Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

אנו מודים למרכז לביואינפורמטיקה וגנומיקה פונקציונלית (CBFG) באוניברסיטת מיאמי לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מיאמי מענק הזנק (יט), וקרן הלאומית למדע (יט: IOS 0,950,964).

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

<html> ישנן מספר הסוגיות החשובות שצריכים להילקח בחשבון על מנת להבטיח את ההצלחה של RNAi, כולל האורך והריכוז של מולקולות dsRNA, תחרות בין מולקולות dsRNA שונות (בעת ניסיון מרובה להפיל), וכן את האפשרות של Off-יעד אפקטים (OTE). אורך dsRNA האורך של מולקולות dsRNA משפיע על היעילות של תגובת RNAi המערכתית, עם dsRNA יותר להיות יעיל יותר כדי לעורר RNAi 7,14,15 (אם כי הגבול הארוך של dsRNA אינו ידוע כרגע). אורך dsRNA צריך להיות ארוך יותר מ50 נ&quot;ב לגרום RNAi היעיל בט castaneum 7. dsRNA בין 150 נ&quot;ב ו500 נ&quot;ב נראה אידיאלי עבור ניסויי RNAi. גם למרות שניתן להשתמש במולקולות dsRNA יותר, תהיה להם סיכוי מוגבר של OTE וצעד שיבוט הגנים יהפוך קשה יותר ויותר. ריכוז dsRNA ve_content &quot;&gt; דרגות שונות של מציאה גן ניתן להשיג בהתאם לריכוז של dsRNA. 1 מיקרוגרם / μl מופיע להיות ריכוז התחלה סביר, אשר לעתים קרובות מייצר פנוטיפ כמעט ריק (עשוי להשתנות תלוי בגן (ים) של עניין ). ניתן לבצע RNAi עם ריכוז גבוה יותר (לדוגמא, 7-8 מיקרוגרם / μl) כדי לקבל פנוטיפ חזק RNAi. RNAi עם דילול סדרתי של dsRNA לפעמים יכול להיות מועיל כדי לייצר סדרה של פנוטיפים hypomorphic (משלימה נתונים של Tomoyasu et al. 2009 8, ונתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). RNAi תחרות מציאה גן מרובה יכולה להיות מושלמת בט castaneum על ידי הזרקה כמה מולקולות dsRNA שונות בו זמנית. עם זאת, הוא ידוע גם שיש כמה מולקולות dsRNA שונות קיימים בתוך האורגניזם לעתים קרובות תוצאות תחרות בין dsRNAs לגישה לרכיבי RNAi <sעד&gt; 7,14. חשוב להשתמש באותו אורך ואותו ריכוז לכל dsRNA כאשר מנסה מציאה גן רב כדי להימנע מאחד dsRNA מחוץ מתחרה האחרים (אם כי, התאמות נוספות של אורך dsRNA והריכוז עשויים להידרש כאשר רמות הביטוי שונות מאוד בין גני המטרה). אנחנו, כמו גם לאחרים, ביצענו בהצלחה מציאה כפולה ומשולשת (לדוגמא, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, ויאנג et al. 2009 18). למרות שאפשרי, RNAi המרובע (או יותר) יכול להיות מאתגר, כפי שהוא עלול לגרום לירידה משמעותית של יעילות RNAi לכל ארבעת גני המטרה. מיקוד-Off OTE הוא חשש מובנה לגישות מבוססות RNAi. אחת דרכים למזער OTE היא לזהות אזורים בגן המטרה שחולקים רצפים דומים עם גנים אחרים ולהימנע מאזורים אלה בעת תכנון dsRNA. ניתוח תפציץ פשוט נגד T. סט הגן חזה castaneum יכול לזהות אזורים כאלה. כמה כלים מקוונים מאפשרים גם הערכה של OTE הפוטנציאלי (למשל, E-RNAi 19). ביצוע RNAi לשני אזורים שאינם חופפים של גן המטרה הוא דרך קלה ויעילה כדי לשלול את האפשרות שנצפתה פנוטיפים נגרמים על ידי OTE. האפשרות של OTE ממוזערת אם RNAi לשני אזורים שאינם חופפים לייצר את אותו פנוטיפים (אלא אם כן שני אזורים שאינם חופפים לשתף רצף דומה). הערכת גן מציאה באמצעים אחרים מאשר פנוטיפי מנתח היא לעתים קרובות קריטית לנתונים הקשורים RNAi ביעילות נוכחי. שתי דרכים עיקריות להעריך מציאה גן הן qRT-PCR וניתוח כתם מערבי. qRT-PCR הוא דרך נוחה כדי למדוד את הרמה של mRNA היעד, ונעשה שימוש במחקרים הקשורים לRNAi רבים, כולל אלה בט castaneum (ראה אל מילר ואח. 2012 7 לדוגמא). Howevאה, יש לנקוט בזהירות, כפי שיש לנו לאחרונה ראו כמה מקרים שבי רמת mRNA היעד היא על ידי RNAi מוסדר עד (אם כי מוצר החלבון הוא למטה מוסדר) (נתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). לא ידוע כרגע אם mRNA RNAi מושרה זה עד תקנה יכול להיות נפוץ או ייחודי לגנים מסוימים. ניתוח כתם מערבי הוא דרך נוספת כדי לאשר מציאה גן. שיטה זו היא די אמינה כפי שהוא מודד את כמות מוצר החלבון הסופי. הדרישה של נוגדן ספציפי נגד חלבון המוצר של גן המטרה היא חיסרון בגישה זו. ניצול מדידות עצמאיות רבות, בנוסף לניתוח פנוטיפי יגדיל את הביטחון של נתונים פנוטיפי המתקבלים על ידי ניתוח מבוסס RNAi. מאז ראשיתה בט castaneum, RNAi יש בעיקר נעשה שימוש כדי לחקור את תפקוד גן בפיתוח ויצירת תבנית. ט אלו מחקרים התפתחותיים castaneum היו מוצלחים ביותר בcharacterizing פונקציות אבולוציונית שימור והתפצלו של גנים (שנסקר בDenell 2008 1 וKlingler 2004 2). מחקרים עם זאת, מבוסס RNAi בט castaneum אינם מוגבל לביולוגיה התפתחותית. לדוגמא, יכול להיות מנוצל RNAi ללמוד תפקוד גן במגוון רחב של תגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות, כוללים סובלנות מתח, טריפה, תוקפנות, בחירת בן זוג, דפוסי פעילות, ומנגנוני הגנה. קושי אחד של יישום RNAi להקשרים אלה הוא את הסבירות לתופעות pleiotropic. לעתים קרובות, הגנים של עניין יהיו מגוון של תפקידים ברחבי ט מחזור החיים castaneum, ובכך להפוך את ההסרה של גנים ללא תופעות פנוטיפי לא מכוונות קשות. עם זאת, את היכולת לבצע בקלות RNAi במגוון רחב של שלבים לעתים קרובות יכולה להיות אסטרטגיה יעילה למניעת תופעות pleiotropic אלה. לדוגמא, ביצוע RNAi במבוגרים במקום זחלים או גלמים עשוי לאפשר לנו לעקוף uninנטה קטלני הנגרם על ידי מציאה גן במהלך ההתפתחות מוקדמת. הגמישות של תגובת RNAi בט castaneum כך הופך את המודל הזה לבחירה אטרקטיבית עבור התאמת RNAi לניסויים של תפקוד גן בתגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות. ט מערכת castaneum היא גם אידיאלית לשימוש במעבדה הוראה. ט castaneum יכולה להיות בקלות בתרבית על קמח / תערובת שמרים בטמפרטורת חדר (C ° 25) ללא subculturing תכוף, וטכניקות RNAi בט castaneum פשוטים מספיק כדי להיות מותאמים למעבדה עם מדענים צעירים, לומדים. כRNAi הופך טכניקה חיונית במגוון רחב של תחומים ביולוגיים, זה קריטי, כי תלמידים נחשפים לטכניקה זו. הטבע ישר קדימה של טכניקת RNAi הזחל בט castaneum גם מעודד את תלמידים יותר להיות מעורבים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מועמד לכיתת אוריינטציה מערכת גנטית. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, הוא צוברת פופולרי בתחומים שונים של ביולוגיה נובעת בחלקו את הקלות של ביצוע התערבות RNA (RNAi) 1-3. טכניקות גן מציאה מבוססת RNAi לאפשר למדענים לבצע פסד של פונקצית ניתוחים ללא שימוש בשיטות גנטיות מורכבות. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב באמצעות הזרקה פשוטה של פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית 4-6. מציאה בו זמנית של מספר רב של גנים היא גם אפשרית בט castaneum על ידי הזרקת שתיים או יותר מולקולות dsRNA שונות באותו הזמן 7,8. בנוסף, סדרה של פנוטיפים hypomorphic יכולה להיות שנוצרה על ידי הפחתת הריכוז של הזריק dsRNA 8. תכונות אלו הופכות את החלופות אטרקטיביות טכניקות גנטיות הפוכים מבוסס RNAi לגנטיקה קדימה מסורתית בט castaneum. מאז כמעטכל ט רקמות castaneum רגישות למולקולות dsRNA תאיים 9, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים. בנוסף, למרות שדו&quot;ח זה מתמקד בביצוע RNAi בט castaneum, נהלים רבים המתוארים כאן חלים על חרקים אחרים. לכן, פרוטוקול זה שימושי למי שרוצה לבצע פסד של פונקצית הניתוח בהקשרי עניין שלהם בט castaneum, כמו גם עבור חוקרים המבקשים להחיל טכניקה מבוססת RNAi לחרקים אחרים. הזרקה לתוך dsRNA זחלים מאפשרת אנליזה פונקציונלית במגוון שלבי חיי חיפושית, כוללים זחל, הגולם, ומבוגר בשלבים 4,5,10. יש לנו שדווחו בעבר הפרוטוקול שלנו כולל זחל RNAi לרבות נהלי ביולוגיה מולקולרית 11. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתמקדים הבמתארים את נהלי הזרקת dsRNA, אשר הסבירו הטובים ביותר עם עוזרים חזותיים. אנו מספקיםנהלים מפורטים צעד אחר צעד הזרקה, כמו גם דוגמאות הזרקה טובות ורעות. פרוטוקול חזותי זו משלים הפרוטוקול הקודם שלנו, וכאשר בשילוב, הם מספקים תמונה מקיפה יותר של נהלי RNAi זחל בט castaneum. בנוסף, אנו דנים פרמטרים למולקולות dsRNA שיכול להשפיע על ההצלחה של RNAi, יישום של מבחני מבוססי RNAi למחקר פיסיולוגי, כמו גם תחולתו של פרוטוקול RNAi זחל במעבדה הוראה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, מציעה רפרטואר של כלים ניסיוניים למחקרים גנטיים והתפתחותיים, כולל רצף מבואר באופן מלא הגנום, transgenesis מבוסס transposon, והתערבות יעילה RNA (RNAi). בין יתרונות אלה, טכניקות גן מציאה RNAi מבוססות נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב חיים פשוט על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית. בדו&quot;ח זה, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בט castaneum. הפרוטוקול כולל בידוד (i) של השלב הנכון של ט זחלי castaneum להזרקה, (ii) הכנה להגדרת ההזרקה, וכן (iii) הזרקת dsRNA. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה שמספקת לנו גישה מהירה לphenotyp אובדן של הפונקציהes, כולל פנוטיפים מרובים גן מציאה, כמו גם סדרה של פנוטיפים hypomorphic. מאז כמעט כל ט רקמות castaneum רגישות לdsRNA תאי, טכניקת RNAi הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים, כולל את הבסיס הגנטי של תגובות האורגניזם לסביבה החיצונית. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת יותר מעורבות סטודנטים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מערכת גנטית אידיאלית לשימוש בסביבה בכיתה.

אחד הצעדים המרכזיים לזריקה מוצלחת הוא להפוך את מחט טובה. כפי שתואר בשלב 6, קצה המחט צריך להיות שבור לפני הזרקת ט castaneum. דוגמאות למחטים טובות ורעות מוצגות באיור 1. יש מחט טובה קצה חד ונוקשה, עם פתיחת קוטר כ 0.05 מ&quot;מ (איור 1). איור 2 מציג את זריקה מוצלחת (2A דמויות ו2B), כמו גם כמה מקרים של זריקות לא מוצלחות (איורים 2C-2F). עם מחט זריקה בגודל כראוי, קצה המחט חודר את ציפורן הזחל עם התנגדות מינימאלית (איור 2 א), ופתרון dsRNA (הירוק) זורם לתוך הזחלים ללא כל דליפה (איור 2). אל, כפי שהוא יגרום יתר להזריק הצפה של פתרון dsRNA אפילו עם מחט זריקה בגודל כראוי (איור2C). אם קצה המחט דק מדי, קצה המחט לעתים קרובות לא מצליח לחדור לציפורן ועיקולי הזחל, מה שהופך את הזריקה הקשה (איור 2 ד). אם זה יקרה, זמירה קצה המחט לפעמים עוזר. מחטים גדולות יותר הן לעתים קרובות עדיין אפשריים לשימוש, אם כי בכמה קשיים בחדירה לציפורן הזחל (איור 2E). עם זאת, כמות גדולה של פתרון dsRNA נדחפה בקלות החוצה מהמחט אפילו עם לחץ קל על מזרק ההזרקה, לעתים קרובות וכתוצאה מכך גלישה של פתרון dsRNA (איור 2F). בעת ביצוע RNAi, זה חשוב שתהיה שליטה חיובית להעריך שRNAi פועל כראוי, וביקורת שלילית כדי לוודא שההשפעה שנצפתה היא לא השפעה הלא ספציפית של dsRNA או תוצאה של נהלי הזרקה (כגון פגיעה על ידי הזרקה, או חריגות מetherization). הזרקה של EYFP מיקוד dsRNA יכולה לשמש כטוב ביקורת חיובית בעת השימוש ב5,7 זן pu-11. כאשר EYFP dsRNA מוזרק בשלב הזחל האחרון, לירידה משמעותית באות EYFP בprimordia אגף העתיד ניתן לצפות כבר בהודעת יום זריקה אחת (איור 3 א). מציאה של EYFP הושלמה יומיים לאחר ההזרקה של EYFP dsRNA (איור 3 ב) ומציאה זו נמשכת דרך (3C הדמויות ו3D) שלב גלמים וכל אורך חיי החיפושית אם ריכוז dsRNA הוא גבוה מספיק (כגון 1 מיקרוגרם / μl) 7. גם EYFP dsRNA יכול לשמש כביקורת שלילית כפי שהוא רצף גן שאינו ממקור פנימי ולא צריך לגרום לשיבושים מורפולוגיים או פיסיולוגיים (ציורים A3-3D). אנחנו סיפקנו תמונות של RNAi זחל לשריד (טוב מאוד), גן אגף קריטי 12, כדוגמא נוספת לאופן EFfective טכניקת RNAi מבוסס הזרקה זה בט castaneum. כאשר dsRNA לVG מוזרק לתוך זחלי שלב הלפני אחרון (שלב אחד לפני שלב הזחל האחרון), אובדן של מבני האגף שלם ניתן לצפות בשלב גלמים (3E דמויות ו3F). מבוגרים וכתוצאה מכך גם חסרים לחלוטין מבני אגף (איורים 3G ו 3H). תוצאת RNAi לVG מדגימה הן את החוסן ואת האופי המערכתי של RNAi בט castaneum. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: דוגמאות (א) למחטים רצופים, טובות, ורעות (ב) קצה מחט טובה שבורה היטב (C) קצה מחט שבורה, כי הוא גדול ובוטה מדי (D) הקצה... של כל הקופה<html> מחט n דקה מדי. ברים סולם (אדום) הם 0.05 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:... () מחט זריקה בגודל כראוי מוכנסת לתוך זחל instar האחרון (B) זחל הזריק כראוי עם פתרון dsRNA הירוק (C) הצפה של פתרון dsRNA בנקודת ההזרקה נגרמת על ידי יתר ההזרקה (D ) מחט דקה שלא הצליחה לחדור לציפורן הזחל. (מחט זריקה גדולה מוכנסת לתוך זחל instar האחרון E). (F) זחל דקירה ממחט גדולה, וכתוצאה מכך הגלישה והדליפה של פתרון dsRNA. חצים מצביעים על המחטים.&quot;Target =&quot; ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: דוגמאות של RNAi המוצלח בט castaneum. הזרקת זחל האחרונה של תוצאות EYFP dsRNA בהפחתה של ביטוי EYFP (AD). גלמים () זחלי יום אחד לאחר הזרקה. (B) זחלי יומיים לאחר הזרקה. גלמים (C) בקרה. (ד &#39;) כתוצאה מ הזרקת הזחל EYFP dsRNA. הבקרות השליליות הן הזרקת חיץ (A, B) והזרקת dsRed dsRNA (C, D). ראשי החץ וחצים מצביעים על ביטוי EYFP או היעדרה בprimordia הכנף ועיניים, בהתאמה. (EH) פןהאולטימטיבי זחל RNAi לVG. (E) גולם Wild-type. (F) VG גולם RNAi. חוסר מבני אגף הוא כבר נראה לעין בשלב גלמים (חץ). G) מבוגר Wild-type. (H) VG מבוגר RNAi. מבני אגף הקשורים חסרים לחלוטין (חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>חקר משאבי פטריות אנטומופתוגניות מבורמי יער

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הערכה של פטריות אנטומופתוגניות באוכלוסיות בר Monochamus alternatus עבור יישומי הדברה ביולוגית בבורות עץ יער

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...