Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
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Wir danken dem Zentrum für Bioinformatik und Funktionelle Genomik (CBFG) an der Miami University für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Miami University Gründungszuschuss (YT) und der National Science Foundation (: IOS 0.950.964 YT) unterstützt.

1. T. castaneum Aktien und Anzucht <ol><li> Entscheiden Sie sich für eines T. castaneum Stamm für das Experiment zu verwenden. HINWEIS: Mehrere Labor etablierten T. castaneum Stämme sind verfügbar. Ga-1 (Georgia-1) ist der elterliche Stamm von Ga-2, die für die Genomsequenzierung 3 verwendet wurde. Da Ga-1 teilt die meisten DNA-Polymorphismen (wie Single-Nukleotid-Polymorphismen, SNPs) mit Ga-2 und ist gesünder als Ga-2 durch weniger Inzucht, ist es ideal für RNAi-Experimente. Pu-11 ist eine weitere Belastung bequem zu bedienen , als seine einzigartige verbesserte gelb fluoreszierende Protein (EYFP) Ausdruck in der Zukunft Flügel Primordia erlaubt uns, die letzten Larvenstadium von anderen Stadien zu unterscheiden (siehe Abbildung S4 der Clark-Hachtel et al. 2013 12). Es ist wichtig zu dokumentieren, welche Käfer-Stamm in dem Experiment verwendet wurde, wie genetischen Hintergründen erscheinen deutlich affect die RNAi Phänotypen 13. </li><li> Bereiten T. castaneum Kultur Mehl durch Zugabe von 5% (nach Gewicht) von Pre-gesiebt Bierhefe zu Bio-Vollkornmehl (nach dem Mischen, speichern Sie die Kultur Mehl bei -20 ° C). Aliquot der Kultur Mehl (bei ​​Raumtemperatur) in 6 Unzen Kunststoff Drosophila Vorratsflaschen (ca. 40 g / Flasche). </li><li> Kultur T. castaneum bei 30 ° C mit 70% Feuchtigkeit. Verwenden Sie eine feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator, wenn möglich. Fügen 30-40 Erwachsene pro Kulturflasche (männlich: weiblich Verhältnis 1: 1), um die Kultur zu starten. HINWEIS: Obwohl Form ist selten ein Problem bei 30 ° C niedrigere Temperaturen (wie 25 ° C) mit 70% Luftfeuchtigkeit kann Schimmelpilzwachstum in der Kultur Mehl verursachen. Senken Sie die Luftfeuchtigkeit, wenn dies geschieht. </li><li> Übertragen Sie die Erwachsenen zu einer neuen Kulturflasche alle zwei Wochen zur Subkultivierung (siehe Schritt 5,2-5,5 damit wie Erwachsene aus Kultur Mehl zu isolieren). HINWEIS: Es dauert etwa drei Wochen, um die letzten Larvenstadium zu erhalten. Alternathungsweise, T. castaneum Kulturen bei einer niedrigeren Temperatur (20-25 ° C) mit einer längeren Kultivierung Zeitraum aufbewahrt werden, wenn auch (Entwicklungszeit bei 25 ° C etwa doppelt so bei 30 ° C). </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Instrumente zum Larven dsRNA Injektion <ol><li> Synthese von dsRNA-Moleküle homolog zu der Ziel-Gens durch in vitro-Transkription. Bei -80 ° C. Siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte molekularbiologische Verfahren. Siehe auch Diskussion für eine Anzahl von Parametern, die berücksichtigt werden müssen bei der Entwicklung dsRNA-Moleküle. </li><li> Machen 10 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C) durch Mischen von 8,5 ml 1 M Na 2 HPO 4 mit 1,5 ml 1 M NaH 2 PO 4. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter und entsprechend anpassen. </li><li> Auffüllen auf 1 ml 10x Injektionspuffer durch Mischen von 10 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,6 bei 25 ° C), 100 _6; l 0,5 M KCl, 100 ul grüne Lebensmittelfarbe, und 790 ul doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Verdünnen Sie die 10x Injektionspuffer auf 2x Injektionspuffer (200 ul 10x Injektionspuffer + 800 ul ddH 2 O) zu machen. Lagern, 10x und 2x Injektionspuffer bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sticky Glasobjektträger. <ol><li> Decken eine ganze Glasträger mit einer Form von Haftkleber für Larven Injektionen. Für Erwachsene oder Puppen Injektionen, machen zwei dünne Streifen von Kleber entlang den längeren Kanten der Folie. </li><li> Der Kleber für mehrere Tage, was sicherstellt, dass der Kleber klebrig bleibt genug Käfer zu der Folie haften zu trocknen, aber auch biegsam genug ist, um deren Entfernung nach der Injektion erleichtern bleibt. HINWEIS: Wenn der Kleber bleibt zu klebrig, mit einem Finger, und tippen Sie auf den Leim, die die Klebrigkeit verringern. Jede Folie kann bis zu 40 oder 50 Käfer zu halten, und kann wiederverwendet werden, bis es nicht sicher zu halten, die Tiere. Alterntiv kann doppelseitiges Klebeband verwendet werden, wobei das Band manchmal nicht genug, um die Larven zu halten Klebstoff. </li></ol></li><li> Machen Sie ein etherization Korb. <ol><li> Entfernen Sie den Kolben aus einer 10 ml Einwegspritze, und schneiden Sie die Spritze in die Hälfte der ganzen Linie 6 ml. </li><li> Entsorgen Sie die untere Hälfte der Spritze. Kurz erhitzen die Schnittfläche des oberen Teils der Spritze, die mit einem Gasbrenner, und schnell schieben der geschmolzene Kunststoff auf einem Stück Nylonnetz, das Netz auf die Spritze zu kleben. Schneiden Sie den über Mesh, sobald der Kunststoff aushärtet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Äther-Flasche. 30 ml Äther in einen schmalen Mund-100 oder 250 ml Glasflasche. Fügen mehrere Stücke von Tissue-Papier, um die Verdampfung des Ethers zu verbessern. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Immer Äther behandeln unter einer Abzugshaube. Schließen Sie den Deckel fest, während nicht in Gebrauch ist. HINWEIS: Ice kann als sicherere Alternative (wie in einem Klassenzimmer) verwendet werden, obwohl die sedation ist weniger effektiv. </li></ol> 3. Herstellung von Larven Pritzvorrichtung <ol><li> Ein XY-Kreuztisch auf einem Binokular. HINWEIS: XY Kreuztische sind über führende Unternehmen Mikroskop. Alternativ können kostengünstig Mikroskoptische auch für die meisten Sezieren Mikroskope mit einigen Modifikationen verwendet werden (siehe Tabelle Werkstoffe zum Beispiel). </li><li> Legen Sie eine mechanische Nadel Manipulator in der Nähe der XY-Kreuztisch. </li><li> Montieren Sie eine Injektionsspritze. Verwendung einer Vierwegehahn (mit Luer-Verbindungen), um eine 30 ml Einwegspritze auf eine Glasnadelhalter zu verbinden, so dass Manipulation der Injektionsspritze, ohne den Druck in der Injektionsnadel (siehe Philip und Tomoyasu 2011 11 für die detaillierte Injektionsspritze Montage). </li></ol> 4. Ziehen Injektionsnadeln <ol><li> Ziehen Borosilikatglas Nadeln (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm Länge), die durch einNadelmagnet. HINWEIS: Sutter P-87 oder P-97, verwenden Sie die Einstellung &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90&quot; oder folgen Sie Kapitel 2 der Pipette Cookbook: adhärenten Zell, C. elegans, Drosophila, Zebrafisch und - Empfohlene Programme. Die optimalen Einstellungen variieren je nach Modell von der Nadel abziehen. Die Einstellung für eine generische Drosophila Injektionsnadel ist ein guter Ausgangspunkt. </li><li> Shop gezogen Nadeln in einem Kunststoffgehäuse (zB ein Kunststoff CD-Hülle) und mit abnehmbaren Montage Kitt. </li></ol> 5. Isolierung und Selektion von Larven <ol><li> Legen Sie ein # 25-Sieb auf ein Sieb Empfänger. </li><li> Legen Sie die Inhalte der Kulturflasche (Käfer und Kultur Mehl) auf dem Sieb und sichten den Inhalt sofort. Die Inhalte auf dem Sieb ohne Sichtung Lassen Sie nicht, wie Larven werden schnell versuchen, durch das Sieb zu graben und nicht weiterkommen. Aggressiv zu sichten den Inhalt in das Mehl fallen lassendurch und lassen ältere Larven (in der Regel 6 und 7. Larvenstadium), Puppen und Erwachsene (zusammen mit ihren abgelegten Nagelhaut, exuviae) hinter auf dem Sieb. </li><li> Übertragen Sie die auf dem Sieb verbleibenden (Käfer und exuviae) auf den Samen Pfanne Materialien. Klopfen Sie die Pfanne, um die Käfer an der Flucht zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die exuviae und die Mehlpartikel auf der Oberfläche verbleibenden der Käfer durch sanft weht über dem Samen Pfanne. </li><li> Tippen Sie auf das Saatgut Pfanne, um den Inhalt auf den Boden der Pfanne zu bewegen. Dann lassen Sie die Pfanne ungenutztes für einige Sekunden. Warten Sie, bis die Erwachsenen, die mobiler als andere Stufen sind, um aus dem Stapel heraus. Erwachsene zu entfernen, indem ein Kunst Pinsel (beispielsweise 1 cm Breite). </li><li> Separate Puppen durch leichtes Klopfen den Samen Pfanne, während die Mündung der Pfanne leicht nach unten, als Puppen sind in der Regel schneller zum Mund rollen. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Puppen zu entfernen, so dass nur die Larven auf dem Saatgut Pfanne. </li><li> PlAce den Larven isoliert in einem sauberen Petrischale. Wählen Sie einen geeigneten Stadium der Larven für die Injektion und legen Sie sie in einem separaten Petrischale. HINWEIS: Anfang letzten Larvenstadium (1-2 Tage nach der letzten Häutung der Larven) sind oft geeignet, wenn die Analyse der RNAi-Effekt auf die Erwachsenen Morphologien sowie Metamorphose. Es ist jedoch manchmal notwendig, RNAi bei der vorletzten zuführen (oder früher) Stufe zur frühen Gen-Funktion zu bewerten (beispielsweise, 3E-3H. Siehe auch Clark-Hachtel et al. 2013 12). Verwenden Puppen als Referenzgröße, um die Larvenstadium der Larven zu identifizieren. Das letzte Larvenstadium sind etwas länger als Puppen. Alternativ können PU-11 verwendet, um die letzten Larvenstadium zu identifizieren sowie den zeitlichen Verlauf der Entwicklung des letzten Larvenstadium (Abbildung S4 in Clark-Hachtel et al. 2.013 12) zu bestimmen. </li><li> Halten Sie die ausgewählten Larven in einer Petrischale bis etherization. Legen Sie den Restder Larven und auf anderen Stufen der Käfer (wie Puppen und Erwachsene) wieder in eine Kulturflasche mit Mehl und bringen Sie es in den Inkubator. </li></ol> 6. Herstellung von Injektionsnadeln <ol><li> Legen Sie eine zuvor zog Glas Nadel auf einen Glasobjektträger entweder klebrig oder doppelseitiges Klebeband. Mit einer Pinzette, testen Sie die zog Ende der Nadel während Sie durch den Binokular, wo die Spitze biegt sehen. Besorgen Sie sich die Fläche, die etwas in Richtung der Spitze der Seite, wo die Nadel biegt mit der Zange und Wendung zu brechen. </li><li> Halten gute Nadeln und verwerfen andere. Betrachten wir eine gute Nadel mit einer Öffnung, die weder zu groß noch zu klein (etwa 0,05 mm Durchmesser. 1A und 1B) und ist abgewinkelt, um das Eindringen der Larvencuticula einfacher (1B und 2A-2B) zu machen. Betrachten Sie eine schlechte Nadel (i) zu klein, so dass die Aufnahme der dsRNA-Lösung in die Nadel schwieKult (Schritt 7) (1D und 2D), (ii) zu groß ist, was zu Verletzungen und Larven möglich Letalität bei der Injektion (1C und 2F), (iii) stumpf, so dass das Eindringen der Nagelhaut schwierig und zunehmende Verletzung. </li><li> Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter. <ol><li> Zuerst schrauben Sie die Spitze des Nadelhalters und legen Sie das hintere Ende der Nadel in die Halterung Spitze. Legen Sie dann die Gummidichtung unter dem Halter Spitze (mindestens 1 cm vom hinteren Ende des Glas Nadel). </li><li> Die Rücken der Nadel in die Halterung, mit der Gummidichtung vollständig in die Öffnung des Nadelhalters eingeführt. Schrauben Sie die Spitze zurück auf den Halter. </li></ol></li><li> Legen Sie die zusammengebauten Nadelhalter auf die Nadel Manipulator. Halten Sie den Nadelhalter in der Nähe von horizontal. Stellen Sie die Position des Manipulators, so dass die Spitze der Nadel in der Mitte der Ansicht befindet, wenn Sie durch den MICRoscope. </li></ol> 7. Frontloading dsRNA-Lösung in die Nadel <ol><li> Bereiten Sie die dsRNA Injektionslösung unmittelbar vor der Injektion durch Einstellen der Konzentration mit ddH 2 O und Mischen des dsRNA-Lösung mit gleichen Volumina 2x Injektionspuffer (Schritt 2.3). Halten Sie die Mischlösung auf Eis. Siehe Diskussion über die dsRNA-Konzentration. </li><li> Schneiden Sie die Spitze eines 20 ul Einweg-Pipettenspitze. Je 10 ul der Lösung in die Pipettenspitze getrimmt. Entfernen Sie vorsichtig den Pipettenspitze aus der Pipette, während die Flüssigkeit an der Spitze durch Gegendruck. Alternativ entfernen Sie vorsichtig die Spitze und bewegen Sie dann die Lösung für das Ende der Spitze durch Druck mit einem Finger. </li><li> Die Pipettenspitze mit der dsRNA-Lösung auf dem Mikroskoptisch mit klebrig mit der Öffnung nach die Spitze der Nadel. </li><li> Blick durch das Mikroskop, langsam bewegen die geladene Spitze in Richtung der Nadel, bis die Spitze desNadel ist nur innerhalb des geladenen Pipettenspitze und in die Lösung. </li><li> Während der Blick durch das Mikroskop, ziehen Sie den Kolben der Injektionsspritze langsam ziehen die dsRNA-Lösung in die Nadel. HINWEIS: Überladen Sie die Nadel. Als das Ende der dsRNA Lösungsansätze die Spitze der Nadel, verlangsamen die Rate zu ziehen und das Laden der Lösung vor der Spitze der Nadel würde Luft zu erreichen. Wenn Luft die Spitze erreicht, wird die Lösung schnell in den Nadelhalter gezogen werden, was zu schweren Kontamination Fragen. Detaillierte Reinigungsverfahren des Nadelhalters in Philip und Tomoyasu 2011 11 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie den Druck aus der Injektionsspritze und Nadelhalter durch das Öffnen der Hahn. Dann bewegen Sie die Pipettenspitze von der Spitze der Nadel. Heben Sie die Nadel aus der Bühne, um nicht versehentlich zu beschädigen die Nadel beim Aufsetzen der Larven auf der Bühne. Entfernen Sie die geleert Pipettenspitze von der Bühne. </li></ol&gt; 8. dsRNA Injektion <ol><li> Legen Sie die Larven in die etherization Korb. Nutzen weniger als 10 Larven, wenn das Erlernen der Technik. Verwenden Sie 30-40 Larven in einer Runde einmal bequem mit der Technik. </li><li> Platzieren Sie den Korb mit Larven im Äther-Flasche und den Deckel schließen. HINWEIS: Ether stellt eine Brandgefahr dar und ist auch schädlich. Führen Sie diesen Schritt unter einer Abzugshaube. </li><li> Etherize Larven für etwa 3 min. Überprüfen Sie die Larven für die Bewegung nach 3 min. Legen Sie sie zurück in den Äther-Flasche für weitere 30 sec, wenn sie noch in Bewegung sind. Nicht länger als 5 min Etherize da dies Letalität erhöhen. HINWEIS: Die optimale etherization Zeit kann je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren. </li><li> Übertragen Sie die veretherte Larven aus dem Korb auf die Antihaft-Kante einer Glas klebrige Folie. Mit einer Pinzette und, während Sie durch das Mikroskop, nehmen Sie jede Larven eine nach der anderen und legen Sie sie auf die Folie. Legen Sie sie seitlich und klopfen Sie leicht nach unten ihre Körper from Kopf bis Schwanz mit der Zange, leicht Stretching ihnen, wie Sie gehen, um sicherzustellen, dass sie auf der Folie gesichert. </li><li> Legen Sie die klebrige Rutsche mit Larven auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Legen Sie die dsRNA geladen Nadel vorsichtig in die dorsale Seite der Larven verhindert die Beschädigung des ZNS. Vermeiden Sie auch die Rückenmittellinie, da die Larven Herz befindet sich hier. In dieser und den folgenden Schritten immer die Bühne, um die Larven zu der Nadel (anstatt die Nadel Manipulator, um die Nadel zu bewegen) zu bewegen. HINWEIS: Die spezifische Injektionsstelle nicht als RNAi Rolle in T. castaneum erscheint systemischen sein. Jedoch ist es üblicherweise am einfachsten in die dorsale Seite der Brust-und Bauchsegmente injizieren. </li><li> Nach dem Einlegen der Nadel in die Larven, ziehen Sie die Nadel leicht wieder auf Raum ermöglichen die dsRNA die Larvenkörperhöhle zu gelangen. </li><li> Drücken Sie leicht auf die Injektionsspritze, bis die Larven wiederum grün (oder der Farbe des Injektionspuffer) und suchen stretched und voll. Hinweis: Wenn das Erlernen der Technik versuchen, so viel wie möglich zu injizieren, um die Menge der Lösung, die in eine Larve ohne signifikante Letalität injiziert werden kann bestimmen. Es ist im allgemeinen etwa 0,5-0,7 ul. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Larven. Beim Entfernen der Nadel leicht wieder auf die Injektionsspritze auf dsRNA Verlust zu vermeiden ziehen (auch darauf achten, nicht in der Luft zu ziehen). </li><li> Injizieren alle Larven auf der Folie. Achten Sie darauf, Larven, die nicht erfolgreich injiziert wurden, zu entfernen. Vollständige Injektion vor Larven aufwachen (in ca. 10 min). </li><li> Entfernen Sie den Schlitten mit eingespritzt Larven aus der Einspritz Mikroskop und lassen Sie die Folie noch 5 Minuten, bis alle Larven erholen sich von der etherization. </li><li> Mit Pinzette und unter einem Binokular, heben die Larven von Kopf bis Schwanz, um sie von der klebrigen Schieber freizugeben. Legen Sie die neu veröffentlichten Larven in einer sauberen Petrischale. Verlassen Sie die Larven auf der Petrischale für 10-15 min, um die Injektion w ermöglichenound gerinnen. </li><li> Legen Sie die Larven in eine neue Flasche mit sauberem Mehl und Etikett entsprechend der Belastung einschließlich Name, die Art der dsRNA injiziert, der Konzentration der dsRNA, die Anzahl der Larven injiziert und das Datum. </li><li> Kultur der injizierte Larven bei 30 ° C mit 70% Luftfeuchtigkeit. Beachten Sie die Larven für RNAi-Phänotypen regelmäßig. Hinweis: Die letzten Larvenstadium verpuppen sich innerhalb von 7 Tagen. Dann werden die Puppen zu Erwachsenen nach 7 Tagen schlüpfen (wenn es keine Abnormalität in Zeit durch RNAi verursacht). </li></ol> 9. Bestätigung des Knockdown und phänotypische Analysen <ol><li> Sehen Beurteilung Effizienz RNAi knock down von verschiedenen molekularbiologischen Techniken, wie quantitative reverse Transkription-PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Siehe Miller et al. 2012 7 und Philip und Tomoyasu 2011 11 für detaillierte qPCR und Western Blot-Protokoll auf. </li><li> Analysieren RNAi-Phänotypen im Zusammenhang. HINWEIS: RNAi verwandtenPhänotypen können in verschiedenen Stadien und bei verschiedenen Kulturbedingungen beobachtet werden, abhängig von den Genen, die gezielt wurden. RNAi kann den Käfer Morphologie, Metamorphose, Physiologie und Verhalten beeinflussen. Wie oft die Anwesenheit von Phänotyp wird überprüft und unter welchen Bedingungen die Käfer aufgezogen werden sollten, um den spezifischen Fragen zugeschnitten werden sie durch RNAi untersucht. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Es gibt eine Reihe von wichtigen Fragen, die berücksichtigt, um den Erfolg zu garantieren RNAi werden müssen, einschließlich der Länge und Konzentration der dsRNA-Moleküle, Wettbewerb zwischen verschiedenen dsRNA-Moleküle (bei dem Versuch mehrere knock down), und die Möglichkeit der Off-Target-Effekte (OTE). dsRNA Länge Die Länge der dsRNA Moleküle beeinflusst die Effizienz der systemischen RNAi-Antwort, wobei eine längere dsRNA in dem effizienteren RNAi 7,14,15 auslösen (obwohl die längere Begrenzung der dsRNA ist derzeit unbekannt). Die dsRNA Länge braucht länger als 50 bp sein, um effektive RNAi in T. induzieren castaneum 7. dsRNA zwischen 150 bp und 500 bp scheint für RNAi-Experimente ideal. Obwohl längere dsRNA-Moleküle können auch verwendet werden, müssen sie eine erhöhte Chance OTE und das Gen-Klonierung Schritt wird zunehmend schwieriger. dsRNA Konzentration ve_content &quot;&gt; verschiedene Grade der Zuschlags Gen kann in Abhängigkeit von der Konzentration der dsRNA erreicht werden. 1 ug / ul scheint ein vernünftiger Ausgangskonzentration, die häufig erzeugt ein nahezu Null-Phänotyp sein (je nach Gen (en) von Interesse variieren ). RNAi kann mit einer höheren Konzentration (beispielsweise 7-8 ug / ul) durchgeführt, um eine stärkere RNAi-Phänotyp. RNAi mit einer seriellen Verdünnung der dsRNA erhalten kann manchmal vorteilhaft sein, eine Reihe von Phänotypen hypomorphen (Zusatzdaten von Tomoyasu erzeugen et al. 2009 8, und Borràs-Castells unveröffentlichte Daten). RNAi-Wettbewerb Mehrere Gen Knockdown in T. erreicht werden castaneum durch Injektion von verschiedenen dsRNA-Moleküle gleichzeitig. Es ist jedoch auch bekannt, dass mit mehreren dsRNA Moleküle im Organismus vorhandene oft in Konkurrenz zwischen den dsRNAs für den Zugriff auf die RNAi-Komponenten <sbis&gt; 7,14. Es ist wichtig, die gleiche Länge und die gleiche Konzentration für alle dsRNA zu verwenden, wenn versucht mehrere Gen Zuschlags einer dsRNA aus konkurrierenden die andere (obwohl vermeiden, weitere Anpassungen der dsRNA Länge und Konzentration erforderlich, wenn die Expressionsniveaus erheblich zu unterscheiden Zielgene). Wir, als auch andere, haben erfolgreich doppelt und dreifach durchgeführt Zuschlags (zB Tomoyasu et al. 2.005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, und Yang et al. 2009 18). Obwohl machbar, Vierbett-RNAi (oder mehr) könnte eine Herausforderung sein, da es wahrscheinlich zu erheblichen Reduktion der RNAi Effizienz für alle vier Zielgene. Off-Targeting OTE ist eine inhärente Interesse für RNAi-basierte Ansätze. Ein Weg, um OTE zu minimieren ist es, Regionen in der Ziel-Gens, die ähnliche Sequenzen mit anderen Genen teilen erkennen und zu vermeiden, diese Regionen bei der Gestaltung dsRNA. Eine einfache BLAST-Analyse gegen die T. castaneum vorhergesagt Gen-Set können solche Regionen zu identifizieren. Mehrere Online-Tools ermöglichen auch Bewertung potenzieller OTE (zB E-RNAi-19). Ausführen RNAi für zwei nicht-überlappenden Bereichen des Target-Gens ist eine einfache und effiziente Weise, um die Möglichkeit, die Phänotypen von OTE konstatiert beseitigen. Die Möglichkeit der OTE wird minimiert, wenn RNAi für zwei nicht-überlappenden Regionen zu den gleichen Phänotyp (es sei denn, die beiden nicht überlappenden Regionen eine ähnliche Sequenz). Auswertung Gen durch andere als phänotypische Analysen mittels Knockdown ist oft entscheidend, um effektiv vorhanden RNAi-Daten. Zwei große Möglichkeiten, um Gen-Knockdown zu bewerten sind qRT-PCR und Western-Blot-Analyse. qRT-PCR ist ein bequemer Weg, um das Niveau der Ziel-mRNA zu messen, und hat sich in vielen RNAi bezogenen Studien einschließlich der in T. verwendet castaneum (siehe Miller et al. 2012 7 zum Beispiel). HowevER ist Vorsicht eingenommen werden, da wir in letzter Zeit einige Fälle, in denen das Ziel-mRNA-Ebene hochreguliert durch RNAi (obwohl das Proteinprodukt herunterreguliert) (Borràs-Castells unveröffentlichte Daten) zu sehen. Es ist derzeit nicht bekannt, ob diese RNAi induzierte mRNA Hochregulation kann verbreitet oder eindeutig bestimmte Gene sein. Western-Blot-Analyse ist ein weiterer Weg, um Gen-Knockdown bestätigen. Dieses Verfahren ist sehr zuverlässig, da sie die Menge der endgültigen Proteinprodukt mißt. Das Erfordernis eines spezifischen Antikörpers gegen das Proteinprodukt des Zielgens ist ein Nachteil dieses Ansatzes. Verwendung von mehreren unabhängigen Messungen zusätzlich zu phänotypische Analyse wird das Vertrauen der von RNAi-basierten Analyse erhaltenen phänotypischen Daten zu erhöhen. Seit seiner Vorstellung in T. castaneum, RNAi wurde in erster Linie verwendet, um Gen-Funktion in der Entwicklung und Musterbildung zu studieren. Diese T. castaneum Entwicklungsstudien wurden in CHARAC sehr erfolgreichzeichnenden evolutionär konserviert und auseinander Funktionen von Genen (in Denell 2008 1 und 2004 2 Klingler überprüft). Allerdings RNAi-basierte Studien in T. castaneum sind nicht auf die Entwicklungsbiologie beschränkt. So kann beispielsweise genutzt werden, um RNAi Gen-Funktion in einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensreaktionen, einschließlich Stresstoleranz, Plünderung, Aggression, Partnerwahl, Aktivitätsmuster und Abwehrmechanismen zu studieren. Eine Schwierigkeit der Anwendung von RNAi auf diesen Zusammenhängen ist die Wahrscheinlichkeit, pleiotrope Effekte. Oft Gene von Interesse wird eine Vielzahl von Rollen in der gesamten T. haben castaneum Lebenszyklus, wodurch die Entfernung von Genen, ohne unbeabsichtigte phänotypischen Wirkungen schwierig. Allerdings kann die Fähigkeit, leicht durchzuführen RNAi bei einer Vielzahl von Phasen oft eine wirksame Strategie zur Vermeidung dieser pleiotropen Effekte. Zum Beispiel, die Durchführung von RNAi bei Erwachsenen statt Larven oder Puppen könnte es uns ermöglichen, zu umgehen unbeeher durch Gen-Knockdown Letalität verursacht während der frühen Entwicklung. Die Flexibilität des RNAi-Antwort in T. castaneum macht somit dieses Modell eine attraktive Wahl für die Anpassung RNAi Experimente der Genfunktion in physiologischen und Verhaltensreaktionen. Die T. castaneum System ist auch ideal für die Verwendung in einem Lehrlabor. T. castaneum auf einem Mehl / Hefe-Mischung bei Raumtemperatur (25 ° C) ohne häufige Subkultivierung leicht kultiviert werden, und RNAi-Techniken in T. castaneum sind einfach genug, um zu einem Labor mit kleinen Lern Wissenschaftler angepasst werden. RNAi ist zu einem wesentlichen Technik in einer Vielzahl von biologischen Bereich, ist es wichtig, dass die Schüler auf diese Technik ausgesetzt. Die geradlinige Art der Larven RNAi-Technik in T. castaneum fördert auch mehr Studenten in die Forschung einbezogen werden, so dass T. castaneum ein heißer Kandidat für ein Klassenzimmer ausgerichtet genetisches System. &lt;/ P&gt;

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Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Der rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum, ist an Popularität gewinnt in verschiedenen Bereichen der Biologie zum Teil aufgrund der einfachen Durchführung der RNA-Interferenz (RNAi) 1-3. RNAi-basierte Gen-Knockdown-Techniken den Wissenschaftlern ermöglichen, führen loss-of-function-Analysen ohne Verwendung komplexer genetischer Methoden. T. castaneum zeigen eine robuste systemischen RNAi-Antwort, die es ermöglichen, RNAi in jeder Phase durch einfache Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in der Käfer Körperhöhle 4-6 durchzuführen. Gleichzeitige Knockdown von mehreren Genen ist auch denkbar, in T. castaneum durch Einspritzen von zwei oder mehr verschiedenen dsRNA-Moleküle gleichzeitig 7,8. Darüber hinaus kann eine Reihe von Phänotypen hypomorphen durch Verringerung der Konzentration der dsRNA injiziert 8 erzeugt werden. Diese Eigenschaften machen RNAi-basierten Reverse genetische Techniken attraktive Alternativen zu herkömmlichen vorwärts Genetik in T. castaneum. Da praktischalle T. castaneum Gewebe sind anfällig für extrazellulären dsRNA-Moleküle 9, diese Technik können Forscher eine Vielzahl von Geweben in verschiedenen Kontexten zu untersuchen. Darüber hinaus, obwohl dieser Bericht konzentriert sich auf die Durchführung von RNAi in T. castaneum, sind hier beschrieben viele Verfahren auf andere Insekten. Daher ist dieses Protokoll nützlich für diejenigen führen möchten Verlust-Funktion analysiert in ihren Zusammenhängen von Interesse in T. castaneum, als auch für Forscher, die ein RNAi-basierte Technik, um andere Insekten gelten. Einspritzen von dsRNA in Larven ermöglicht Funktionsanalyse bei einer Vielzahl von Käferlebensstadien, einschließlich der Larven, Puppen und adulte Stadien 4,5,10. Wir haben bereits berichtet unser Gesamtlarven RNAi-Protokoll einschließlich Molekularbiologie Verfahren 11. Im vorliegenden Bericht konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der dsRNA Injektionsverfahren, die am besten mit visuellen Hilfen erläutert werden. Wir bietenausführliche Schritt-für-Schritt-Einspritzverfahren sowie gute und schlechte Beispiele Injektion. Diese visuelle Protokoll ergänzt unsere bisherigen Protokoll, und wenn sie kombiniert, bieten sie eine umfassendere Sicht der Larven RNAi Verfahren in T. castaneum. Darüber hinaus diskutieren wir Parameter für dsRNA-Moleküle, die den Erfolg der RNAi, die Anwendung von RNAi-basierten Assays für physiologische Forschung, sowie die Anwendbarkeit des Larven RNAi-Protokoll in einer Lehre Labor beeinträchtigen könnten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Der rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum bietet ein Repertoire von Versuchswerkzeugen für genetische und Entwicklungsstudien, inklusive einer vollständig annotierte Genomsequenz, Transposon-basierten Transgenese und effektive RNA-Interferenz (RNAi). Unter diesen Vorteilen sind RNAi-basierte Gen-Knockdown-Techniken im Mittelpunkt der Tribolium Forschung. T. castaneum zeigen eine robuste systemischen RNAi-Antwort, die es ermöglichen, RNAi jederLebensPhase durchführen, indem Sie einfach die Injektion doppelsträngiger RNA (dsRNA) in die Körperhöhle des Käfers. In diesem Bericht stellen wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in T. castaneum. Das Protokoll umfasst (i) Isolieren der richtigen Phase des T. castaneum Larven zur Injektion, (ii) Vorbereitung für den Einspritzeinstellung und (iii) dsRNA-Injektion. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die uns mit den schnellen Zugriff auf Verlust-of-function Phänotyp bietetES, darunter mehrere Gen-Knockdown-Phänotypen sowie eine Reihe von Phänotypen hypomorphen. Da fast alle T. castaneum Gewebe sind anfällig für extrazellulären dsRNA kann der Larven RNAi-Technik Forscher eine Vielzahl von Geweben in verschiedenen Zusammenhängen, einschließlich genetischer Grundlage organismal Antworten auf die Außenumgebung zu studieren. Darüber hinaus ist die Einfachheit dieser Technik stimuliert mehr Beteiligung der Studierenden in die Forschung, so dass T. castaneum ideale genetisches System für die Verwendung in einem Klassenzimmer.

Einer der wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Injektion ist, um eine gute Nadel machen. Wie in Schritt 6 beschrieben, wird die Spitze der Nadel muß vor dem Injizieren T. gebrochen castaneum. Beispiele für gute und schlechte Nadeln sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein guter Nadel hat eine scharfe Spitze und steif, mit einem etwa 0,05 mm Durchmesser Öffnung (Abbildung 1B). Figur 2 zeigt eine erfolgreiche Injektion (2A und 2B) als auch in mehreren Fällen erfolglos Injektionen (2C-2F). Mit einer richtigen Größe Injektionsnadel dringt die Nadelspitze die Larvencuticula mit minimalem Widerstand (2A), und die dsRNA-Lösung (grün) fließt in die Larven ohne Leckage (2B). Nicht zu spritzen, da es Überlauf des dsRNA-Lösung sogar mit einem richtigen Größe Injektionsnadel (Abbildung verursachen2C). Wenn die Spitze der Nadel zu dünn ist, die Nadelspitze oft nicht die Larvencuticula und Biegungen zu durchdringen, so dass die Injektion schwierig (2D). Wenn dies geschieht, Beschneiden der Nadelspitze hilft manchmal. Größere Nadeln sind oft noch brauchbar, wenn auch mit einigen Schwierigkeiten bei der Durchdringung des Larvencuticula (2E). Jedoch wird eine große Menge der dsRNA Lösung leicht aus der Nadel geschoben auch mit leichtem Druck auf die Injektionsspritze, was häufig zu einem Überlauf des dsRNA-Lösung (2F). Bei der Durchführung von RNAi, ist es wichtig, eine positive Kontrolle zu haben, um zu beurteilen, dass RNAi ordnungsgemäß funktioniert, und eine negative Kontrolle, um sicherzustellen, dass der beobachtete Effekt nicht eine unspezifische Wirkung von dsRNA oder eine Folge von Einspritzverfahren (wie Schädigung durch Injektion oder einer Missbildung von etherization). Injektion von dsRNA Targeting EYFP kann als dienengute positive Kontrolle bei der Verwendung der PU-11-Stamm 5,7. Wenn EYFP dsRNA ist in der letzten Larvenstadium injiziert wird, kann eine signifikante Reduktion der EYFP-Signal in der Zukunft Flügel Primor Bereits einen Tag nach der Injektion (3A) beobachtet werden. Die Knockdown von EYFP abgeschlossen zwei Tage nach der Injektion des EYFP dsRNA (3B) und das Zuschlags besteht durch das Puppenstadium (3C und 3D) und während der gesamten Lebensdauer des Käfers wenn die dsRNA Konzentration hoch genug ist (wie 1 ug / ul). 7 EYFP dsRNA auch als negative Kontrolle verwendet, da es ein nicht-endogenes Gen-Sequenz und nicht morphologischen oder physiologischen Störungen (3A-3D) verursachen. Wir stellten Bilder Larven RNAi für Rest (VG), ein kritisches Gen Flügel 12, als ein weiteres Beispiel, wie efdefekt Diese Injektion basierende RNAi-Technik ist in T. castaneum. Wenn dsRNA für vg in vorletzten Larven (eine Stufe vor dem letzten Larvenstadium) injiziert wird, kann ein vollständiger Verlust der Flügelstrukturen im Puppenstadium (3E und 3F) beobachtet werden. Die daraus resultierende Erwachsenen auch ganz fehlt Flügelstrukturen (Abbildungen 3g und 3h). Die RNAi-Ergebnis für vg beispielhaft sowohl die Robustheit und die systemische Natur der RNAi in T. castaneum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1: (A) Beispiele für ungebrochen, gute und schlechte Nadeln (B) Die Spitze eines gut gebrochen gute Nadel (C) Die Spitze eines gebrochenen Nadel, die zu groß und stumpf ist (D) Die Spitze... einer pleite<html> n Nadel, die zu dünn ist. Maßstabsbalken (rot) sind 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2:... (A) Eine richtig große Injektionsnadel in den letzten Larvenstadium eingesetzt (B) Larve entsprechend mit dem grünen dsRNA injizierten Lösung (C) Überlauf des dsRNA-Lösung an der Injektionsstelle durch Über Injektion verursacht (D ) Eine dünne Nadel Falls Sie die Larvencuticula eindringen. (E) Eine große Injektionsnadel in den letzten Larvenstadium eingesetzt. (F) eingespritzt Larve mit einer großen Nadel, was zu Überlauf und ein Auslaufen des dsRNA-Lösung. Pfeile zeigen die Nadeln.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3: Beispiele erfolgreicher RNAi in T. castaneum. (AD) letzten Larven Injektion der EYFP-dsRNA zu einer Verringerung der Expression EYFP. (A) Larven einen Tag nach der Injektion. (B) Larven zwei Tage nach der Injektion. (C) Steuer Puppen. (D) Puppen entstehende Larven EYFP dsRNA Injektion. Die negativen Kontrollen Pufferinjektion (A, B) und dsRed dsRNA-Injektion (C, D). Pfeilspitzen und Pfeile zeigen EYFP Ausdruck oder deren Fehlen in der Flügelprimor und Augen auf. (EH) Penultimative Larven RNAi für vg. (E) Wildtyp-Puppe. (F) vg RNAi Puppe. Das Fehlen von Flügelstrukturen bereits am Puppenstadium (Pfeil). G) Wildtyp Erwachsenen. (H) vg RNAi Erwachsenen sichtbar. Flügel verwandte Strukturen sind vollständig fehlt (Pfeil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA-Interferenz (RNAi) basierten Gen-Knockdown-Techniken sind der Kern der Tribolium Forschung. Hier geben wir einen Überblick über unsere Larven RNAi-Technik in Tribolium castaneum. Larven RNAi ist eine einfache, aber leistungsfähige Technik, die den schnellen Zugriff auf Verlust-Funktion Phänotypen bietet, so dass die Forscher Gen-Funktionen in verschiedenen Kontexten zu studieren.

Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Forschung

Biologie

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erkundung entomopathogener Pilzressourcen aus Waldholzzünslern

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Bewertung entomopathogener Pilze in wilden Monochamus alternatus-Populationen für biologische Schädlingsbekämpfungsanwendungen bei W

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...