Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
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Agradecemos ao Centro de Bioinformática e Genômica Funcional (CBFG) na Universidade de Miami para obter suporte técnico. Este trabalho foi financiado pela Miami University concessão start-up (YT), e da National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

1 T. Ações castaneum e cultivando <ol><li> Decidir sobre um T. castaneum tensão a ser usado para o experimento. NOTA: Vários T. estabelecida em laboratório cepas castaneum estão disponíveis. Ga-1 (Georgia-1) é a cepa parental de Ga-2, que foi usado para a sequenciação do genoma 3. Desde Ga-1 partes maioria dos polimorfismos de DNA (como polimorfismos de nucleotídeo único, SNPs) com Ga-2, e é mais saudável do Ga-2 devido ao menor endogamia, é ideal para experimentos de RNAi. Pu-11 é outra estirpe conveniente de usar , como o próprio amarelo proteína fluorescente (EYFP) maior expressão única no futuro primórdios ala nos permite distinguir o último estágio larval de outros estádios (veja a Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2.013 12). É importante documentar que tensão besouro foi utilizado no experimento, como origens genéticas parecem significativamente affect o RNAi fenótipos 13. </li><li> Prepare T. castaneum farinha cultura pela adição de 5% (em peso) de levedura de cerveja pré-peneirado para orgânica farinha de trigo integral (após mistura, armazenar a farinha de cultura à temperatura de -20 ° C). Alíquota da farinha de cultura (à temperatura ambiente) em garrafas de plástico de 6 onças banco de Drosophila (cerca de 40 g / frasco). </li><li> Cultura T. castaneum a 30 ° C com 70% de humidade. Use uma incubadora com humidade controlada, se possível. Adicionar 30-40 adultos por frasco de cultura (relação homem: mulher 1: 1) para iniciar a cultura. NOTA: Apesar de molde raramente é um problema a 30 ° C, temperaturas mais baixas (por exemplo, 25 ° C), com 70% de umidade pode causar o crescimento de fungos na cultura farinha. Abaixe a umidade se isso ocorrer. </li><li> Transfira os adultos para um novo frasco de cultura a cada duas semanas para a repicagem (veja o passo 5,2-5,5 para saber como isolar adultos a partir de farinha de cultura). NOTA: Demora cerca de três semanas para obter a última larvas. Alternatvamente, T. castaneum culturas podem ser mantidas a uma temperatura mais baixa (2.025 ° C), embora com um período mais longo a cultura (tempo de desenvolvimento a 25 ° C é aproximadamente o dobro que a 30 ° C). </li></ol> 2: Preparação de soluções e instrumentos para larval injeção dsRNA <ol><li> Sintetizar moléculas de dsRNA homólogas ao gene alvo por transcrição in vitro. Armazenar a -80 ° C. Veja Philip e Tomoyasu 2011 11 para os procedimentos de biologia molecular detalhadas. Ver também a discussão para um número de parâmetros que devem ser considerados no projeto de moléculas de dsRNA. </li><li> Adicione 10 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C) por mistura de 8,5 ml de 1 M de Na 2 HPO 4 com 1,5 ml de 1 M NaH 2 PO 4. Verificar o pH com um medidor de pH e ajustar em conformidade. </li><li> Adicione 1 ml de 10x tampão de injecção através da mistura de 10 mL de tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M de KCl, 100 ul de corante alimentar verde e 790 ul de água bidestilada (ddH2O). Diluir o tampão 10x injecção para perfazer 2x tampão de injecção (200 ul de tampão de injecção 10x + 800 ul ddH2O). Armazenar ambos 10x e injecção 2x tampões a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Prepare Fixo lâminas de vidro. <ol><li> Cubra toda uma lâmina de vidro com uma forma de cola reposicionável para injeções de larvas. Para adultos ou pupa injeções, fazer duas tiras finas de cola ao longo das mais longas bordas do slide. </li><li> Deixe a cola secar por vários dias, o que garante que a cola permanece brega o suficiente para aderir besouros para o slide, ao mesmo tempo, permanecendo flexível o suficiente para facilitar a sua remoção após a injeção. NOTA: Se a cola fica muito pegajoso, use um dedo e toque na cola, o que reduzirá a aderência. Cada slide pode conter até 40 ou 50 besouros, e pode ser reutilizado até que ele não consegue controlar com segurança os animais. Alterntivamente, fita de dupla face pode também ser usado, embora a fita adesiva, por vezes não é suficiente para manter as larvas. </li></ol></li><li> Faça uma cesta de eterização. <ol><li> Retirar o êmbolo de uma seringa descartável de 10 ml, a seringa e cortar ao meio em torno da linha 6 ml. </li><li> Descartar a metade inferior da seringa. Resumidamente aquecer a superfície de corte da parte superior da seringa, com um queimador de gás, e empurrar rapidamente o plástico derretido sobre um pedaço de malha de nylon para colar a malha na seringa. Apare qualquer excesso de malha, uma vez que o plástico endurece. </li></ol></li><li> Prepare o frasco éter. Adicionar 30 ml de éter a uma boca estreita de 100 ou 250 ml frasco de vidro. Adicionar várias peças de papel de seda para aumentar a evaporação do éter. NOTA: Ether apresenta um risco de incêndio e também é prejudicial. Sempre lidar com éter sob uma coifa. Feche bem a tampa quando não estiver em uso. NOTA: O gelo pode ser utilizado como uma alternativa mais segura (tal como, num ambiente de sala de aula), embora o sedation é menos eficaz. </li></ol> 3 Preparação de larval Injeção Aparelho <ol><li> Coloque numa fase mecânica XY em um microscópio de dissecação. NOTA: estágios XY mecânico estão disponíveis a partir de grandes empresas de microscópio. Em alternativa, as fases de microscópio de baixo custo pode ser utilizado para a maioria dos microscópios de dissecação com algumas modificações (ver tabela de materiais, por exemplo). </li><li> Coloque um manipulador mecânico agulha perto do palco mecânica XY. </li><li> Montar uma seringa de injeção. Use uma torneira de quatro vias (com ligações Luer) para conectar uma seringa descartável de 30 ml para um suporte de agulha de vidro, permitindo a manipulação da seringa de injecção, sem afectar a pressão no interior da agulha de injecção (ver Philip e Tomoyasu 2011 11 para a seringa de injecção detalhada montagem). </li></ol> 4. Puxando as agulhas de injecção <ol><li> Puxe agulhas de vidro de borosilicato (B100-50-15, OD: 1 milímetro, ID: 0.5 mm, 15 centímetros de comprimento) por umpuxador de agulha. NOTA: Para Sutter P-87 ou P-97, use a configuração &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90&quot; ou seguir o Capítulo 2 da pipeta Cookbook: células aderentes, C. elegans, Drosophila, e peixe-zebra - programas recomendados. As configurações ideais variam de acordo com o modelo do puxador da agulha. A configuração para um genérico Drosophila agulha de injeção é um bom ponto de partida. </li><li> Loja puxado agulhas em uma caixa de plástico (por exemplo, uma caixa de CD de plástico) e prenda com removível massa de montagem. </li></ol> 5 Isolamento e Seleção de Larvas <ol><li> Coloque uma peneira # 25 em um receptor peneira. </li><li> Inserir o conteúdo do frasco de cultura (besouros da farinha e cultura) na peneira, e peneirar o conteúdo imediatamente. Não deixe o conteúdo da peneira sem peneirar, como larvas rapidamente tentar cavar através da peneira e ficar preso. Agressivamente filtrar o conteúdo para deixar cair farinhaatravés de e deixar larvas mais velhas (normalmente 6 ° e 7 ° larvas), pupas e adultos (juntamente com suas cutículas elenco-off, exúvias) por trás em cima da peneira. </li><li> Transferir os materiais remanescentes no peneiro (escaravelhos e Exúvia) para a panela de sementes. Continue a tocar a panela para evitar que os besouros de escapar. </li><li> Remover o Exúvia e as restantes partículas de farinha na superfície dos besouros por soprando suavemente sobre o tabuleiro de sementes. </li><li> Toque a panela de sementes para mover o conteúdo para o fundo da panela. Então, deixe a panela inexplorado por alguns segundos. Aguarde até que os adultos, que são mais móveis do que outras etapas, a sair da pilha. Remover adultos utilizando um pincel de arte (por exemplo, largura de 1 cm). </li><li> Pupas separado batendo suavemente o tabuleiro de sementes, mantendo a boca da panela um pouco para baixo, como pupas tendem a rolar mais rápido em direção à boca. Utilização de um pincel para remover as pupas, deixando apenas as larvas na panela de sementes. </li><li> Plás larvas isolado em um prato limpo Petri. Selecione um grau adequado de larvas para injecção e os coloque em um prato separado Petri. NOTA: larvas última precoce (1-2 dias após a muda larval final) são muitas vezes adequado ao analisar o efeito RNAi em morfologias adultos, bem como sobre a metamorfose. É, no entanto, por vezes, necessário para realizar ARNi no penúltimo (ou mesmo antes) fase para avaliar a função do gene precoce (por exemplo, as Figuras 3E-3H. Também ver Clark-Hachtel et al. 2,013 12). Use pupas como referência de tamanho para identificar o estádio de larvas. A última larvas são um pouco mais longo do que pupas. Alternativamente, pu-11 pode ser usada para identificar a última larvas, bem como para determinar o período de tempo do desenvolvimento de larvas no último instar (Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2,013 12). </li><li> Mantenha as larvas selecionado em uma placa de Petri até eterização. Coloque o restode larvas e outros estágios de besouros (como pupas e adultos) de volta em um frasco de cultura com farinha e devolvê-lo para a incubadora. </li></ol> 6 Preparação de agulhas de injeção <ol><li> Coloque uma agulha de vidro previamente puxou para uma lâmina de vidro usando pegajoso ou fita dupla face. Utilizando uma pinça, testar o tirou da agulha ao olhar através do microscópio de dissecação para ver onde as curvas de ponta. Agarre a área um pouco para o lado da ponta de onde as curvas da agulha com o fórceps e torcer para quebrar. </li><li> Manter bons agulhas e descartar outros. Considere-se uma boa agulha como tendo uma abertura que não é nem muito grande nem muito pequena (cerca de 0,05 mm de diâmetro. Figuras 1A e 1B), e é inclinada para fazer a penetração da cutícula larval mais fácil (Figuras 1B e 2A-2B). Considere-se um mau agulha como (i) muito pequena, fazendo com que a absorção de uma solução de ARNcd na agulha dificulto (etapa 7) (Figuras 1D e 2D), (ii) muito grande, causando lesão de larvas e letalidade possível após a injecção (Figuras 1C e 2F), (iii) sem corte, tornando a penetração da cutícula lesão difícil e crescente. </li><li> Insira a agulha no porta-agulhas. <ol><li> Primeiro, desaparafusar a ponta do suporte de agulha e colocar a extremidade posterior da agulha para a ponta da titular. Em seguida, colocar a junta de borracha sob a ponta de suporte (pelo menos 1 cm a partir da extremidade posterior da agulha de vidro). </li><li> Inserir a parte de trás da agulha no suporte, com a junta de borracha totalmente inserida na abertura do suporte de agulha. Parafuso da ponta de volta para o titular. </li></ol></li><li> Colocar o suporte da agulha montada sobre a agulha manipulador. Manter o suporte de agulha perto da horizontal. Ajustar a posição do manipulador, de modo que a ponta da agulha está localizado no centro da vista quando se olha através do microscope. </li></ol> 7 Solução de pré-alimentação dsRNA na agulha <ol><li> Preparar a solução de injecção de ARNcd a apenas antes da injecção, através do ajuste da concentração com ddH2O e misturando a solução com volumes iguais de ARNcd de 2x tampão de injecção (passo 2.3). Manter a solução mista no gelo. Veja a discussão sobre a concentração de dsRNA. </li><li> Cortar a ponta de uma pipeta de 20 uL ponta descartável. Pipetar 10 ml da solução para dentro da ponta da pipeta aparado. Remova cuidadosamente a ponta da pipeta da pipeta, mantendo o líquido na ponta, fornecendo contrapressão. Alternativamente, remover cuidadosamente a ponta e, em seguida, passar a solução para a extremidade da ponta, proporcionando pressão utilizando um dedo. </li><li> Colocar a ponta da pipeta com a solução de ARNcd na platina do microscópio usando pegajoso com a abertura virada para a ponta da agulha. </li><li> Olhando através do microscópio, mova lentamente a ponta carregado em direção à agulha até a ponta doagulha é apenas dentro da ponta da pipeta e carregada para dentro da solução. </li><li> Ao olhar através do microscópio, puxe o êmbolo da seringa para puxar lentamente a solução dsRNA na agulha. NOTA: Não sobrecarregue a agulha. À medida que a extremidade de a solução se aproxima da dsRNA ponta da agulha, diminuir a taxa de puxar e parar de carregar a solução antes de a ponta da agulha atinja ar. Se o ar atinge a ponta, a solução será rapidamente arrastada para o suporte de agulha, o que resulta em graves problemas de contaminação. Procedimentos de limpeza detalhadas de suporte da agulha são descritas em Philip e Tomoyasu 11, 2011. </li><li> Retirar a pressão de injecção da seringa e suporte de agulha pela abertura da torneira. Em seguida, move a ponta da pipeta para longe da ponta da agulha. Levante a agulha para cima do palco para evitar acidentalmente danificar a agulha ao colocar as larvas no palco. Remover a ponta da pipeta a partir da fase de esvaziado. </li></ol&gt; 8 injeção dsRNA <ol><li> Coloque as larvas no cesto eterização. Use menos de 10 larvas se aprender a técnica. Use 30-40 larvas em uma rodada, uma vez confortável com a técnica. </li><li> Coloque a cesta com larvas na garrafa éter e feche a tampa. NOTA: Ether apresenta um risco de incêndio e também é prejudicial. Execute esta etapa sob uma coifa. </li><li> Larvas Etherize durante cerca de 3 min. Confira as larvas para o movimento depois de 3 min. Colocá-los de volta na garrafa éter por 30 seg, se eles ainda estão se movendo. Não Etherize por mais de 5 minutos, pois isso pode aumentar a letalidade. NOTA: O tempo de eterização ideal pode variar dependendo da temperatura e umidade. </li><li> Transferir as larvas anestesiado do cesto para a borda antiaderente de uma lâmina de vidro pegajoso. Utilizando uma pinça e ao olhar através do microscópio, pegar cada um larvas por um e colocá-los para o slide. Lay-los lateralmente e bata suavemente para baixo seus corpos from cabeça e cauda, ​​com a pinça, um pouco de alongamento-los como você vai, para se certificar de que eles são garantidos para o slide. </li><li> Coloque o slide pegajoso com larvas no palco microscópio. </li><li> Insira a agulha carregada dsRNA suavemente para o lado dorsal das larvas para evitar danos ao sistema nervoso central. Evite também a linha média dorsal, como o coração larval está localizado aqui. Nesta e nas subsequentes etapas, usar sempre a fase de mover-se as larvas para a agulha (em vez de utilizar o manipulador de agulhas para mover a agulha). NOTA: O local de injecção específica não importa como RNAi em T. castaneum parece ser sistêmica. No entanto, é geralmente mais fácil de injectar no lado dorsal dos segmentos torácico ou abdominal. </li><li> Após a inserção da agulha no larvas, puxar a agulha ligeiramente para trás para permitir espaço para o dsRNA de entrar na cavidade do corpo de larvas. </li><li> Empurre a seringa de injecção até que as larvas vez verde (ou a cor do tampão de injecção) e procurar stretched e completo. NOTA: Se aprender a técnica, tentar injetar o máximo possível para determinar a quantidade de solução que pode ser injetado em uma larva, sem letalidade significativa. Ela é geralmente de cerca de 0,5-0,7 uL. </li><li> Retirar a agulha do larvas. Ao remover a agulha, ligeiramente puxe a seringa de injeção para evitar perda de dsRNA (também tomar cuidado para não puxar o ar). </li><li> Injetar todas as larvas no slide. Certifique-se de remover as larvas que não foram injetadas com sucesso. Injeção completa antes larvas acordar (em cerca de 10 min). </li><li> Remover o diapositivo com larvas injectadas no microscópio de injecção e deixar a lâmina durante mais 5 min, até que todas as larvas se recuperar da eterização. </li><li> Com fórceps e sob um microscópio de dissecação, levantar delicadamente as larvas da cabeça à cauda para liberá-los a partir do slide pegajosa. Coloque as larvas recém-lançado em um prato limpo Petri. Deixar as larvas na placa de Petri durante 10-15 minutos para permitir a injecção wound a coagular. </li><li> Coloque as larvas para um novo frasco com farinha e limpo etiqueta adequada incluindo o nome da estirpe, o tipo de dsRNA injectado, a concentração de dsRNA, o número de larvas injectadas, e a data. </li><li> Cultura das larvas injectadas a 30 ° C com 70% de humidade. Observe as larvas para RNAi fenótipos regularmente. NOTA: A última empupam larvas dentro de 7 dias. Em seguida, as pupas vai EFeche em adultos após 7 dias (se não houver nenhuma anormalidade no momento causado por RNAi). </li></ol> 9 Confirmação de Knockdown e fenotípicas análises <ol><li> Considerar a avaliação da eficiência de RNAi derrubar por várias técnicas de biologia molecular, tais como diferentes quantitativa de transcrição reversa-PCR (qRT-PCR) e Western Blotting. Veja Miller et al. 7, 2012 e Philip e Tomoyasu 2011 11 para qPCR detalhada e Western Blot protocolo, respectivamente. </li><li> Analisar RNAi fenótipos relacionados. NOTA: RNAi relacionadofenótipos podem ser observadas em vários estágios diferentes e sob diferentes condições de cultura, de acordo com os genes que foram alvo. RNAi pode afectar a morfologia do besouro, metamorfose, fisiologia e comportamento. Como muitas vezes a presença do fenótipo é verificada e em que condições os besouros são criados devem ser adaptados às questões específicas a ser investigado através de RNAi. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

<html> Há uma série de questões importantes que precisam ser considerados para garantir o sucesso de RNAi, incluindo o comprimento ea concentração das moléculas de dsRNA, a concorrência entre as diferentes moléculas de dsRNA (ao tentar derrubar múltipla), ea possibilidade de fora do alvo Effects (OTE). dsRNA Comprimento O comprimento das moléculas de dsRNA afecta a eficiência da resposta RNAi sistémica, com um ARNcd deixando de ser mais eficiente a desencadear RNAi 7,14,15 (embora o tempo limite de dsRNA é actualmente desconhecido). O comprimento do dsRNA deve ser mais longo do que 50 bp para induzir RNAi eficaz em T. castaneum 7. dsRNA entre 150 pb e 500 pb parece ser ideal para experimentos de RNAi. Embora as moléculas mais longas de dsRNA também pode ser usado, eles terão uma chance maior de OTE eo passo a clonagem de genes vai se tornar cada vez mais difícil. dsRNA Concentração ve_content &quot;&gt; diferentes graus de knockdown do gene pode ser conseguida, dependendo da concentração de ARNcd. de 1 ug / ul parece ser uma concentração de partida razoável, o que muitas vezes produz um fenótipo quase nula (pode variar dependendo do gene (s) de interesse ). RNAi pode ser realizada com uma concentração mais elevada (por exemplo, 7-8 mg / mL) para obter um forte fenótipo RNAi. ARNi com uma diluição em série de dsRNA por vezes pode ser vantajoso para a produção de uma série de fenótipos hipomórfico (Dados Complementares de Tomoyasu et al. 8, 2009, e Borràs-Castells dados não publicados). RNAi Concorrência Knockdown múltipla do gene pode ser realizado em T. castaneum injetando várias moléculas de dsRNA diferentes simultaneamente. No entanto, sabe-se também que ter várias moléculas diferentes de dsRNA presentes dentro do organismo, muitas vezes resulta em competição entre os ARNcd de acesso aos componentes de ARNi <sup&gt; 7,14. É importante utilizar o mesmo comprimento e a mesma concentração de todos os dsRNA ao tentar knockdown gene múltiplo para evitar um dsRNA competindo com as outras (embora, mais ajustamentos do comprimento e concentração de ARNcd pode ser necessário, quando os níveis de expressão são muito diferentes entre os genes-alvo). Nós, assim como outros, têm realizado com sucesso knockdown duplo e triplo (por exemplo, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 17, 2009, e Yang et al., 2009 18). Embora exequível, quádruplo RNAi (ou mais) pode ser difícil, uma vez que provavelmente iria causar uma redução significativa da eficiência de ARNi para todos os quatro genes alvo. Off-alvo OTE é uma preocupação inerente para abordagens baseadas em RNAi. Uma maneira de minimizar OTA é identificar regiões no gene-alvo que partilham sequências similares com outros genes e evitar estas regiões ao conceber dsRNA. Uma análise simples BLAST contra o T. castaneum conjunto de genes previu pode identificar tais regiões. Várias ferramentas on-line também permite a avaliação de potencial OTE (por exemplo, E-RNAi 19). Realizando ARNi para duas regiões não se sobreponham de o gene alvo é um meio fácil e eficaz para eliminar a possibilidade de que os fenótipos observados são causadas por OTA. A possibilidade de OTE é minimizado se RNAi para duas regiões não-sobrepostas produzir os mesmos fenótipos (a não ser que as duas regiões não sobrepostas compartilham uma seqüência similar). Avaliando gene knockdown por outras que as fenotípicas analisa meios é muitas vezes essencial para dados relacionados com RNAi efetivamente presentes. Dois grandes maneiras de avaliar knockdown gene são qRT-PCR e western blot. qRT-PCR é uma maneira conveniente de medir o nível do ARNm alvo, e tem sido utilizado em muitos estudos relacionados com o ARNi incluindo aqueles em T. castaneum (ver Miller et al. 2,012 7 por exemplo). However, o cuidado deve ser tomado, como temos visto recentemente alguns casos em que o nível de mRNA alvo é sobre-regulada por RNAi (embora o produto da proteína é regulada para baixo) (dados não publicados Borràs-Castells). Não se sabe se este mRNA RNAi induziu aumento da regulação pode ser generalizado ou única para determinados genes. A análise de transferência de Western é uma outra forma de confirmar knockdown gene. Este método é muito fiável, uma vez que mede a quantidade de proteína do produto final. A exigência de um anticorpo específico contra o produto de proteína do gene alvo é uma desvantagem para esta abordagem. Utilizando múltiplas medições independentes, além de análise fenotípica vai aumentar a confiança dos dados fenotípicos obtidos pela análise baseada em RNAi. Desde a sua concepção em T. castaneum, principalmente RNAi foi utilizado para estudar a função de genes em desenvolvimento e formação de um padrão. Estes T. estudos de desenvolvimento castaneum foram altamente bem sucedido em caracteterizing funções evolutivamente conservadas e divergiram de genes (revistos em Denell 2008 1 e Klingler 2004 2). No entanto, estudos baseados em RNAi em T. castaneum não estão limitados a biologia do desenvolvimento. Por exemplo, o RNAi pode ser utilizado para estudar a função do gene em uma ampla gama de respostas fisiológicas e comportamentais, incluindo a tolerância ao estresse, a predação, agressão, escolha de parceiro, os padrões de atividade, e os mecanismos de defesa. Uma dificuldade de aplicação de ARNi para estes contextos, é a probabilidade de efeitos pleiotrópicos. Frequentemente, os genes de interesse vai ter uma variedade de funções em todo o T. ciclo de vida castaneum, tornando assim a remoção de genes, sem efeitos fenotípicos indesejadas difíceis. No entanto, a capacidade de executar facilmente RNAi em uma variedade de estágios muitas vezes pode ser uma estratégia eficaz para evitar esses efeitos pleiotrópicos. Por exemplo, a realização de RNAi em adultos, em vez de larvas ou pupas pode nos permitir contornar UNINtendiam a letalidade causada por knockdown gene durante o desenvolvimento inicial. A flexibilidade da resposta de RNAi em T. castaneum torna, assim, este modelo uma opção atraente para adaptação RNAi para experimentos de função do gene em respostas fisiológicas e comportamentais. O T. sistema castaneum também é ideal para uso em um laboratório de ensino. T. castaneum podem ser facilmente cultivadas em uma farinha / mistura de levedura, à temperatura ambiente (25 ° C), sem subcultura frequente, e técnicas de RNAi em T. castaneum são simples o suficiente para ser adaptado para um laboratório com jovens cientistas, de aprendizagem. Como RNAi está se tornando uma técnica essencial em uma variedade de áreas biológicas, é fundamental que os alunos são expostos a esta técnica. A natureza direta da técnica de RNAi larval em T. castaneum também incentiva mais os alunos a serem envolvidos na pesquisa, tornando T. castaneum um excelente candidato para uma sala de aula orientada sistema genético. &lt;/ P&gt;

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Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

O escaravelho vermelho da farinha, Tribolium castaneum, está ganhando popularidade em várias áreas da biologia, em parte devido à facilidade de realização de interferência de RNA (RNAi) 1-3. Técnicas genéticas knockdown baseada em RNAi permitir que os cientistas analisam-perda de função sem a utilização de métodos genéticos complexos. T. castaneum mostram uma resposta sistémica RNAi robusto, tornando-se possível a realização de RNAi em qualquer estágio através de uma simples injecção de ARN de cadeia dupla (dsRNA) para dentro do corpo da cavidade do besouro 4-6. Knockdown simultânea de vários genes também é viável em T. castaneum por injecção de duas ou mais moléculas de dsRNA diferentes ao mesmo tempo 7,8. Além disso, uma série de fenótipos hipomórfico podem ser gerados através da redução da concentração de dsRNA injectado 8. Estas características tornam técnicas de genética reversa baseada em RNAi alternativas atraentes para a genética termo tradicional em T. castaneum. Uma vez que praticamentetudo T. tecidos castaneum são suscetíveis a moléculas de dsRNA extracelulares 9, esta técnica permite aos pesquisadores estudar uma grande variedade de tecidos em diversos contextos. Além disso, embora o presente relatório incide sobre a realização de RNAi em T. castaneum, muitos procedimentos aqui descritos são aplicáveis ​​a outros insectos. Portanto, este protocolo é útil para aqueles que desejam realizar análises, perda de função em seus contextos de interesse em T. castaneum, bem como para pesquisadores que desejam aplicar uma técnica baseada em RNAi para outros insetos. A injeção de dsRNA em larvas permite a análise funcional em vários estágios da vida besouro, incluindo a larva, pupa e adulto encena 4,5,10. Temos relatado anteriormente o nosso protocolo de RNAi larval total, incluindo os procedimentos de biologia molecular 11. No relatório atual, nos concentramos em descrever os procedimentos de injeção de dsRNA, que são melhor explicados com assessores visuais. Nós fornecemosprocedimentos detalhados passo-a-passo de injeção, assim como bons e maus exemplos de injeção. Este protocolo visuais complementa nosso protocolo anterior, e quando combinadas, fornecem uma visão mais abrangente dos procedimentos de larvas de RNAi em T. castaneum. Além disso, vamos discutir parâmetros para moléculas de dsRNA que podem afetar o sucesso de RNAi, aplicação de testes baseados em RNAi para a pesquisa fisiológica, bem como a aplicabilidade do protocolo de RNAi larval em um laboratório de ensino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

O escaravelho vermelho da farinha, Tribolium castaneum, oferece um repertório de ferramentas experimentais para estudos genéticos e de desenvolvimento, incluindo uma seqüência totalmente anotada do genoma, transgênese com base em transposon, e RNA de interferência efetiva (RNAi). Entre essas vantagens, as técnicas genéticas knockdown baseadas em RNAi estão no centro de pesquisa Tribolium. T. castaneum mostram uma resposta sistémica RNAi robusto, tornando-se possível a realização de RNAi em qualquer fase da vida, simplesmente injectando o RNA de cadeia dupla (dsRNA) para dentro da cavidade do corpo do besouro. Neste relatório, nós fornecemos uma visão geral de nossa técnica de RNAi larval em T. castaneum. O protocolo inclui (i) isolamento da fase apropriada de T. larvas castaneum para injecção, (ii) preparação para a configuração de injecção, e (iii) a injecção de ARNcd. Larval RNAi é uma técnica simples, mas poderosa, que nos fornece acesso rápido a phenotyp perda de funçãoes, incluindo vários genes fenótipos knockdown, bem como uma série de fenótipos hipomórfico. Uma vez que praticamente todos os T. castaneum tecidos são sensíveis a ARNdc extracelular, a técnica permite RNAi larval investigadores a estudar uma ampla variedade de tecidos em diversos contextos, incluindo a base genética de respostas organismais para o ambiente exterior. Além disso, a simplicidade dessa técnica estimula mais o envolvimento dos alunos na pesquisa, tornando T. castaneum um sistema genético ideal para uso em sala de aula.

Um dos passos fundamentais para a injeção de sucesso é fazer uma boa agulha. Tal como descrito no passo 6, a ponta da agulha tem de ser quebrado antes da injecção de T. castaneum. Os exemplos de bons e maus agulhas são mostrados na Figura 1. Um bom agulha tem uma ponta afiada e rígida, com uma abertura de diâmetro de aproximadamente 0,05 mm (Figura 1B). A Figura 2 apresenta uma injecção de sucesso (Figuras 2A e 2B), assim como vários casos de injecções mal sucedidas (Figuras 2C-2F). Com uma agulha de injecção de tamanho adequado, a ponta da agulha penetra a cutícula de larvas, com resistência mínima (Figura 2A), e a solução de dsRNA (verde) flui para as larvas, sem qualquer vazamento (Figura 2B). Não sobre-injeção, pois fará com que excesso da solução de dsRNA, mesmo com uma agulha de injeção de tamanho adequado (Figura2C). Se a ponta da agulha é muito fina, a ponta de agulha muitas vezes não consegue penetrar na cutícula larval e curvas, tornando difícil a injecção (Figura 2D). Se isso acontecer, corte a ponta da agulha, por vezes, ajuda. Agulhas maiores são muitas vezes ainda utilizável, embora com algumas dificuldades em penetrar na cutícula larval (Figura 2E). No entanto, uma grande quantidade de solução de dsRNA é facilmente empurrada para fora da agulha, mesmo com uma ligeira pressão sobre a seringa de injecção, resultando frequentemente em um excesso da solução de ARNdc (Figura 2F). Ao realizar ARNi, é importante ter um controlo positivo para determinar que a RNAi está a funcionar correctamente, e um controlo negativo para verificar que o efeito observado não é um efeito não específico de ARNcd ou uma consequência de processos de injecção (tais como lesões causadas por injecção, ou anormalidade de eterização). A injecção de ARNcd de EYFP direccionamento pode servir como umbom controle positivo quando se utiliza a 5,7 tensão pu-11. Quando EYFP dsRNA é injectado na última fase de larva, uma redução significativa do sinal de EYFP nas futuras primórdios asa podem ser observadas tão cedo quanto uma injecção pós dias (Figura 3A). O knockdown de EYFP está completa, dois dias após a injecção do ARNcd EYFP (Figura 3B) e esta knockdown persiste através do (Figuras 3C e 3D) fase de pupa e ao longo da vida do besouro, se a concentração de ARNcd é suficientemente elevada (por exemplo, 1 mg / mL) 7. EYFP ARNcd pode também ser utilizado como um controlo negativo, uma vez que é uma sequência do gene não-endógenos e não deve causar perturbações morfológicas e fisiológicas (Figuras 3A-3D). Fornecemos imagens de larvas de ARNi para vestigial (vg), um gene de asa crítica 12, como um outro exemplo de como a efcazes esta técnica baseada em RNAi injecção é em T. castaneum. Quando dsRNA para vg é injectado em larvas penúltima etapa (uma fase, antes do último estádio de larva), uma perda completa das estruturas laterais podem ser observados na fase de pupa (Figuras 3E e 3F). O adulto, resultando também carece completamente estruturas asa (Figuras 3G e 3H). O resultado RNAi para vg exemplifica tanto a robustez ea natureza sistêmica da RNAi em T. castaneum. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: (A) Exemplos de agulhas não quebradas, boas e más (B) A ponta de uma agulha boa bem quebrada (C) A ponta de uma agulha quebrada que é demasiado grande e sem corte (D) A ponta... de uma falência<html> agulha n que é muito fina. Barras de escala (vermelho) são de 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:... (A) A agulha de injeção de tamanho adequado inserido na larva de último estádio (B) Larva injetado de forma adequada com a solução de dsRNA verde (C) Estouro da solução de dsRNA no ponto de injeção causada por excesso de injeção (D ) Uma agulha fina não penetrar a cutícula larval. (E) uma grande agulha de injecção inserida na larva de último estádio. (F) Larva injectado com uma agulha, o que resulta em excesso e vazamento da solução de dsRNA. As setas indicam as agulhas.&quot;target =&quot; ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: exemplos de sucesso de RNAi em T. castaneum. (A) Larvas um dia após a injecção. (B) Larvas dois dias após a injecção. (C) pupas de controlo (D). pupas resultante de (dC) Última injecção larvas dos resultados EYFP dsRNA numa redução da expressão EYFP. injeção larval EYFP dsRNA. Os controlos negativos são a injecção de tampão (A, B) e injecção dsRed dsRNA (C, D). Pontas de flechas e setas indicam expressão EYFP ou falta dela nos primórdios da asa e olhos, respectivamente. (EH) Penfinal larval RNAi para vg. (E) do tipo selvagem pupa. (F) vg RNAi pupa. A falta de estruturas laterais é já visível na fase de pupa (seta). G) do tipo selvagem adulto. (H) vg RNAi adulto. Estruturas Asa relacionadas são completamente ausente (seta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Interferência de RNA (RNAi) técnicas de genes baseados em knockdown estão no centro de pesquisa Tribolium. Aqui, nós fornecemos uma visão geral de nossa técnica de RNAi larval em Tribolium castaneum. Larval RNAi é uma técnica simples, mas poderosa que fornece acesso rápido a fenótipos de perda de função, permitindo que os pesquisadores para estudar as funções dos genes em diversos contextos.

A interferência RNA larval no Red Flour Beetle,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biologia

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Explorando recursos de fungos entomopatogênicos de brocas de madeira florestal

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avaliação de fungos entomopatogênicos em populações selvagens de Monochamus alternatus para aplicações de biocontrole em brocas florest

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...