Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Vi takker Senter for Bioinformatikk og Funksjonell genomforskning (CBFG) ved Miami University for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av Miami University etablererstipend (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

1. T. castaneum Aksjer og dyrking <ol><li> Bestem deg for en T. castaneum belastning å bruke for eksperimentet. MERK: Flere lab-etablert T. castaneum stammer er tilgjengelige. Ga-1 (Georgia-1) er foreldre stamme av Ga-2 som ble anvendt for sekvensering 3 genomet. Siden Ga-1 aksjer de fleste DNA polymorfismer (som single nucleotide polymorphisms, SNPs) med Ga-2, og er sunnere enn Ga-2 på grunn av mindre innavl, er det ideelt for RNAi eksperimenter. Pu-11 er en annen praktisk belastning å bruke , som sin unike forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) uttrykk i fremtiden fløyen primordia tillater oss å skille den siste larve instar fra andre instars (se Figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12). Det er viktig å dokumentere hvilke bille stamme ble benyttet i forsøket, som genetiske bakgrunn synes å betydelig affect RNAi fenotyper 13. </li><li> Forbered T. castaneum mel kultur ved tilsetning av 5% (beregnet på vekt) av pre-siktet ølgjær organisk hel-hvetemel (etter blanding, oppbevare kulturen mel ved -20 ° C). Alikvot av kulturen mel (ved romtemperatur) i 6 ml plastflasker (Drosophila arkiv omtrent 40 g / flaske). </li><li> Kultur T. castaneum ved 30 ° C med 70% fuktighet. Bruk en fuktighetskontrollert inkubator hvis mulig. Legg 30-40 voksne per kultur flaske (mann: kvinne ratio 1: 1) for å starte kultur. MERK: Selv om formen er sjelden et problem ved 30 ° C, lavere temperaturer (for eksempel 25 ° C) med 70% fuktighet kan føre til muggvekst i kulturen mel. Senk fuktigheten hvis dette skjer. </li><li> Overfør de voksne til en ny kultur flaske annenhver uke for subculturing (se trinn 5.2 til 5.5 for hvordan du isolerer voksne fra kultur mel). MERK: Det tar omtrent tre uker å få tak i den siste stadium larver. Alternatsvis, T. castaneum kulturer kan holdes på en lavere temperatur (20-25 ° C), men med et større dyrkning periode (utviklings tid ved 25 ° C er omtrent dobbelt så høy som ved 30 ° C). </li></ol> 2. Utarbeidelse av løsninger og Instrumenter for Larve dsRNA Injection <ol><li> Syntetisere dsrna molekyler homologe til målgenet ved in vitro transkripsjon. Oppbevar ved -80 ° C. Se Philip og Tomoyasu 2011 11 for detaljerte molekylærbiologiske prosedyrer. Se også diskusjon for en rekke parametere som må vurderes ved utforming dsrna molekyler. </li><li> Lag 10 ml 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,6 ved 25 ° C) ved å blande 8,5 ml av 1 M Na HPO 2 4 med 1,5 ml 1 M NaH 2 PO 4. Sjekk pH med et pH-meter og justere deretter. </li><li> Lag 1 ml av 10x injeksjonsbuffer ved blanding av 10 pl 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,6 ved 25 ° C), 100 _6; l på 0,5 M KCl, 100 mL av grønn mat fargestoff, og 790 mL av dobbel-destillert vann (DDH 2 O). Fortynne 10x injeksjon buffer for å lage 2x injeksjon buffer (200 mikroliter 10x injeksjon buffer + 800 mL DDH 2 O). Oppbevar både 10x og 2x injeksjon buffere ved 4 ° C inntil nødvendig. </li><li> Forbered Sticky Glass Slides. <ol><li> Dekke en hel glass lysbilde med en form for avtagbart lim for larve injeksjoner. For voksne eller pupal injeksjoner, lage to tynne strimler av lim langs lengre kantene av raset. </li><li> La limet tørke i flere dager, noe som sikrer at limet forblir klebrig nok til å overholde biller til raset, mens også rester Myk nok til å lette deres fjerning etter injeksjon. MERK: Hvis limet holder for klissete, kan du bruke en finger og trykk på lim, noe som vil redusere klebrighet. Hver side kan holde opp til 40 eller 50 biller, og kan gjenbrukes til den ikke klarer å sikkert holde dyrene. Alternatively kan dobbeltsidig tape også benyttes, selv om båndet er noen ganger ikke klebende nok til å holde larvene. </li></ol></li><li> Gjør en Etherization Basket. <ol><li> Fjern stempelet fra en 10 ml engangssprøyte og kuttet sprøyten i halvparten rundt 6 ml linje. </li><li> Kast den nederste halvdelen av sprøyten. Kort varme snittflaten av den øverste del av sprøyten med en gassbrenner, og raskt å presse den smeltede plast bort på et stykke nylonmesh for å lime mesh på sprøyten. Klippe bort overflødig mesh Når plasten stivner. </li></ol></li><li> Forbered eteren flaske. Tilsett 30 ml ether til en smal munn-100 eller 250 ml glassflaske. Legg flere stykker av silkepapir for å øke fordampningen av eter. MERK: Ether presenterer en brannfarlig og er også skadelig. Håndter alltid eter under en avtrekkshette. Lukk lokket tett mens den ikke er i bruk. MERK: is kan brukes som et sikrere alternativ (for eksempel i en klasse), selv om sedation er mindre effektive. </li></ol> 3. Utarbeidelse av Larve Injection Apparatus <ol><li> Legg inn en XY mekanisk plattform på en disseksjonsmikroskop. MERK: XY mekanisk stadiene er tilgjengelig fra store mikroskop selskaper. Alternativt kan billig mikroskop stadier også brukes for de fleste dissecting mikroskop med noen modifikasjoner (se Materialer tabell for eksempel). </li><li> Plasser en mekanisk nål manipulator nær XY mekanisk scenen. </li><li> Monter en injeksjonssprøyte. Bruk en fire-veis stoppekran (med Luer-forbindelser) for å koble en 30 ml engangssprøyte til en glass nålholderen, slik at manipulering av injeksjonssprøyten uten å påvirke trykket i injeksjonsnålen (se Philip og Tomoyasu 2011 11 for den detaljerte injeksjonssprøyte montasje). </li></ol> 4. Pulling kanyler <ol><li> Trekk borsilikatglass nåler (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lengde) av ennål avtrekker. MERK: For Sutter P-87 eller P-97, bruker du innstillingen &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tid = 90&quot; eller følge kapittel 2 i Pipette Cookbook: Heft Cell, C. elegans, Drosophila, og Sebrafisk - Anbefalt programmer. Optimale innstillinger varierer avhengig av hvilken modell av nålen avtrekker. Innstillingen for en generisk Drosophila kanyle er et godt utgangspunkt. </li><li> Butikken trakk nåler i en plasteske (f.eks en plast CD-etui) og fest med avtagbar montering kitt. </li></ol> 5. Isolasjon og utvelgelse av Larver <ol><li> Plasser en # 25 sil på en sil mottaker. </li><li> Plasser innholdet i flasken kultur (biller og kultur mel) på sikten, og sile innholdet umiddelbart. Ikke la innholdet på sil uten sikting, som larver vil raskt prøve å grave gjennom silen og blir sittende fast. Aggressivt sile innholdet å la melet fallgjennom og la eldre larver (vanligvis 6. og 7. instar larver), puppe og voksne (sammen med sine støpte-off neglebåndene, exuviae) bak på toppen av sil. </li><li> Overfør de resterende på sil (biller og exuviae) til frøet pan materialer. Fortsett å banke på pannen for å hindre at biller rømmer. </li><li> Fjern exuviae og de mel-partikler som er igjen på overflaten av billene ved forsiktig blåser over frøet pan. </li><li> Trykk frøet pan å flytte innholdet til bunnen av kjelen. Deretter la pannen uutnyttet i flere sekunder. Vent til de voksne, som er mer mobile enn andre stadier, for å komme ut fra bunken. Fjern voksne ved hjelp av en art pensel (f.eks 1 cm bredde). </li><li> Separat puppe ved forsiktig å banke på frøet pannen samtidig holde munningen av kjelen litt nedover, så puppe en tendens til å rulle raskere mot munningen. Bruk en pensel til å fjerne puppe, slik at bare larver på frøet pan. </li><li> Pless isolert larver i en ren petriskål. Velg et passende stadium av larver for injeksjon og plassere dem i en egen petriskål. MERK: Tidlig i forrige stadium larver (1-2 dagen etter den siste larve molt) er ofte egnet når analysere RNAi effekt på voksne morfologi samt på metamorfose. Det er imidlertid noen ganger nødvendig å utføre RNAi på den nest siste (eller enda tidligere) trinn for å evaluere tidlig gen-funksjon (for eksempel, figur 3E-3H. Også se Clark-Hachtel et al. 2013 12). Bruk puppe som en referanse for å identifisere størrelsen av instar larver. Den siste instar larver er litt lengre enn puppe. Alternativt kan pu-11 brukes til å identifisere den siste instar larver, så vel som for å bestemme tidsforløpet for utvikling av siste stadium larver (figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12). </li><li> Behold den merkede larver i en petriskål til etherization. Plasser restenlarver og andre stadier av biller (som puppe og voksne) tilbake i en kultur flaske med mel og returnere det til inkubatoren. </li></ol> 6. Utarbeidelse av kanyler <ol><li> Plasser en tidligere trukket glass nålen på et objektglass ved hjelp av enten klebrig tack eller dobbeltsidig tape. Bruk pinsett, teste trakk enden av nålen mens du ser gjennom dissekere mikroskop for å se hvor de tips svinger. Grab området litt mot tuppen siden av der nålen svinger med pinsett og vri for å bryte. </li><li> Beholde gode nåler og forkaste andre. Betrakt en god nål som har en åpning som er verken for stor eller for liten (ca. 0,05 mm diameter. Figurene 1A og 1B), og er vinklet for å gjøre gjennomtrengning av larve hårstråene lettere (figurene 1B og 2A-2B). Betrakt en dårlig nål som (i) er for liten, noe som gjør opptak av dsRNA-løsning inn i nålen diffikult (trinn 7) (figurene 1D og 2D), (ii) er for stor, noe som fører larveskade og mulig dødelighet ved injeksjon (figurene 1C og 2F), (iii) butt, slik at gjennomtrengning av hårstråene vanskelig og øker skade. </li><li> Sett Needle nålholderen inn. <ol><li> Først skru tuppen av nålen holderen og legg tilbake enden av nålen inn i holderen spissen. Deretter plasserer gummipakningen under holderen spissen (minst 1 cm fra bakenden av glasset p). </li><li> Sett på baksiden av nålen inn i holderen, med gummipakningen satt helt inn i åpningen av nålholderen. Skru spissen tilbake på holderen. </li></ol></li><li> Plasser den sammensatte nålholderen på nålen manipulator. Hold nålen holder horisontalt. Justere posisjonen til manipulatoren, slik at spissen av nålen er plassert i sentrum av den oppfatning når man ser igjennom MICRoscope. </li></ol> 7. frontloading dsRNA løsning i Needle <ol><li> Klargjør dsRNA injeksjonsløsningen like før injeksjon ved å justere konsentrasjonen med DDH 2 O, og å blande den dsRNA-løsning med like volumer av 2x injeksjon buffer (trinn 2.3). Hold den blandede oppløsningen på is. Se diskusjon om dsRNA konsentrasjon. </li><li> Skjær tuppen av en 20 mL engangspipette tips. Pipetter 10 mL av løsningen i den trimmede pipettespissen. Fjern forsiktig pipettespissen fra pipetten samtidig holde fluidet på spissen ved å tilveiebringe mottrykk. Alternativt, fjern forsiktig spissen og deretter flytte løsningen til enden av spissen ved å tilveiebringe trykk ved bruk av en finger. </li><li> Plasser pipettespissen med dsRNA løsning på objektbord ved hjelp av klebrig klebe med åpningen som vender mot spissen av nålen. </li><li> Ser gjennom mikroskop, beveg lastet mot spissen av nålen inntil spissen avnålen befinner seg i den innlastede pipettespissen og inn i løsningen. </li><li> Mens du ser gjennom mikroskop, trekk forsiktig tilbake på stempelet av injeksjonssprøyten å sakte trekke dsRNA løsningen inn nålen. MERK: Du må ikke over nålen. Etter hvert som enden av dsRNA-løsning nærmer seg spissen av nålen, redusere frekvensen av holdningen og stoppe last løsningen før spissen av nålen vil nå luft. Hvis luften når spissen, vil løsningen bli hurtig trukket inn i nålholderen, noe som resulterer i alvorlige forurensningsproblemer. Detaljerte rengjøringsprosedyrer nålholderen er beskrevet i Philip og Tomoyasu 2011 11. </li><li> Fjern trykket fra injeksjonssprøyten og nåleholderen ved å åpne stengeventilen. Deretter flytter pipettespissen bort fra spissen av nålen. Hev nålen opp fra scenen for å hindre utilsiktet skade nålen mens plassere larvene på scenen. Fjern tømt pipettespissen fra scenen. </li></ol&gt; 8. dsRNA Injection <ol><li> Plasser larvene inn i etherization kurv. Bruk mindre enn 10 larver hvis lære teknikken. Bruk 30-40 larver i en runde gang komfortabel med teknikken. </li><li> Plasser kurven med larver i eter flasken og lukker lokket. MERK: Ether presenterer en brannfarlig og er også skadelig. Utfør dette trinnet under en avtrekkshette. </li><li> Etherize larver i ca 3 min. Sjekk larvene for bevegelse etter 3 min. Plasser dem tilbake i eter flaske for en annen 30 sek hvis de fremdeles i bevegelse. Ikke etherize for mer enn 5 min, da dette kan øke dødelighet. MERK: Den optimale etherization tid kan variere avhengig av temperatur og luftfuktighet. </li><li> Overfør etherized larver fra kurven til det ikke-klebrige kanten av en glass klebrig lysbilde. Bruk pinsett og mens du ser gjennom mikroskop, plukke opp hver larver én etter én, og plassere dem på lysbildet. Legg dem sidelengs og banke forsiktig ned kroppen sin fROM hode til hale med pinsett, litt å strekke dem som du går, for å sørge for at de er sikret på lysbildet. </li><li> Plasser den klebrige lysbilde med larver på mikroskopet scenen. </li><li> Sett dsRNA lastet nålen forsiktig inn i ryggsiden av larvene å unngå skade på CNS. Også unngå ryggmidtlinjen, som larve hjerte ligger her. I dette og etterfølgende trinn, alltid bruke stadium å bevege larvene til nålen (i stedet for ved hjelp av nålen manipulatoren for å bevege nålen). MERK: Den spesifikke injeksjonsstedet spiller ingen rolle som RNAi i T. castaneum synes å være systemisk. Imidlertid er det vanligvis enklest å injisere inn i den dorsale side av toraks eller abdominale segmenter. </li><li> Etter innsetting av nålen inn larvene, trekk nålen litt tilbake for å gi plass til dsRNA å gå inn i larve kroppens hulrom. </li><li> Trykk forsiktig på injeksjonssprøyten før larvene sving grønn (eller fargen av injeksjonsbuffer) og se stretched og full. MERK: Hvis lære teknikken, prøve å injisere så mye som mulig for å bestemme mengden av løsning som kan injiseres i en larve uten betydelig dødelighet. Det er generelt omtrent 0,5 til 0,7 mikroliter. </li><li> Fjern nålen fra larvene. Mens kanylen fjernes, litt dra tilbake på injeksjonssprøyte for å unngå dsRNA tap (også være forsiktig med å trekke inn luft). </li><li> Injisere alt larver på lysbildet. Sørg for å fjerne larver som ikke ble riktig injisert. Komplett injeksjon før larver våkne opp (i ca 10 min). </li><li> Fjern lysbildet med injisert larver fra injeksjons mikroskop og forlate lysbildet for 5 mer min før alle larver gjenopprette fra etherization. </li><li> Med pinsett og under et dissekere mikroskop, forsiktig løft larvene fra hode til hale for å frigjøre dem fra den klebrige lysbildet. Plasser den nylig utgitte larver i en ren petriskål. La larvene på petriskål i 10-15 min for å tillate injeksjon wound å koagulere. </li><li> Plasser larvene til en ny flaske med rent hvetemel og etiketten hensiktsmessig herunder belastning navn, type dsRNA injiseres, konsentrasjonen av dsRNA, antall larver injisert, og datoen. </li><li> Kultur den injiserte larver ved 30 ° C med 70% fuktighet. Observere larvene for RNAi fenotyper regelmessig. MERK: Den siste stadium larver forpupper seg innen 7 dager. Deretter vil puppe Eclose inn voksne etter 7 dager (hvis det ikke er unormalt i timing forårsaket av RNAi). </li></ol> 9. Bekreftelse på Knockdown og fenotypisk Analyser <ol><li> Vurdere å vurdere effektiviteten av RNAi slå ned av flere forskjellige molekylærbiologi teknikker, for eksempel kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) og western blotting. Se Miller et al. 2012 7 og Philip og Tomoyasu 2011 11 for detaljert qPCR og Western Blot protokollen, henholdsvis. </li><li> Analyser RNAi relaterte fenotyper. MERK: RNAi relatertfenotyper kan observeres på en rekke forskjellige stadier, og under forskjellige dyrkningsbetingelser, avhengig av de gener som er målrettet. RNAi kan påvirke bille morfologi, metamorfose, fysiologi og atferd. Hvor ofte tilstedeværelse av fenotype er kontrollert og under hvilke betingelser billene er alet opp bør tilpasses de konkrete spørsmålene som undersøkes gjennom RNAi. </li></ol>

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

<html> Det finnes en rekke viktige problemstillinger som må vurderes for å garantere suksess for RNAi, inkludert lengden og konsentrasjon av dsrna molekyler, konkurranse mellom ulike dsrna molekyler (når man prøver flere slå ned), og muligheten for Off-target Effects (OTE). dsRNA Lengde Lengden dsrna molekyler påvirker effektiviteten til systemisk RNAi respons, med en lengre dsRNA være mer effektiv til å utløse RNAi 7,14,15 (selv om lengre grense på dsRNA er for tiden ukjent). Den dsRNA lengde må være lenger enn 50 bp å indusere effektive RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellom 150 bp og 500 bp synes å være ideell for RNAi eksperimenter. Men lengre dsrna molekyler kan også brukes, vil de ha en økt sjanse for OTE og gene-kloning skritt vil bli stadig vanskeligere. dsRNA Konsentrasjon ve_content &quot;&gt; Forskjellige grader av genet knockdown kan oppnås, avhengig av konsentrasjonen av dsRNA. 1 ug / mL synes å være en rimelig utgangskonsentrasjon, noe som ofte gir en nær-null-fenotype (kan variere avhengig av gen (er) av interesse ). RNAi kan utføres med en høyere konsentrasjon (f.eks, 7-8 pg / mL) for å oppnå en sterkere RNAi fenotype. RNAi med en seriell fortynning av dsRNA kan noen ganger være fordelaktig å produsere en serie av hypomorphic fenotyper (Supplemental Data Tomoyasu et al. 2009 8, og Borras-Castells upubliserte data). RNAi Competition Multiple genet knockdown kan oppnås i T. castaneum ved å injisere flere forskjellige dsrna molekyler samtidig. Imidlertid er det også kjent at det å ha flere forskjellige dsrna molekyler tilstede i organismen ofte resulterer i konkurranse mellom dsRNAs for tilgang til RNAi komponenter <sopp&gt; 7,14. Det er viktig å bruke samme lengde og samme konsentrasjon for alle dsRNA når du forsøker flere genet knockdown for å unngå en dsRNA ut-konkurrerer de andre (selv om ytterligere tilpasninger av dsRNA lengde og konsentrasjon kan være nødvendig når uttrykket nivåer variere sterkt blant målet gener). Vi, så vel som andre, er med hell utført dobbelt og tredobbelt knockdown (f.eks Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, og Yang et al. 2.009 18). Selv om mulig, firedoble RNAi (eller mer) kan være utfordrende, ettersom det vil sannsynligvis føre til betydelig reduksjon av RNAi effektivitet for alle fire mål gener. Off-målretting OTE er en iboende interesse for RNAi-baserte tilnærminger. En måte å redusere OTE er å identifisere regioner i målgenet med likeartede sekvenser med andre gener og unngå disse regionene ved utformingen av dsRNA. En enkel BLAST analyse mot T. castaneum spådd genet sett kan identifisere slike regioner. Flere online-verktøy også tillate evaluering av potensielle OTE (f.eks E-RNAi 19). Utføre RNAi for to ikke-overlappende regioner av målgenet er en enkel og effektiv måte å eliminere muligheten for at observert fenotyper er forårsaket av OTE. Muligheten for OTE minimaliseres hvis RNAi i to ikke-overlappende regioner produsere de samme fenotyper (med mindre de to ikke-overlappende regioner har en tilsvarende sekvens). Vurderer genet knockdown av andre enn fenotypiske analyser midler er ofte avgjørende for å effektivt presentere RNAi relaterte data. To store måter å evaluere genet knockdown er QRT-PCR og Western blot analyse. QRT-PCR er en praktisk måte for å måle nivået av mål-mRNA, og har vært brukt i mange RNAi-relaterte studier, inkludert de i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howeveh, må man vise forsiktighet, slik vi nylig har sett noen tilfeller der målet mRNA nivå er oppregulert ved RNAi (selv om proteinproduktet er nedregulert) (Borras-Castells upubliserte data). Det er foreløpig ukjent om dette RNAi indusert mRNA oppregulering kan være utbredt eller unikt for visse gener. Western blot-analyse er en annen måte for å bekrefte genet knockdown. Denne metode er ganske pålitelig som den måler mengden av det endelige proteinprodukt. Kravet til et spesifikt antistoff mot proteinproduktet av målgenet er en ulempe for denne tilnærming. Utnytte flere uavhengige målinger i tillegg til fenotypeanalyser vil øke tilliten til de fenotypiske data innhentet av RNAi-baserte analyse. Siden unnfangelsen i T. castaneum, RNAi har primært blitt brukt til å studere gen-funksjon i utvikling og mønster formasjon. Disse T. castaneum utviklingsstudier har vært svært vellykket i characterizing evolusjonært konservert og sin retning funksjoner av gener (anmeldt i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserte studier i T. castaneum er ikke begrenset til utviklingsbiologi. For eksempel kan RNAi bli anvendt for å studere genfunksjon i et vidt spekter av fysiologiske og adferdsmessige responser, inkludert stresstoleranse, predatorer, aggresjon, mate valg, aktivitetsmønstre, og forsvarsmekanismer. En vanskelighet for å bruke RNAi til disse sammenhenger er sannsynligheten for mitogen effekt. Ofte vil gener som er av interesse har en rekke roller i hele T. castaneum livssyklus, og dermed gjøre fjerning av gener uten utilsiktede fenotypiske effekter vanskelige. Imidlertid kan muligheten til å enkelt utføre RNAi på en rekke scener ofte være en effektiv strategi for å unngå disse mitogen effekt. For eksempel kan utføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillate oss å omgå unintendens dødelighet forårsaket av genet knockdown under tidlig utvikling. Fleksibiliteten av RNAi respons hos T. castaneum dermed gjør denne modellen et attraktivt valg for å tilpasse RNAi til eksperimenter av gen-funksjon i fysiologiske og atferdsmessige responser. T. castaneum systemet er også ideell for bruk i en pedagogisk laboratorium. T. castaneum kan være enkelt dyrket på en mel / gjær blandingen ved romtemperatur (25 ° C) uten hyppig subculturing, og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til å tilpasses til et laboratorium med unge, lærings forskere. Som RNAi blir en viktig teknikk i en rekke biologiske felt, er det avgjørende at studentene blir utsatt for denne teknikken. Den rett-frem natur larve RNAi teknikk i T. castaneum også oppfordrer flere studenter til å være involvert i forskning, noe som gjør T. castaneum en førsteklasses kandidat for et klasserom orientert genetisk system. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Den røde mel bille, Tribolium castaneum, blir stadig mer populært i ulike felt av biologi skyldes delvis den enkle å utføre RNA interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserte genet knockdown teknikker tillate forskere å utføre tap-av-funksjonen analyserer uten å benytte komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert trinn ved enkel injeksjon av dobbelt-trådet RNA (dsRNA) i billens kroppshulrommet 4-6. Samtidig knockdown av flere gener er også mulig i T. castaneum ved å injisere to eller flere forskjellige dsrna molekyler på samme tid 7,8. I tillegg kan en rekke hypomorphic fenotyper bli generert ved å redusere konsentrasjonen av injisert dsRNA 8. Disse funksjonene gjør RNAi-baserte omvendt genetiske teknikker attraktive alternativer til tradisjonelle termin genetikk i T. castaneum. Siden nestenalle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulære dsrna molekyler 9, denne teknikken gjør det mulig for forskere å undersøke et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger. I tillegg, selv om denne rapporten fokuserer på å utføre RNAi i T. castaneum, mange prosedyrer som er beskrevet her gjelder for andre insekter. Derfor er denne protokollen nyttig for de som ønsker å utføre tap-av-funksjon analyser i sine sammenhenger av interesse i T. castaneum, så vel som for forskere som ønsker å anbringe et RNAi-basert teknikk til andre insekter. Injisering dsRNA til larver tillater funksjonell analyse på en rekke bille livsstadier, inkludert larve, pupal, og adulte stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapportert vår generelle larve RNAi protokollen inkludert molekylærbiologi prosedyrer 11. I dagens rapport, har vi fokus på å beskrive dsrna injeksjonsprosedyrer, som er best forklares med visuelle medhjelpere. Vi tilbyrdetaljerte steg-for-trinn-injeksjon prosedyrer samt gode og dårlige injeksjon eksempler. Denne visuelle protokollen utfyller vår forrige protokoll, og kombinert, gir de en mer helhetlig syn på larve RNAi prosedyrer i T. castaneum. Videre diskuterer vi parametere for dsrna molekyler som kan påvirke suksess for RNAi, anvendelse av RNAi-baserte analyser for fysiologiske undersøkelser, så vel som anvendelsen av larve RNAi protokollen i et laboratorium undervisningen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Den røde mel bille, Tribolium castaneum, og tilbyr et repertoar av eksperimentelle verktøy for genetiske og utviklingsstudier, inkludert et fullt annotert genomsekvens, transposon baserte transgenesis, og effektiv RNA interferens (RNAi). Blant disse fordelene, RNAi-baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert stadium i livet ved ganske enkelt å injisere dobbelt-strenget RNA (dsRNA) i billens kroppens hulrom. I denne rapporten gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering av det riktige trinn i T. castaneum larvene for injeksjon, (ii) forberedelse for injeksjon innstilling, og (iii) dsRNA injeksjon. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir oss rask tilgang til tap-av-funksjon phenotypes, inkludert flere genet knockdown fenotyper samt en rekke hypomorphic fenotyper. Siden nesten alle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulær dsRNA, tillater larve RNAi teknikken forskere for å studere et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger, inkludert den genetiske basis for organisme responser til det ytre miljø. I tillegg, enkelhet av denne teknikken stimulerer flere elev engasjement i forskning, noe som gjør T. castaneum en ideell genetisk system for bruk i et klasserom setting.

En av de viktigste trinnene for vellykket injeksjon er å gjøre en god nål. Som beskrevet i trinn 6, spissen av nålen må brytes før injisering T. castaneum. Eksempler på gode og dårlige nåler er vist i figur 1. En god nål har en skarp spiss og stiv, med en omtrent 0,05 mm diameter åpning (figur 1B). Figur 2 viser en vellykket injeksjon (figurene 2A og 2B), så vel som flere tilfeller av mislykkede injeksjoner (figur 2C-2F). Med en riktig størrelse injeksjonsnål, nålespissen trenger inn i larve hårstråene med minimal motstand (figur 2A), og dsRNA-løsning (grønn) strømmer inn i larver uten noen lekkasje (figur 2B). Ikke over injisere, da det vil føre overløp av dsRNA løsning selv med en riktig størrelse kanyle (Figur2C). Hvis spissen av nålen er for tynt, nålespissen ofte ikke klarer å trenge gjennom larve hårstråene og svinger slik at injeksjonen vanskelig (figur 2D). Hvis dette skjer, noen ganger hjelper trimming nålespissen. P er ofte fortsatt brukbart, om enn med noen vanskeligheter i å trenge inn i larveskjellaget (figur 2E). Det er imidlertid en stor mengde av dsRNA-løsning lett skyves ut fra nålen selv med et lett trykk på injeksjonssprøyten, hvilket ofte resulterer i en overflyt av dsRNA-løsning (figur 2F). Ved utføring av RNAi, er det viktig å ha en positiv kontroll for å bedømme at RNAi virker på riktig måte, og en negativ kontroll for å verifisere at effekten observeres er ikke en ikke-spesifikk effekt av dsRNA eller en konsekvens av injeksjonsprosedyrer (for eksempel skade forårsaket ved injeksjon, eller abnormitet fra etherization). Injeksjon av dsRNA målretting EYFP kan tjene som engod positiv kontroll ved hjelp av pu-11 strekk 5,7. Når EYFP dsRNA blir injisert i den siste larvestadiet, kan en betydelig reduksjon i EYFP signal i fremtiden vinge primordia observeres så tidlig som en dag etter injeksjon (figur 3A). Den knockdown av EYFP er fullført to dager etter injeksjon av EYFP dsRNA (figur 3B), og dette vedvarer knockdown gjennom pupal stadium (figur 3C og 3D), og gjennom hele livet av billen hvis dsRNA-konsentrasjonen er høy nok (eksempel 1 mikrogram / ​​mikroliter) 7. EYFP dsRNA kan også bli brukt som en negativ kontroll som det er en ikke-endogene gen sekvensen og bør ikke forårsake morfologiske og fysiologiske forstyrrelser (figurene 3A-3D). Vi følger bilder av larve RNAi for tilbakedannet (VG), en kritisk vinge gen 12, som et annet eksempel på hvordan effektive denne injeksjon basert RNAi teknikken er i T. castaneum. Når dsRNA for vg injiseres i nest siste etappe larver (en scene før den siste larvestadiet), kan et fullstendig tap av vingestrukturer observeres i pupal scenen (Tall 3E og 3F). Den resulterende voksen også helt mangler vingestrukturer (Tall 3G og 3H). RNAi resultat for vg eksemplifiserer både robusthet og den systemiske natur RNAi i T. castaneum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: (A) Eksempler på ubrutt, gode og dårlige nåler (B) Tuppen av en godt brutt god nål (C) Tuppen av en ødelagt nål som er for stor og sløv (D) Spissen... av en blakk<html> n nål som er for tynne. Scale barer (rød) er 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:... (A) En riktig størrelse kanyle innføres i det siste stadium larve (B) Larver hensiktsmessig injisert med den grønne dsRNA-løsning (C) Overløp av dsRNA-løsning ved injeksjonspunktet forårsaket av over-injeksjon (D ) En tynn nål ikke å trenge gjennom larve hårstråene. (E) En stor kanyle innføres i det siste stadium larve. (F) Larver injisert med en stor kanyle, noe som resulterer i overflyt og lekkasje av dsRNA-løsning. Pilene viser nåler.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Eksempler på vellykket RNAi i T. castaneum. (AD) De siste larve injeksjon av EYFP dsrna resulterer i en reduksjon av EYFP ekspresjon. (A) Larver en dag etter injeksjon. (B) Larver to dager etter injeksjonen. (C) Kontroll puppe. (D) som resulterer fra puppe larve EYFP dsRNA injeksjon. De negative kontroller er buffer injeksjon (A, B) og DsRed dsRNA injeksjon (C, D). Pilspisser og piler indikerer EYFP uttrykk eller mangelen på dem i vingen primordia og øyne, hhv. (EH) Penultimate larve RNAi for vg. (E) Wild-type puppe. (F) vg RNAi puppe. Mangelen på vinge strukturer er allerede synlig på pupal scenen (pil). G) Wild-type voksen. (H) vg RNAi voksen. Wing relaterte strukturer er helt mangler (pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interferens (RNAi) -baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. Her gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir rask tilgang til tap-av-funksjon fenotyper, slik at forskere å studere genfunksjoner i ulike sammenhenger.

Larve RNA-interferens i Red Mel Beetle,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Bruke RNA-mediert interferens fôringsstrategi til skjerm for gener involvert i Body Size forordning i nematode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Måling av Larve Aktiviteten i<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Praktisk bruk av RNA støy: muntlig levering av Double-strandet i Liposome stativer for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Kjerneisolasjon fra voksen musnyre for RNA-sekvensering med en kjerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektiv Oral RNA Interference (RNAi) Administrasjon til Voksne Anopheles gambiae Mygg

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Påføring av RNA-interferens i furuskognematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Utforske entomopatogene soppressurser fra skogtreborere

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Forfatter Spotlight: Evaluering av entomopatogene sopp i ville Monochamus alternatus-populasjoner for biokontrollapplikasjoner i skogtreborere

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Isolering, atferdsidentifikasjon og patogenisitetsvurdering av entomopatogene sopp fra en skogtreborer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...