Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

אנו מודים למרכז לביואינפורמטיקה וגנומיקה פונקציונלית (CBFG) באוניברסיטת מיאמי לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מיאמי מענק הזנק (יט), וקרן הלאומית למדע (יט: IOS 0,950,964).

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

<html> ישנן מספר הסוגיות החשובות שצריכים להילקח בחשבון על מנת להבטיח את ההצלחה של RNAi, כולל האורך והריכוז של מולקולות dsRNA, תחרות בין מולקולות dsRNA שונות (בעת ניסיון מרובה להפיל), וכן את האפשרות של Off-יעד אפקטים (OTE). אורך dsRNA האורך של מולקולות dsRNA משפיע על היעילות של תגובת RNAi המערכתית, עם dsRNA יותר להיות יעיל יותר כדי לעורר RNAi 7,14,15 (אם כי הגבול הארוך של dsRNA אינו ידוע כרגע). אורך dsRNA צריך להיות ארוך יותר מ50 נ&quot;ב לגרום RNAi היעיל בט castaneum 7. dsRNA בין 150 נ&quot;ב ו500 נ&quot;ב נראה אידיאלי עבור ניסויי RNAi. גם למרות שניתן להשתמש במולקולות dsRNA יותר, תהיה להם סיכוי מוגבר של OTE וצעד שיבוט הגנים יהפוך קשה יותר ויותר. ריכוז dsRNA ve_content &quot;&gt; דרגות שונות של מציאה גן ניתן להשיג בהתאם לריכוז של dsRNA. 1 מיקרוגרם / μl מופיע להיות ריכוז התחלה סביר, אשר לעתים קרובות מייצר פנוטיפ כמעט ריק (עשוי להשתנות תלוי בגן (ים) של עניין ). ניתן לבצע RNAi עם ריכוז גבוה יותר (לדוגמא, 7-8 מיקרוגרם / μl) כדי לקבל פנוטיפ חזק RNAi. RNAi עם דילול סדרתי של dsRNA לפעמים יכול להיות מועיל כדי לייצר סדרה של פנוטיפים hypomorphic (משלימה נתונים של Tomoyasu et al. 2009 8, ונתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). RNAi תחרות מציאה גן מרובה יכולה להיות מושלמת בט castaneum על ידי הזרקה כמה מולקולות dsRNA שונות בו זמנית. עם זאת, הוא ידוע גם שיש כמה מולקולות dsRNA שונות קיימים בתוך האורגניזם לעתים קרובות תוצאות תחרות בין dsRNAs לגישה לרכיבי RNAi <sעד&gt; 7,14. חשוב להשתמש באותו אורך ואותו ריכוז לכל dsRNA כאשר מנסה מציאה גן רב כדי להימנע מאחד dsRNA מחוץ מתחרה האחרים (אם כי, התאמות נוספות של אורך dsRNA והריכוז עשויים להידרש כאשר רמות הביטוי שונות מאוד בין גני המטרה). אנחנו, כמו גם לאחרים, ביצענו בהצלחה מציאה כפולה ומשולשת (לדוגמא, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, ויאנג et al. 2009 18). למרות שאפשרי, RNAi המרובע (או יותר) יכול להיות מאתגר, כפי שהוא עלול לגרום לירידה משמעותית של יעילות RNAi לכל ארבעת גני המטרה. מיקוד-Off OTE הוא חשש מובנה לגישות מבוססות RNAi. אחת דרכים למזער OTE היא לזהות אזורים בגן המטרה שחולקים רצפים דומים עם גנים אחרים ולהימנע מאזורים אלה בעת תכנון dsRNA. ניתוח תפציץ פשוט נגד T. סט הגן חזה castaneum יכול לזהות אזורים כאלה. כמה כלים מקוונים מאפשרים גם הערכה של OTE הפוטנציאלי (למשל, E-RNAi 19). ביצוע RNAi לשני אזורים שאינם חופפים של גן המטרה הוא דרך קלה ויעילה כדי לשלול את האפשרות שנצפתה פנוטיפים נגרמים על ידי OTE. האפשרות של OTE ממוזערת אם RNAi לשני אזורים שאינם חופפים לייצר את אותו פנוטיפים (אלא אם כן שני אזורים שאינם חופפים לשתף רצף דומה). הערכת גן מציאה באמצעים אחרים מאשר פנוטיפי מנתח היא לעתים קרובות קריטית לנתונים הקשורים RNAi ביעילות נוכחי. שתי דרכים עיקריות להעריך מציאה גן הן qRT-PCR וניתוח כתם מערבי. qRT-PCR הוא דרך נוחה כדי למדוד את הרמה של mRNA היעד, ונעשה שימוש במחקרים הקשורים לRNAi רבים, כולל אלה בט castaneum (ראה אל מילר ואח. 2012 7 לדוגמא). Howevאה, יש לנקוט בזהירות, כפי שיש לנו לאחרונה ראו כמה מקרים שבי רמת mRNA היעד היא על ידי RNAi מוסדר עד (אם כי מוצר החלבון הוא למטה מוסדר) (נתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). לא ידוע כרגע אם mRNA RNAi מושרה זה עד תקנה יכול להיות נפוץ או ייחודי לגנים מסוימים. ניתוח כתם מערבי הוא דרך נוספת כדי לאשר מציאה גן. שיטה זו היא די אמינה כפי שהוא מודד את כמות מוצר החלבון הסופי. הדרישה של נוגדן ספציפי נגד חלבון המוצר של גן המטרה היא חיסרון בגישה זו. ניצול מדידות עצמאיות רבות, בנוסף לניתוח פנוטיפי יגדיל את הביטחון של נתונים פנוטיפי המתקבלים על ידי ניתוח מבוסס RNAi. מאז ראשיתה בט castaneum, RNAi יש בעיקר נעשה שימוש כדי לחקור את תפקוד גן בפיתוח ויצירת תבנית. ט אלו מחקרים התפתחותיים castaneum היו מוצלחים ביותר בcharacterizing פונקציות אבולוציונית שימור והתפצלו של גנים (שנסקר בDenell 2008 1 וKlingler 2004 2). מחקרים עם זאת, מבוסס RNAi בט castaneum אינם מוגבל לביולוגיה התפתחותית. לדוגמא, יכול להיות מנוצל RNAi ללמוד תפקוד גן במגוון רחב של תגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות, כוללים סובלנות מתח, טריפה, תוקפנות, בחירת בן זוג, דפוסי פעילות, ומנגנוני הגנה. קושי אחד של יישום RNAi להקשרים אלה הוא את הסבירות לתופעות pleiotropic. לעתים קרובות, הגנים של עניין יהיו מגוון של תפקידים ברחבי ט מחזור החיים castaneum, ובכך להפוך את ההסרה של גנים ללא תופעות פנוטיפי לא מכוונות קשות. עם זאת, את היכולת לבצע בקלות RNAi במגוון רחב של שלבים לעתים קרובות יכולה להיות אסטרטגיה יעילה למניעת תופעות pleiotropic אלה. לדוגמא, ביצוע RNAi במבוגרים במקום זחלים או גלמים עשוי לאפשר לנו לעקוף uninנטה קטלני הנגרם על ידי מציאה גן במהלך ההתפתחות מוקדמת. הגמישות של תגובת RNAi בט castaneum כך הופך את המודל הזה לבחירה אטרקטיבית עבור התאמת RNAi לניסויים של תפקוד גן בתגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות. ט מערכת castaneum היא גם אידיאלית לשימוש במעבדה הוראה. ט castaneum יכולה להיות בקלות בתרבית על קמח / תערובת שמרים בטמפרטורת חדר (C ° 25) ללא subculturing תכוף, וטכניקות RNAi בט castaneum פשוטים מספיק כדי להיות מותאמים למעבדה עם מדענים צעירים, לומדים. כRNAi הופך טכניקה חיונית במגוון רחב של תחומים ביולוגיים, זה קריטי, כי תלמידים נחשפים לטכניקה זו. הטבע ישר קדימה של טכניקת RNAi הזחל בט castaneum גם מעודד את תלמידים יותר להיות מעורבים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מועמד לכיתת אוריינטציה מערכת גנטית. &lt;/ P&gt;

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, הוא צוברת פופולרי בתחומים שונים של ביולוגיה נובעת בחלקו את הקלות של ביצוע התערבות RNA (RNAi) 1-3. טכניקות גן מציאה מבוססת RNAi לאפשר למדענים לבצע פסד של פונקצית ניתוחים ללא שימוש בשיטות גנטיות מורכבות. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב באמצעות הזרקה פשוטה של פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית 4-6. מציאה בו זמנית של מספר רב של גנים היא גם אפשרית בט castaneum על ידי הזרקת שתיים או יותר מולקולות dsRNA שונות באותו הזמן 7,8. בנוסף, סדרה של פנוטיפים hypomorphic יכולה להיות שנוצרה על ידי הפחתת הריכוז של הזריק dsRNA 8. תכונות אלו הופכות את החלופות אטרקטיביות טכניקות גנטיות הפוכים מבוסס RNAi לגנטיקה קדימה מסורתית בט castaneum. מאז כמעטכל ט רקמות castaneum רגישות למולקולות dsRNA תאיים 9, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים. בנוסף, למרות שדו&quot;ח זה מתמקד בביצוע RNAi בט castaneum, נהלים רבים המתוארים כאן חלים על חרקים אחרים. לכן, פרוטוקול זה שימושי למי שרוצה לבצע פסד של פונקצית הניתוח בהקשרי עניין שלהם בט castaneum, כמו גם עבור חוקרים המבקשים להחיל טכניקה מבוססת RNAi לחרקים אחרים. הזרקה לתוך dsRNA זחלים מאפשרת אנליזה פונקציונלית במגוון שלבי חיי חיפושית, כוללים זחל, הגולם, ומבוגר בשלבים 4,5,10. יש לנו שדווחו בעבר הפרוטוקול שלנו כולל זחל RNAi לרבות נהלי ביולוגיה מולקולרית 11. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתמקדים הבמתארים את נהלי הזרקת dsRNA, אשר הסבירו הטובים ביותר עם עוזרים חזותיים. אנו מספקיםנהלים מפורטים צעד אחר צעד הזרקה, כמו גם דוגמאות הזרקה טובות ורעות. פרוטוקול חזותי זו משלים הפרוטוקול הקודם שלנו, וכאשר בשילוב, הם מספקים תמונה מקיפה יותר של נהלי RNAi זחל בט castaneum. בנוסף, אנו דנים פרמטרים למולקולות dsRNA שיכול להשפיע על ההצלחה של RNAi, יישום של מבחני מבוססי RNAi למחקר פיסיולוגי, כמו גם תחולתו של פרוטוקול RNAi זחל במעבדה הוראה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, מציעה רפרטואר של כלים ניסיוניים למחקרים גנטיים והתפתחותיים, כולל רצף מבואר באופן מלא הגנום, transgenesis מבוסס transposon, והתערבות יעילה RNA (RNAi). בין יתרונות אלה, טכניקות גן מציאה RNAi מבוססות נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב חיים פשוט על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית. בדו&quot;ח זה, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בט castaneum. הפרוטוקול כולל בידוד (i) של השלב הנכון של ט זחלי castaneum להזרקה, (ii) הכנה להגדרת ההזרקה, וכן (iii) הזרקת dsRNA. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה שמספקת לנו גישה מהירה לphenotyp אובדן של הפונקציהes, כולל פנוטיפים מרובים גן מציאה, כמו גם סדרה של פנוטיפים hypomorphic. מאז כמעט כל ט רקמות castaneum רגישות לdsRNA תאי, טכניקת RNAi הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים, כולל את הבסיס הגנטי של תגובות האורגניזם לסביבה החיצונית. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת יותר מעורבות סטודנטים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מערכת גנטית אידיאלית לשימוש בסביבה בכיתה.

אחד הצעדים המרכזיים לזריקה מוצלחת הוא להפוך את מחט טובה. כפי שתואר בשלב 6, קצה המחט צריך להיות שבור לפני הזרקת ט castaneum. דוגמאות למחטים טובות ורעות מוצגות באיור 1. יש מחט טובה קצה חד ונוקשה, עם פתיחת קוטר כ 0.05 מ&quot;מ (איור 1). איור 2 מציג את זריקה מוצלחת (2A דמויות ו2B), כמו גם כמה מקרים של זריקות לא מוצלחות (איורים 2C-2F). עם מחט זריקה בגודל כראוי, קצה המחט חודר את ציפורן הזחל עם התנגדות מינימאלית (איור 2 א), ופתרון dsRNA (הירוק) זורם לתוך הזחלים ללא כל דליפה (איור 2). אל, כפי שהוא יגרום יתר להזריק הצפה של פתרון dsRNA אפילו עם מחט זריקה בגודל כראוי (איור2C). אם קצה המחט דק מדי, קצה המחט לעתים קרובות לא מצליח לחדור לציפורן ועיקולי הזחל, מה שהופך את הזריקה הקשה (איור 2 ד). אם זה יקרה, זמירה קצה המחט לפעמים עוזר. מחטים גדולות יותר הן לעתים קרובות עדיין אפשריים לשימוש, אם כי בכמה קשיים בחדירה לציפורן הזחל (איור 2E). עם זאת, כמות גדולה של פתרון dsRNA נדחפה בקלות החוצה מהמחט אפילו עם לחץ קל על מזרק ההזרקה, לעתים קרובות וכתוצאה מכך גלישה של פתרון dsRNA (איור 2F). בעת ביצוע RNAi, זה חשוב שתהיה שליטה חיובית להעריך שRNAi פועל כראוי, וביקורת שלילית כדי לוודא שההשפעה שנצפתה היא לא השפעה הלא ספציפית של dsRNA או תוצאה של נהלי הזרקה (כגון פגיעה על ידי הזרקה, או חריגות מetherization). הזרקה של EYFP מיקוד dsRNA יכולה לשמש כטוב ביקורת חיובית בעת השימוש ב5,7 זן pu-11. כאשר EYFP dsRNA מוזרק בשלב הזחל האחרון, לירידה משמעותית באות EYFP בprimordia אגף העתיד ניתן לצפות כבר בהודעת יום זריקה אחת (איור 3 א). מציאה של EYFP הושלמה יומיים לאחר ההזרקה של EYFP dsRNA (איור 3 ב) ומציאה זו נמשכת דרך (3C הדמויות ו3D) שלב גלמים וכל אורך חיי החיפושית אם ריכוז dsRNA הוא גבוה מספיק (כגון 1 מיקרוגרם / μl) 7. גם EYFP dsRNA יכול לשמש כביקורת שלילית כפי שהוא רצף גן שאינו ממקור פנימי ולא צריך לגרום לשיבושים מורפולוגיים או פיסיולוגיים (ציורים A3-3D). אנחנו סיפקנו תמונות של RNAi זחל לשריד (טוב מאוד), גן אגף קריטי 12, כדוגמא נוספת לאופן EFfective טכניקת RNAi מבוסס הזרקה זה בט castaneum. כאשר dsRNA לVG מוזרק לתוך זחלי שלב הלפני אחרון (שלב אחד לפני שלב הזחל האחרון), אובדן של מבני האגף שלם ניתן לצפות בשלב גלמים (3E דמויות ו3F). מבוגרים וכתוצאה מכך גם חסרים לחלוטין מבני אגף (איורים 3G ו 3H). תוצאת RNAi לVG מדגימה הן את החוסן ואת האופי המערכתי של RNAi בט castaneum. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: דוגמאות (א) למחטים רצופים, טובות, ורעות (ב) קצה מחט טובה שבורה היטב (C) קצה מחט שבורה, כי הוא גדול ובוטה מדי (D) הקצה... של כל הקופה<html> מחט n דקה מדי. ברים סולם (אדום) הם 0.05 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:... () מחט זריקה בגודל כראוי מוכנסת לתוך זחל instar האחרון (B) זחל הזריק כראוי עם פתרון dsRNA הירוק (C) הצפה של פתרון dsRNA בנקודת ההזרקה נגרמת על ידי יתר ההזרקה (D ) מחט דקה שלא הצליחה לחדור לציפורן הזחל. (מחט זריקה גדולה מוכנסת לתוך זחל instar האחרון E). (F) זחל דקירה ממחט גדולה, וכתוצאה מכך הגלישה והדליפה של פתרון dsRNA. חצים מצביעים על המחטים.&quot;Target =&quot; ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: דוגמאות של RNAi המוצלח בט castaneum. הזרקת זחל האחרונה של תוצאות EYFP dsRNA בהפחתה של ביטוי EYFP (AD). גלמים () זחלי יום אחד לאחר הזרקה. (B) זחלי יומיים לאחר הזרקה. גלמים (C) בקרה. (ד &#39;) כתוצאה מ הזרקת הזחל EYFP dsRNA. הבקרות השליליות הן הזרקת חיץ (A, B) והזרקת dsRed dsRNA (C, D). ראשי החץ וחצים מצביעים על ביטוי EYFP או היעדרה בprimordia הכנף ועיניים, בהתאמה. (EH) פןהאולטימטיבי זחל RNAi לVG. (E) גולם Wild-type. (F) VG גולם RNAi. חוסר מבני אגף הוא כבר נראה לעין בשלב גלמים (חץ). G) מבוגר Wild-type. (H) VG מבוגר RNAi. מבני אגף הקשורים חסרים לחלוטין (חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...