten, hvilket ofte resulterer i en overflod af dsRNA opløsning (figur 2F). Ved udførelse af RNAi, er det vigtigt at have en positiv kontrol for at vurdere, at RNAi fungerer korrekt, og en negativ kontrol for at verificere, at observerede effekt ikke er et ikke-specifik effekt af dsRNA eller en konsekvens af injektion procedurer (såsom skade forårsaget ved injektion, eller abnormitet fra æterisering). Injektion af dsRNA målretning EYFP kan tjene som engod positiv kontrol, når du bruger pu-11 stammen 5,7. Når EYFP dsRNA indsprøjtes i den sidste larvestadiet, kan der observeres en signifikant reduktion i EYFP signal i de fremtidige fløj primordier så tidligt som én dag efter injektion (figur 3A). Den knockdown af EYFP er fuldstændig to dage efter injektion af EYFP dsRNA (figur 3B), og denne knockdown fortsætter gennem puppestadiet (figur 3C og 3D), og gennem hele livet af billen hvis dsRNA&#39;et koncentrationen er høj nok (såsom 1 pg / pl) 7. EYFP dsRNA kan også anvendes som en negativ kontrol, da det er en ikke-endogen gensekvens og skulle ikke forårsage morfologiske og fysiologiske forstyrrelser (figur 3A-3D). Vi forudsat billeder af larvernes RNAi for vestigial (VG), en kritisk fløj gen 12, som et andet eksempel på, hvordan effektiv denne injektion-baserede RNAi teknik er i T. castaneum. Når dsRNA til vg injiceres i næstsidste stadie larver (ét trin før den sidste larvestadiet), kan der observeres et fuldstændigt tab af vingen strukturer i puppestadiet (figur 3E og 3F). Den resulterende voksne også helt mangler fløj strukturer (figur 3G og 3H). RNAI- resultat for vg eksemplificerer både robusthed og systemiske karakter RNAi i T. castaneum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: (A) Eksempler på ubrudte, gode og dårlige nåle (B) Spidsen af et godt brudt god nål (C) spidsen af en knækket kanyle, der er for stor og sløv (D) Spidsen... af et brød<html> n nål, der er for tyndt. Skalapanelerne (rød) er 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:... (A) en korrekt størrelse kanyle indsat i det sidste stadium larve (B) Larver passende injiceret med grønne dsRNA opløsning (C) Overflow dsRNA opløsning ved injektionsstedet, forårsaget af over-injektion (D ) En tynd nål ikke at trænge ind i larvernes kutikula. (E) en stor kanyle indsat i det sidste stadium larve. (F) Larver injiceret med en stor nål, hvilket resulterer i overløb og lækage af dsRNA opløsning. Pile angiver nåle.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Eksempler på succesfulde RNAi i T. castaneum. (AD) Sidste larve injektion af EYFP dsRNA resulterer i en reduktion af EYFP ekspression. (A) Larver én dag efter injektionen. (B) Larver to dage efter injektion. (C) Kontrol pupper. (D) Pupper følger larvestadiet EYFP dsRNA injektion. De negative kontroller puffer injektion (A, B) og dsRed dsRNA injektion (C, D). Pilespidser og pile indikerer EYFP udtryk eller mangel på samme i den fløj primordier og øjne, hhv. (EH) Penultimative larvestadiet RNAi til vg. (E) Vild-typen puppe. (F) vg RNAi puppe. Den manglende fløj strukturer er allerede synlige på puppestadiet (pil). G) Vild-typen voksen. (H) vg RNAi voksen. Wing relaterede strukturer mangler helt (pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA-interferens (RNAi) -baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. Her giver vi et overblik over vores larvestadiet RNAi teknik Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver hurtig adgang til tab af funktion fænotyper, som giver forskerne at studere genfunktioner i forskellige sammenhænge.

Larve RNA-interferens i Den Røde rismelbille,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transskription og lukning af Gaussia luciferase-mRNA Efterfulgt af HeLa Celletransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Brug af RNA-medieret Interferens fodringsstrategien at screene for gener involveret i Body Size forordning i Nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Måling af Larve aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetsovervågning

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Praktisk brug af RNA-interferens: Oral levering af dobbelt-strenget RNA i Liposom bærere af kakerlakker

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Celle-Type-specifikke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Kerneisolering fra voksen musenyre til RNA-sekventering med en kerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektiv oral RNA interferens (RNAi) administration til voksne anopheles gambiae myg

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Anvendelse af RNA-interferens i Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Udforskning af entomopatogene svamperessourcer fra skovtræborere

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Forfatter Spotlight: Evaluering af entomopatogene svampe i vilde Monochamus alternatus-populationer til biokontrolapplikationer i skovtræborere

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Isolering, adfærdsidentifikation og patogenicitetsvurdering af entomopatogene svampe fra en skovtræborer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...