Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
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私たちは技術的なサポートのためにマイアミ大学のバイオインフォマティクスやゲノム機能研究センター（CBFG）を感謝します。この作品は、マイアミ大学の起動許可（YT）、国立科学財団（：IOS 0950964 YT）によってサポートされていました。

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

<html> dsRNA分子の長さと濃度を含むRNAiの成功を保証するために考慮する必要がある重要な問題の数、異なるdsRNA分子間の競争（しようとした複数のノックダウン時）、およびオフターゲット効果の可能性があります（OTE）。 dsRNAは長 dsRNA分子の長さは、（dsRNAの長い上限は現在不明であるが）長いdsRNAがRNAiの7,14,15をトリガするために、より効率的であることで、全身のRNAi反応の効率に影響を与える。 dsRNAは長さがTに効果的なRNAiを誘導するために50塩基対よりも長いことが必要であるコクヌスト 7。 150 bpおよび500bpの間のdsRNAはRNAi実験のための理想的であるように思われる。長いdsRNA分子を用いることもできるが、それらはますます困難になるOTEの機会が増加し、遺伝子クローニング段階を有することになる。 dsRNAは濃度ve_content &quot;&gt;遺伝子ノックダウンの程度が異なるが、dsRNAの濃度に応じて実現することができる。を1μg/μlを頻繁に近いヌル表現型を生産するための妥当な出発濃度、であるように思われる（目的の遺伝子（群）によって異なる場合があります）。RNAiは、より強いRNAiの表現型を得るために、より高い濃度（ 例えば 、7〜8μgの/μl）を用いて行うことができる。dsRNAの段階希釈したRNAiは、時には低形質の表現型のシリーズを生成するために有益であることができる（寅泰の補足データら 2009年8、Borràs-カステル未発表データ）。 RNAiのコンクール複数遺伝子ノックダウンは、T.で達成することができる同時に、いくつかの異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。しかし、それはまた、生物内に存在するいくつかの異なるdsRNA分子を有することが多いのRNAiのコンポーネントにアクセスするためのdsRNA間の競争が生じることが知られている<s&gt; 7,14アップ。それは、一のdsRNA（他人を競合を回避するために、複数遺伝子ノックダウンを試みるときに、すべてのdsRNAは、同じ長さおよび同じ濃度を用いることが重要であるが、発現レベルが大きく間で異なる場合のdsRNAの長さおよび濃度の更なる調整が必要な場合が標的遺伝子）。私たちだけでなく、他の人は、成功した（ 例えば 、寅泰ら 、2005 16、寅泰ら 2009 17、およびYang ら 2009 18）ダブル、トリプルノックダウンを行った。実現可能なものの可能性が高いすべての4つの標的遺伝子のためのRNAi効率の有意な減少を引き起こすように、四重のRNAi（またはそれ以上）は、困難な場合があります。 オフターゲティング OTEは、RNAiベースのアプローチのための固有の問題である。 OTEを最小化する一つの方法は、dsRNAを設計する際にこれらの領域を他の遺伝子と類似の配列を共有する標的遺伝子内の領域を識別し、回避することである。 T.に対する単純なBLAST分析コクヌストの予測遺伝子セットは、そのような領域を識別することができます。いくつかのオンラインツールは、潜在的なOTE（ 例えば、E-RNAiの19）の評価を可能にする。標的遺伝子の2つの非重複領域のためのRNAiの実行は、表現型がOTEによって引き起こされる観察可能性を排除するための簡単​​で効率的な方法である。 （二つの非重複領域に類似の配列を共有しない限り）は、2つの非重複領域のため、RNAiは、同じ表現型を生成する場合OTEの可能性が最小化される。 表現型の解析以外の手段によって遺伝子ノックダウンの評価は、多くの場合、効果的に存在するRNAi関連のデータに重要である。遺伝子ノックダウンを評価するための二つの主要な方法は定量RT-PCRおよびウエスタンブロット分析である。定量RT-PCRは、標的mRNAのレベルを測定する便利な方法であり、T.のものを含む多くのRNAi関連の研究において使用されているコクヌスト （Miller らを参照してください。2012年7など）。しかし、それが私たちは最近、標的mRNAレベルはRNAiを（タンパク質産物が下方制御されているが）（Borràs-カステル未発表データ）によってアップレギュレートされているいくつかのケースを見てきたようにER、注意が、注意しなければならない。アップレギュレーションこのRNAiを誘発されたmRNAが広範囲または特定の遺伝子に特有のものができればそれは現在不明である。ウェスタンブロット分析は、遺伝子ノックダウンを確認するための別の方法である。それは最終タンパク質産物の量を測定するため、この方法は非常に信頼性があります。標的遺伝子のタンパク質産物に対して特異的な抗体の必要性は、このアプローチの欠点である。表現型分析に加えて、複数の独立した測定値を利用するのRNAiベースの分析によって得られた表現型データの信頼性を増加させる。 Tのその構想以来、 コクヌスト 、RNAiは、主に開発し、パターン形成において遺伝子機能を研究するために使用されてきた。これらのT。コクヌスト発達研究がCHARACで非常に成功している遺伝子の進化的に保存されており、分岐した機能をterizing（Denell 2008年及び2004クリングラー2に概説されている）。 Tのしかし、RNAiをベースの研究コクヌストは発生生物学に限定されるものではない。例えば、RNAiは、ストレス耐性、捕食、攻撃性、配偶者選択、活動パターン、および防御機構を含む、生理学的および行動反応、広範囲の遺伝子機能を研究するために利用することができる。 これらのコンテキストにRNAiを適用する一つの問題は、多面的効果の可能性である。多くの場合、目的の遺伝子は、Tを通じてさまざまな役割を持つことになりますコクヌストのライフサイクルは、このように困難な意図しない表現型効果なし遺伝子の除去を行う。しかし、簡単にステージの多様でRNAiを実行する能力は、多くの場合、これらの多面的な効果を回避するための有効な戦略であることができる。たとえば、代わりに幼虫や蛹の成人でRNAiを行うことは、私たちはUNINを回避できる可能性がある初期の開発中に遺伝子ノックダウンによって引き起こされる致死性を傾向があった。 TのRNAi応答の柔軟性コクヌストは、このように 、このモデルの生理学的および行動反応における遺伝子機能の実験にRNAiを適合させるための魅力的な選択肢となります。 T.コクヌストシステムはまた、教授の研究室での使用に最適です。T.コクヌストは、頻繁な継代培養せずに室温（25℃）で小麦粉/酵母混合物に容易に培養すること、およびT.におけるRNAi技術ができるコクヌストは若い、学習科学者と研究室に適応できるほど簡単である。 RNAiは、生物学のさまざまな分野において必須の技術になってきているように、学生は、この技術にさらされていることが重要です。 Tの幼虫のRNAi技術の直接的な性質コクヌストもTを作り、研究に関与することが、より多くの学生を奨励教室指向遺伝システムのための主要な候補をコクヌスト 。&lt;/ pの&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

コクヌストモドキ、 コクヌストは 、原因部分的には、RNA干渉（RNAi）1-3を実施するのしやすさに生物学のさまざまな分野で人気を集めています。のRNAiベースの遺伝子ノックダウン技術は、複雑な遺伝的方法を利用することなく、分析科学者が機能喪失を実行することを可能にする。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答、甲虫の体腔4-6に二本鎖RNA（dsRNA）の単純な注入を介して任意の段階でRNAiを実行することが可能となる。複数の遺伝子を同時にノックダウンTにも可能である同時に7,8に2つ以上の異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。また、低形質の表現型の一連の注入されたdsRNAの8の濃度を低下させることによって生成することができる。これらの機能は、Tの伝統的なフォワード遺伝学へのRNAiベースの逆遺伝学的手法魅力的な代替案を作るコクヌスト 。以来、事実上すべてのT.コクヌスト組織は、細胞外dsRNA分子9に感受性であり、この技術は、研究者が多様な状況における多種多様な組織を研究することを可能にする。また、このレポートでは、TにRNAiを行うに焦点を当てていたがコクヌスト 、ここで説明する多くの手順は、他の昆虫にも適用可能である。したがって、このプロトコルは、Tにおける興味のコンテキストで機能喪失を実行したい人のための有用な分析をされているコクヌスト 、ならびに他の昆虫へのRNAiベースの手法を適用を希望する研究者にとって。 幼虫へのdsRNAを注入すると、幼虫、蛹および成虫期4,5,10などの甲虫のライフステージのさまざまなで機能的な分析を可能にする。私たちは、以前に分子生物学の手順11を含む当社の全体的な幼虫のRNAiプロトコルを報告している。現在のレポートでは、最高のビジュアル側近で説明されていたdsRNA注入手順を記述するに焦点を当てる。私たちは、提供する詳細なステップバイステップの注入手順だけでなく、良い面と悪い面の射出例。この視覚的なプロトコルは、これまでのプロトコルを補完するものであり、組み合わせたときに、彼らはTに幼虫のRNAi手順のより包括的なビューを提供コクヌスト 。さらに、当社は、RNAi、生理学的研究のためのRNAiベースのアッセイのアプリケーションの成功だけでなく、教育の実験室での幼虫のRNAiプロトコルの適用性に影響を与える可能性dsRNA分子のパラメータについて説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

コクヌストモドキ、 コクヌストは 、完全に注釈付きのゲノム配列、トランスポゾン遺伝子導入し、効果的なRNA干渉（RNAi）を含む、遺伝学的および発生研究のための実験的なツールのレパートリーを提供しています。これらの利点の中でも、RNAiをベースの遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にある。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答は、単に甲虫の体腔内に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することによって、任意のライフステージでのRNAiを実行することが可能となる。 本稿では、Tにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明しますコクヌスト 。プロトコルは、Tの適切な段階は、（i）単離を含み注射のためのコクヌスト幼虫 、噴射セット用（ii）の準備、および（iii）のdsRNA注入。幼虫RNAiは、機能喪失phenotypにすばやくアクセスを提供してくれ、シンプルでありながら強力なテクニックです複数の遺伝子ノックダウン表現型だけでなく、低形質の表現型のシリーズを含むES、。事実上すべてのT.以来コクヌスト組織は細胞外dsRNAの影響を受けやすい、幼虫のRNAi技術は、研究者は外部環境への生物の応答の遺伝的基礎を含む多様な文脈での多種多様な組織を研究することができます。また、この技術の単純さは、T.を作り、研究のより学生の関与を刺激教室の設定で使用するための理想的な遺伝システムをコクヌスト 。

成功した注射のための重要なステップの一つは、良好な針を作ることです。ステップ6で説明したように、針の先端が前T.を注入により破壊される必要があるコクヌスト 。良い及び悪い針の例としては、 図1に示されている。良い針は0.05mm程度の直径の開口（ 図1B）と、鋭利な硬い先端を有する。 図2は、成功した注射（ 図2Aおよび2B）だけでなく、失敗した注射剤（ 図2C-2F）のいくつかのケースを提示します。適切なサイズの注射針と、針の先端は、最小の抵抗（ 図2A）と幼虫のクチクラを貫通し、およびdsRNA溶液（緑色）は、任意の漏れ（ 図2B）ことなく幼虫に流れ込む。それも適切なサイズの注射針とのdsRNA溶液をオーバーフロー（ 図原因になりますように、過剰注入しないでください2C）。針の先端が薄すぎると、ニードルチップは、多くの場合（ 図2D）注射が困難で、幼虫のキューティクルと屈曲部を貫通することができない。この問題が発生した場合、トリミングニードルチップは、時には役立ちます。大きな針は幼虫のクチクラ（ 図2E）を貫通するいくつかの困難はあるものの、多くの場合、まだ使用可能である。しかしながら、dsRNAの溶液を大量に容易しばしばdsRNAの溶液（ 図2F）のオーバーフローを生じるとしても注射器にわずかな圧力で針から押し出される。 RNAiを行う場合は、観察された効果は、dsRNAの非特異的効果、又は引き起こされる損傷のような注射手順（の結果ではないことを確認するためにRNAiが正常に動作していることを評価するための陽性対照、および陰性対照を有することが重要である注射、またはエーテル麻酔からの異常）による。 EYFPを標的とするdsRNAの注射は、としての役割を果たすことができる良い陽性対照PU-11株 5,7を使用した場合。 EYFP dsRNAは、最後の幼虫に注入されると、将来の翼原基におけるEYFPシグナルの有意な減少が、早くも1日後噴射（ 図3A）として観察することができる。 EYFPのノックダウンは、dsRNAの濃度は1など（十分に高い場合蛹（ 図3C及び3D）を通って、カブトムシの一生持続する二日EYFPのdsRNA（ 図3B）を注入し、このノックダウンした後に完了したμgの/μl）を、非内因性遺伝子配列であり、形態学的または生理学的混乱（ 図3A〜3D）を引き起こすべきではない7。EYFP dsRNAは、陰性対照としても使用することができる。 私たちは、どのようにEFの別の例として、 痕跡（VG）のための幼虫RNAiの画像、クリティカル翼遺伝子12を提供したこの注射ベースのRNAi技術はTにあるfective コクヌスト 。 VGのためのdsRNAは最後から二番目の段階の幼虫（最後の幼虫期の前に1段目）に注入されると、翼構造体の完全な喪失は、蛹（ 図3Eおよび3F）で観察することができる。その結果、大人にも完全に翼構造（ 図3Gおよび3H）を欠いている。 VGのためのRNAiの結果は堅牢性とT.におけるRNAiの全身の両方の性質を例示しているコクヌスト 。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：切れ目のない良い、悪い針の（A）（B）としてはよく壊れた良い針の先端（C）が大きすぎると鈍いです壊れた針の先端（D）の先端。損紙の<html>薄すぎる、n個の針。スケールバー（赤色）は0.05ミリメートルである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> 図2：（A）A、適切なサイズの注射針は、終齢幼虫に挿入された（B）幼虫が適切に緑色のdsRNA溶液を注入した（C）過剰注入による注入点でのdsRNA溶液のオーバーフロー（D ）幼虫クチクラに浸透することができない細い針を。（E）終齢幼虫に挿入された大規模な注射針。（F）幼虫は、オーバーフローおよびdsRNA液の漏れ、その結果、大規模な針で注入した。矢印は、針を示している。ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> 図3：T.で成功したRNAiの例コクヌスト。（AD）EYFP 発現の減少におけるEYFPのdsRNA結果の最後の幼虫注入。から得られる（A）幼虫注射後1日である。（B）幼虫二日注射後。（C）コントロール蛹。（D）蛹幼虫EYFPのdsRNA注入。陰性対照は緩衝液インジェクション（A、B）およびDsRedの dsRNAの注入（C、D）である。矢頭および矢印は、EYFPの発現を示すか、それぞれ、翼原基と目にその欠如。（EH）ペンVGのための究極の幼虫のRNAi。（E）野生型蛹。（F）VGのRNAi蛹。翼構造の欠如は、蛹（矢印）。G）野生型の大人。（H）VGたRNAi成人ですでに表示されている。ウィング関連構造が完全に（矢印）が欠落している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。

レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、<em&gt;コクヌストモドキ</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

生物学

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

RNA 干渉法の活用: ゴキブリのリポソーム キャリアで二本鎖 RNA の経口デリバリー

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

パインウッド線虫、ブルサフェレンコス・キシロフィルスにおけるRNA干渉の応用

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌資源の探索

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:森林ウッドボーラーの生物的防除アプリケーションのための野生の Monochamus alternatus 個体群における昆虫病原性真菌の評価

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...