Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Мы благодарим Центр биоинформатики и функциональной геномики (CBFG) в Университете Майами в службу технической поддержки. Эта работа была поддержана Университета Майами запуска грант (УТ) и Национального научного фонда (УТ: IOS 0950964).

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

<html> Есть ряд важных вопросов, которые необходимо рассматривать, чтобы гарантировать успех РНК-интерференции, в том числе длины и концентрации молекул дсРНК, конкуренции среди различных молекул дсРНК (при попытке кратное сбить), а также возможность и от ворот Effects (ОТЕ). дсРНК Длина Длина молекул дцРНК влияет на эффективность системной реакции RNAi, с более дцРНК быть более эффективным, чтобы вызвать RNAi 7,14,15 (при том, что чем дольше предел дцРНК в настоящее время неизвестно). Длина дцРНК должна быть больше, чем 50 пар оснований, чтобы вызвать эффективное RNAi в T. castaneum 7. дсРНК между 150 б.п. и 500 б.п., кажется, идеально подходит для РНК-интерференции экспериментов. Хотя длинные молекулы дцРНК может также использоваться, они будут иметь увеличенный шанс ОТЕ и шаг гена клонирования будет становиться все труднее. дсРНК Концентрация ve_content &quot;&gt; Различные степени гена нокдауна может быть достигнуто в зависимости от концентрации дцРНК. 1 мкг / мкл по-видимому, разумно начальную концентрацию, которая часто приводит к почти нуль-фенотип (может изменяться в зависимости от гена (ов), представляющие интерес ). RNAi может быть выполнена с более высокой концентрацией (например, 7-8 мкг / мкл), чтобы получить более сильный RNAi фенотип. RNAi с серийным разбавлением дцРНК иногда может быть выгодно производить серию гипоморфных фенотипов (дополнительных данных Tomoyasu др., 2009 8, и Borràs-Кастельс неопубликованные данные). РНК-интерференции конкурс Несколько генов нокдаун может быть достигнуто в Т. castaneum путем введения нескольких различных молекул дцРНК одновременно. Тем не менее, это также известно, что наличие нескольких различных молекул дцРНК, присутствующих в организме часто приводит к конкуренции между дцРНК для доступа к компонентам RNAi <sдо&gt; 7,14. Важно использовать ту же длину и той же концентрации для всех дсРНК при попытке несколько генов нокдаун, чтобы избежать одного дсРНК из конкурирующих других (хотя, последующие корректировки длины и концентрации дсРНК может потребоваться при уровни экспрессии значительно отличаются между гены-мишени). Мы, как и другие, успешно выступали двойного и тройного нокдаун (например, Tomoyasu др. 2005 16, Tomoyasu др., 2009 17, и Ян др., 2009 18). Хотя возможно, Четырехместный RNAi (или более) может быть сложным, так как она, скорее всего, вызвать значительное снижение эффективности РНК-интерференции для всех четырех генов-мишеней. Off-таргетинга ОТЕ является неотъемлемой забота о подходах РНК-интерференции, основанных. Одним из способов минимизации ОТЕ является определение регионов в гене-мишени, которые разделяют сходные последовательности с другими генами и избежать этих регионов при разработке дсРНК. Простой анализ BLAST против Т. castaneum предсказал множество генов может определять такие регионы. Несколько онлайн-инструментов также можно было провести оценку потенциальной ОТЕ (например, E-РНК-интерференции 19). Выполнение RNAi в течение двух непересекающихся областей гена-мишени является простым и эффективным способом, чтобы исключить возможность того, что наблюдавшиеся фенотипы обусловлены ОТЕ. Возможность ОТЕ минимизируется, если РНК-интерференции для двух неперекрывающихся регионы дают одинаковые фенотипы (если два непересекающихся регионов не разделяют подобный последовательность). Оценка ген нокдаун другими, чем фенотипических анализирует средств часто решающее значение для эффективного представления данных RNAi связанных. Две основные способы оценки генной нокдаун являются Qrt-ПЦР и Вестерн-блоттинга. Qrt-ПЦР является удобным способом для измерения уровня мРНК-мишени, и был использован во многих РНК-интерференции, связанных с исследованиями в том числе в Т. castaneum (см Миллер и соавт. 2012, например, 7). Howevэ-э, должны быть предприняты меры, как мы недавно видели некоторые случаи, в которых целевой уровень мРНК до-регулируется РНК-интерференции (хотя белковый продукт является подавляется) (Borràs-Castells неопубликованные данные). В настоящее время неизвестно, если это РНК-интерференции индуцированной мРНК до-регулирования может быть широко распространена или уникальными для определенных генов. Вестерн-блот анализ еще один способ, чтобы подтвердить гена нокдаун. Этот метод является достаточно надежным, насколько это измеряет количество конечного продукта белка. Требование специфических антител против белкового продукта гена-мишени и обратная сторона этого подхода. Используя несколько независимых измерений в дополнение к фенотипической анализа увеличит доверие фенотипических данных, полученных РНК-интерференции на основе анализа. С момента своего зачатия в Т. castaneum, РНК-интерференции имеет, прежде всего, были использованы для изучения функции генов в развитии и формировании образов. Эти Т. castaneum исследования развития были весьма успешными в Characческие данные эволюционно консервативных и расходились функций генов (отзывы в Denell 2008 1 и Klingler 2004 2). Тем не менее, РНК-интерференции, основанные исследования в Т. castaneum не ограничиваются биологии развития. Например, РНК-интерференции может быть использован для изучения функции генов в широком диапазоне физиологических и поведенческих реакций, в том числе толерантности напряжения, хищников, агрессии, выборе партнера, узоры активность, и защитных механизмов. Одна из трудностей применения RNAi в этих контекстах является вероятность плейотропных эффектов. Часто, гены интерес будет иметь разнообразные роли на протяжении всего Т. Таким образом, castaneum жизненный цикл, что делает удаление генов без непреднамеренных фенотипических эффектов сложных. Тем не менее, способность легко выполнять RNAi на различных стадиях часто может быть эффективной стратегией для предотвращения этих плейотропные эффекты. Например, выполняя RNAi у взрослых, а не личинки или куколки могут позволить нам обойти Uninкак правило летальность вызванное генной нокдаун во время раннего развития. Гибкость реагирования РНК-интерференции в Т. castaneum таким образом, делает эту модель привлекательной выбор для адаптации RNAi для экспериментов генной функции в физиологических и поведенческих реакций. Т. Система castaneum также идеально подходит для использования в качестве учебного лаборатории. Т. castaneum могут быть легко культивируют на муки / дрожжевой смеси при комнатной температуре (25 ° С) без частого субкультивирования и методы RNAi в T. castaneum достаточно просты, чтобы быть адаптированы к лаборатории с молодыми, обучение ученых. Как РНКи становится важным методом в различных биологических полей, крайне важно, чтобы студенты подвергаются этой техники. Прямо вперед характер личиночной РНК-интерференции техники в Т. castaneum также призывает больше студентов, которые должны участвовать в исследовании, что делает Т. castaneum главным кандидатом на классе ориентированной генетическая система. &lt;/ P&gt;

Красный мучного жука, Tribolium castaneum, набирает популярность в различных областях биологии частично благодаря легкости выполнения РНК-интерференция (RNAi) 1-3. Генные нокдаун методы РНК-интерференции на основе позволяют ученым проводить с потерей функции анализа без использования сложных генетических методов. Т. castaneum показывают надежную системную реакцию RNAi, что делает возможным выполнение RNAi на любой стадии с помощью простой инъекции двухцепочечной РНК (дцРНК) в полость тела жука 4-6. Одновременное нокдаун нескольких генов также возможно в Т. castaneum путем введения двух или более различных молекул дцРНК в то же время 7,8. Кроме того, ряд гипоморфных фенотипов могут быть получены путем снижения концентрации впрыскиваемого дцРНК 8. Эти особенности делают обратные генетические методы РНК-интерференции на основе привлекательные альтернативы традиционным генетики вперед в Т. castaneum. Поскольку практическивсе Т. castaneum ткани чувствительны к внеклеточных молекул дцРНК 9, этот метод позволяет исследователей изучать широкий спектр тканей в различных контекстах. Кроме того, хотя это докладе основное внимание на выполнение RNAi в Т. castaneum, многие процедуры, описанные здесь, применимы и к другим насекомым. Таким образом, этот протокол будет полезна для тех, кто хочет выполнить с потерей функции анализирует в своих контекстах интересов в Т. castaneum, а также для исследователей, желающих применить метод РНК-интерференции на основе других насекомых. Инъекционных дсРНК личинки позволяет функциональный анализ в различных жук стадиях жизни, в том числе личинок, куколок и взрослых этапах 4,5,10. Ранее мы уже сообщали наше общее личинок протокол RNAi включая процедуры молекулярной биологии 11. В настоящем докладе мы фокусируемся на описании процедуры инъекции дцРНК, которые лучше всего объяснены с визуальными помощников. Мы предоставляемподробные шаг за шагом процедуры инъекции, а также хорошие и плохие примеры инъекции. Этот визуальный протокол дополняет наш предыдущий протокол, а в сочетании, они обеспечивают более полное представление о личиночной процедур RNAi в Т. castaneum. Кроме того, мы обсудим параметры молекул дсРНК которые могут повлиять на успех РНК-интерференции, применения РНК-интерференции на основе анализов для физиологических исследований, а также применимость личиночной протокола РНК-интерференции в учебном лаборатории.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Красный мучного жука, Tribolium castaneum, предлагает репертуар экспериментальных инструментов для генетических и эволюционных исследований, в том числе полностью аннотированной последовательности генома, транспозонов основе трансгенеза и эффективной РНК-интерференции (РНК-интерференции). Среди этих преимуществ, методы генной нокдаун РНК-интерференции, основанные лежат в основе исследований Tribolium. Т. castaneum показать надежную системный ответ RNAi, что позволяет выполнять RNAi на любом этапе жизненного просто инъекционных двухцепочечной РНК (дцРНК) в полости тела жука. В этом докладе, мы предоставляем обзор нашей личинок РНК-интерференции техники в Т. castaneum. Протокол включает (I) выделение надлежащего стадии Т. castaneum личинки для инъекций, (II) подготовка для установки впрыска, и (III) введение дцРНК. Личинок РНК-интерференции является простой, но мощный метод, который дает нам быстрый доступ к потери части-функции phenotypES, в том числе нескольких генов нокдаун фенотипов, а также серии гипоморфных фенотипов. Поскольку практически всех T. castaneum ткани чувствительны к внеклеточной дцРНК, личинок методика позволяет RNAi исследователей изучать широкий спектр тканей в различных контекстах, в том числе генетической основы организменном ответов на внешней окружающей среды. Кроме того, простота этой техники стимулирует больше студентов участие в исследованиях, что делает Т. castaneum идеальную генетическую систему для использования в классной комнате.

Одним из ключевых шагов для успешного инъекции, чтобы сделать хорошую иглу. Как описано в шаге 6, кончик иглы должен быть сломан до инъекционных T. castaneum. Примеры хороших и плохих игл показаны на рисунке 1. Хороший игла имеет острый и жесткий кончик, с примерно 0,05 мм отверстие диаметром (Рисунок 1В). Рисунок 2 представляет успешную инъекцию (2А и 2В), а также несколько случаев неудачных инъекций (Рисунки 2C-2F). С соответствующего размера инъекционной иглы, кончик иглы проникает в личиночной кутикулы с минимальным сопротивлением (Фигура 2А), и полученный раствор дцРНК (зеленый) поступает в личинок без утечки (фиг.2В). Не более залить, как это приведет к переполнению решения дсРНК даже с правильно подобранного инъекционной иглы (рис2C). Если кончик иглы слишком тонкий, кончик иглы часто не проникают в личиночной кутикулы и изгибы, делая инъекцию трудной (Рисунок 2D). Если это произойдет, обрезки кончик иглы иногда помогает. Большие иглы часто еще можно использовать, хотя и с некоторыми трудностями в проникающая личиночной кутикулы (Рисунок 2E). Однако большое количество раствора дцРНК легко вытеснены из иглы даже при небольшом давлении на шприц для инъекций, что часто приводит к переполнению раствора дцРНК (рис 2F). При выполнении RNAi, важно, чтобы иметь положительный контроль, чтобы оценить, что RNAi работает должным образом, и отрицательный контроль, чтобы убедиться, что наблюдаемый эффект не является неспецифический эффект дцРНК или следствием процедуры инъекции (например, травмы вызваны путем инъекции, или аномалий с эфирным наркозом). Инъекция дсРНК таргетирования EYFP может служитьхороший положительный контроль при использовании штамма 5,7 пу-11. Когда EYFP дсРНК впрыскивается в последней личиночной стадии, значительное снижение EYFP сигнала в будущих крыла зачатков можно наблюдать уже через день после инъекции (Рисунок 3А). Нокдаун EYFP завершена через два дня после инъекции EYFP дцРНК (фиг.3В), и это нокдаун устранена путем (3C и 3D рисунках) куколки и в течение всей жизни жука, если концентрация дцРНК достаточно высока (например, 1 мкг / мкл) 7. EYFP дцРНК также может быть использован в качестве отрицательного контроля, так как это не-эндогенный последовательность гена, и не должен вызывать морфологические или физиологические нарушения (3А-3D). Мы предоставили изображения личинок РНК-интерференции для рудиментарный (VG), критический ген крыла 12, в качестве другого примера, как эффективных эта инъекция основе РНК-интерференции техника в Т. castaneum. Когда дсРНК для VG впрыскивается в предпоследнем личинок (одной ступени до последней личиночной стадии), полная потеря крыла структур можно наблюдать в стадии куколки (Цифры 3E и 3F). Полученную взрослых также полностью отсутствует крыла структуры (рис 3G и 3Н). В результате РНК-интерференции для VG примером как надежность и системный характер РНК-интерференции в Т. castaneum. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Рисунок 1: (A) Примеры цельных, хороших, и плохих игл (B) Кончик хорошо сломанной хорошей иглы (C) Кончик сломанной иглы, которая является слишком большой и тупой (D) Кончик... из сломался<html> н игла, что слишком тонкая. Шкала баров (красный) составляют 0,05 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2:... (А) соответствующего размера инъекционной иглы вставляется в последней возрастной стадии личинки (В) Личинка соответствующим образом вводят с зеленого раствора дцРНК (С) Переполнение раствора дцРНК в точке инжекции, вызванной чрезмерной инъекции (D ) тонкой иглой не в состоянии проникнуть в личиночной кутикулы. (Е) большая инъекционной иглы вставляется в последней возрастной стадии личинки. (F) Личинка вводят с большой иглы, в результате чего переполнения и утечки раствора дцРНК. Стрелки указывают на иглы.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3: Примеры успешного РНК-интерференции в Т. castaneum. (AD) Последнее личинок впрыска результатов EYFP дцРНК к уменьшению экспрессии EYFP. (А) Личинки через один день после инъекции. (Б) Личинки через два дня после инъекции. (С) управления куколок. (D), куколки в результате личиночной EYFP дсРНК впрыска. Отрицательные элементы управления буфером инъекции (А, В) и DsRed дцРНК инъекции (С, D). Стрелки и стрелки указывают выражение EYFP или ее отсутствие в крыло зачатков и глаз, соответственно. (EH) PenКонечная личиночной РНК-интерференции для VG. (E) дикого типа куколки. (F) В.Г. РНК-интерференции куколки. Отсутствие крыла структур уже видно на стадии куколки (стрелка). G) дикого типа взрослых. (Н) VG RNAi взрослого. Крыло связанные структуры полностью отсутствуют (стрелка). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

РНК-интерференция (RNAi) основе методики генных нокдаун лежат в основе исследований Tribolium. Здесь мы предоставляем обзор нашей личинок РНК-интерференции техники в Tribolium castaneum. Личинок РНК-интерференции является простым, но мощная техника, которая обеспечивает быстрый доступ к с потерей функции фенотипов, что позволяет исследователям изучать функции генов в различных контекстах.

Личинок РНК-интерференция в Red мучного жука<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Использование РНК-опосредованного вмешательства стратегии кормления для выявления генов, участвующих в размерах тела регулированию в Нематода<em&gt; C. Элеганс</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Практического использования РНК-интерференции: устные доставка двуцепочечной РНК в липосомы перевозчиков для тараканов

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

Идентификация альтернативного сплайсинга и полиаденилирования в данных RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Выделение ядер из почек взрослой мыши для секвенирования одноядерной РНК

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...