Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
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Agradecemos al Centro de Bioinformática y Genómica Funcional (CBFG) en la Universidad de Miami para el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Miami subvención de puesta en marcha (YT), y la Fundación Nacional para la Ciencia (YT: IOS 0.950.964).

1. T. Acciones castaneum y cultivo <ol><li> Decidir sobre una T. cepa castaneum a utilizar para el experimento. NOTA: Varios T. lab-establecido castaneum cepas están disponibles. Ga-1 (Georgia-1) es la cepa parental de Ga-2 que se utilizó para la secuenciación del genoma 3. Desde Ga-1 comparte la mayoría de los polimorfismos de ADN (tales como polimorfismos de un solo nucleótido, SNP) con Ga-2, y es más saludable que Ga-2 debido a la menor endogamia, es ideal para los experimentos de RNAi. Pu-11 es otra cepa cómodo de usar , como su expresión amarilla mejorada única proteína fluorescente (EYFP) en el futuro primordios ala nos permite distinguir el último estadio larval de otros estadios (ver Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 12). Es importante documentar que escarabajo cepa se utilizó en el experimento, como fondos genéticos parecen significativamente affect del RNAi fenotipos 13. </li><li> Preparar T. castaneum harina de cultivo mediante la adición de 5% (en peso) de la levadura de cerveza previamente tamizada a la harina de trigo integral orgánica (después de mezclar, almacenar la harina de la cultura a -20 ° C). Alícuota de la harina de cultivo (a temperatura ambiente) en 6 botellas de valores Drosophila oz de plástico (alrededor de 40 g / botella). </li><li> T. Cultura castaneum a 30 ° C con 70% de humedad. Utilice una incubadora con humedad controlada, si es posible. Añadir 30-40 adultos por botella de cultivo (razón hombre: mujer 1: 1) para iniciar el cultivo. NOTA: Aunque el moho es rara vez un problema a 30 ° C, temperaturas más bajas (por ejemplo, 25 ° C) con un 70% de humedad puede causar el crecimiento de moho en la harina de la cultura. Baje la humedad si esto ocurre. </li><li> La transferencia de los adultos a un nuevo frasco de cultivo cada dos semanas durante el subcultivo (véase el paso 5.2 a 5.5 para cómo aislar los adultos a partir de harina de cultivo). NOTA: Se tarda unas tres semanas para obtener el último estadio las larvas. Alternativavamente, T. culturas castaneum se pueden mantener a una temperatura más baja (20-25 ° C), aunque con un período de cultivo más largo (tiempo de desarrollo a 25 ° C es aproximadamente el doble que a 30 ° C). </li></ol> 2 Preparación de Soluciones e Instrumentos para larvas inyección de dsRNA <ol><li> Sintetizar moléculas de dsRNA homólogos al gen diana por transcripción in vitro. Almacenar a -80 ° C. Ver Felipe y Tomoyasu 2011 11 para los procedimientos de biología molecular detalladas. Véase también la discusión de una serie de parámetros que deben tenerse en cuenta en el diseño de moléculas de dsRNA. </li><li> Hacer 10 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C) mezclando 8,5 ml de 1 M Na 2 HPO 4 con 1,5 ml de 1 M NaH 2 PO 4. Comprobar el pH con un medidor de pH y ajustar en consecuencia. </li><li> Hacer 1 ml de tampón 10X de inyección mediante la mezcla de 10 l de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6; l de 0,5 M KCl, 100 l de colorante alimentario verde, y 790 l de agua doblemente destilada (ddH2O). Diluir el tampón 10x inyección para hacer 2x tampón de inyección (200 l de 10x tampón de inyección + 800 l ddH 2 O). Almacenar tanto 10x y 2x de inyección de tampones a 4 ° C hasta que se necesite. </li><li> Preparar Sticky Glass Diapositivas. <ol><li> Cubrir un portaobjetos de vidrio entero con una forma de pegamento reposicionable para inyecciones larvales. Para adultos y pupas inyecciones, hacer dos finas tiras de pegamento a lo largo de los bordes más largos de la diapositiva. </li><li> Deje que el pegamento se seque durante varios días, lo que garantiza que el pegamento se mantiene lo suficientemente pegajosa para adherirse escarabajos a la diapositiva, al mismo tiempo de ser lo suficientemente flexible para facilitar su eliminación después de la inyección. NOTA: Si el pegamento se queda demasiado pegajoso, utilice un dedo y toque en la cola, lo que reducirá la pegajosidad. Cada diapositiva puede contener hasta 40 o 50 escarabajos, y puede ser reutilizado hasta que falla para sujetar los animales. Alterntivamente, cinta de doble cara también se puede utilizar, aunque la cinta se veces no adhesivo suficiente para mantener las larvas. </li></ol></li><li> Hacer una cesta eterización. <ol><li> Retire el émbolo de una jeringa desechable de 10 ml, y cortar la jeringa por la mitad alrededor de la línea 6 ml. </li><li> Deseche la mitad inferior de la jeringa. Calentar brevemente la superficie de corte de la parte superior de la jeringa con un quemador de gas, y empujar rápidamente el plástico derretido en una pieza de malla de nylon para pegar la malla en la jeringa. Recorte cualquier exceso de malla una vez que el plástico se endurece. </li></ol></li><li> Preparar la botella de éter. Añadir 30 ml de éter en una botella de vidrio de 100 o 250 ml de boca estrecha. Añadir varias piezas de papel de seda para mejorar la evaporación del éter. NOTA: Éter presenta un peligro de incendio y también es perjudicial. Siempre maneje éter bajo una campana de humos. Cierre la tapa bien mientras no esté en uso. NOTA: El hielo puede ser utilizado como una alternativa más segura (tal como en un salón de clases), aunque la Sedation es menos eficaz. </li></ol> 3 Preparación de larvas aparato de inyección <ol><li> Publicar un platina mecánica XY en un microscopio de disección. NOTA: etapas XY mecánica están disponibles en las principales compañías de microscopio. Alternativamente, las etapas de microscopio de bajo costo también se pueden utilizar para la mayoría de los microscopios de disección con algunas modificaciones (véase la Tabla de Materiales por ejemplo). </li><li> Coloque un manipulador de aguja mecánica cerca de la platina mecánica XY. </li><li> Montar una jeringa de inyección. Utilice una llave de paso de cuatro vías (con conexiones Luer) para conectar una jeringa desechable de 30 ml a un soporte de aguja de vidrio, lo que permite la manipulación de la jeringa de inyección sin afectar a la presión en la aguja de inyección (véase Philip y Tomoyasu 2011 11 para la jeringa de inyección detallada montaje). </li></ol> 4. Tirando agujas de inyección <ol><li> Tire las agujas de vidrio borosilicato (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm de longitud) por unextractor de aguja. NOTA: Para Sutter P-87 o P-97, use el ajuste &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tiempo = 90&quot; o seguir el capítulo 2 de la pipeta Cookbook: Adherente Cell, C. elegans, Drosophila, pez cebra y - programas recomendados. Los ajustes óptimos varían en función del modelo de la aguja extractora. El escenario de una aguja de inyección genérica Drosophila es un buen punto de partida. </li><li> Tienda sacó agujas en una caja de plástico (por ejemplo, una caja de CD de plástico) y seguro con extraíble masilla de montaje. </li></ol> 5. Aislamiento y Selección de las larvas <ol><li> Coloque un tamiz # 25 en un receptor tamiz. </li><li> Coloque el contenido de la botella de cultivo (escarabajos y harina de cultura) en el tamiz, y tamizar el contenido inmediatamente. No dejar el contenido en el tamiz sin tamizar, como larvas tratará rápidamente para excavar a través del tamiz y se atascan. Tamizar agresivamente los contenidos para que la caída de harinaa través y dejar las larvas más viejas (por lo general 6 y 7 de larvas), pupas y adultos (junto con sus cutículas desechadas, exuvias) detrás en la parte superior de la criba. </li><li> Transfiera los materiales restantes en el tamiz (escarabajos y exuviae) a la bandeja de la semilla. Siga punteando en la sartén para evitar que los escarabajos se escape. </li><li> Retire la exuvia y las partículas de harina restante sobre la superficie de los escarabajos soplando suavemente sobre la sartén semilla. </li><li> Pulse la sartén semilla para mover el contenido a la parte inferior de la sartén. Luego, deje el pan sin explotar durante varios segundos. Espere a que los adultos, que son más móviles que otras etapas, a salir de la pila. Retire los adultos mediante el uso de un pincel de arte (por ejemplo, 1 cm de ancho). </li><li> Pupas independiente golpeando suavemente la bandeja de semillas mientras se mantiene la boca de la sartén ligeramente hacia abajo, como pupas tienden a rodar más rápido hacia la boca. Utilice un pincel para eliminar las pupas, dejando sólo las larvas en el platillo de la semilla. </li><li> Plas de las larvas aisladas en una placa de Petri limpia. Seleccione una etapa apropiada de larvas para inyección y colocarlos en un plato aparte Petri. NOTA: larvas de último estadio temprano (1-2 días después de la muda larval final) A menudo son adecuadas cuando se analiza el efecto de RNAi en morfologías de adultos, así como en la metamorfosis. Es, sin embargo, a veces es necesario para llevar a cabo RNAi en la penúltima (o incluso antes) etapa para evaluar la función del gen temprano (por ejemplo, las figuras 3E-3H. También véase Clark-Hachtel et al. 2013 12). Utilice pupas como una referencia para identificar el tamaño de las larvas de instar. El último estadio las larvas son ligeramente más largas que las pupas. Alternativamente, pu-11 puede ser usado para identificar el último estadio las larvas, así como para determinar el curso temporal del desarrollo de larvas de último estadio (Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 12). </li><li> Mantener las larvas seleccionado en una placa de Petri hasta eterización. Coloque el restode larvas y otras etapas de escarabajos (como pupas y adultos) de nuevo en una botella de cultivo con harina y devolverlo a la incubadora. </li></ol> 6 Preparación de agujas de inyección <ol><li> Coloque una aguja de vidrio previamente tirado sobre un portaobjetos de vidrio utilizando tachuela pegajosa o cinta de doble cara. Con unas pinzas, se examinará el tirado de la aguja mientras mira a través del microscopio de disección para ver donde las curvas de punta. Coge la zona un poco hacia el lado de la punta de donde las curvas de aguja con las pinzas y giro para romper. </li><li> Mantenga buenos agujas y desechar otros. Considere una buena aguja como que tiene una abertura que no es ni demasiado grande ni demasiado pequeño (alrededor de 0,05 mm de diámetro. Figuras 1A y 1B), y está en ángulo para hacer la penetración de la cutícula de las larvas más fácil (Figuras 1B y 2A-2B). Considere la posibilidad de un mal aguja como (i) demasiado pequeña, por lo que la absorción de la solución de dsRNA en la aguja dificulto (paso 7) (Figuras 1D y 2D), (ii) demasiado grande, causando daño de las larvas y la posible letalidad después de la inyección (Figuras 1C y 2F), (iii) romo, lo que hace difícil la penetración de la cutícula y el aumento de la lesión. </li><li> Inserte la aguja en el porta-agujas. <ol><li> En primer lugar, desenroscar la punta del soporte de la aguja y colocar el extremo posterior de la aguja en la punta soporte. A continuación, colocar la junta de goma debajo de la punta soporte (por lo menos 1 cm del extremo posterior de la aguja de vidrio). </li><li> Inserte la parte posterior de la aguja en el soporte, con la junta de goma completamente insertado en la abertura del soporte de la aguja. Enrosque la punta de nuevo en el soporte. </li></ol></li><li> Coloque el soporte de la aguja montada sobre el manipulador de la aguja. Mantenga el soporte de la aguja cerca de la horizontal. Ajustar la posición del manipulador, por lo que la punta de la aguja se encuentra en el centro de la vista cuando se mira a través de la microscope. </li></ol> 7. Solución Frontloading dsRNA en la Aguja <ol><li> Preparar la solución de inyección de dsRNA justo antes de la inyección mediante el ajuste de la concentración con ddH 2 O y la mezcla de la solución de dsRNA con volúmenes iguales de tampón de inyección 2x (paso 2.3). Guarde la solución mezclada en el hielo. Véase la discusión con respecto a la concentración de ARN de doble cadena. </li><li> Cortar la punta de una punta de pipeta desechable 20 l. Pipetear 10 l de la solución en la punta de pipeta recortada. Retire cuidadosamente la punta de la pipeta de la pipeta mientras se mantiene el fluido en la punta al proporcionar contrapresión. Alternativamente, retirar cuidadosamente la punta y luego pasar la solución al extremo de la punta, proporcionando la presión con un dedo. </li><li> Coloque la punta de la pipeta con la solución de dsRNA en la platina del microscopio usando la tachuela pegajosa con la abertura hacia la punta de la aguja. </li><li> Mirando a través del microscopio, mueva lentamente la punta cargado hacia la aguja hasta que la punta de laaguja está justo dentro de la punta de la pipeta cargada y en la solución. </li><li> Mientras mira a través del microscopio, tire suavemente el émbolo de la jeringa de inyección para extraer lentamente la solución de ARN de doble cadena en la aguja. NOTA: No sobrecargue la aguja. Como el final de la solución de dsRNA se aproxima a la punta de la aguja, reducir la tasa de tracción y detener la carga de la solución antes de la punta de la aguja alcanzaría aire. Si el aire llega a la punta, la solución se extrae rápidamente en el soporte de la aguja, lo que resulta en problemas de contaminación graves. Los procedimientos detallados de limpieza del soporte de la aguja se describen en Felipe y Tomoyasu 2011 11. </li><li> Retire la presión de la jeringa de inyección y de soporte de la aguja con la apertura de la llave de paso. A continuación, mover la punta de pipeta de distancia desde la punta de la aguja. Levante la aguja a partir de la etapa para evitar dañar accidentalmente la aguja al colocar las larvas en el escenario. Retire la punta de la pipeta vacía desde el escenario. </li></ol&gt; 8. inyección de dsRNA <ol><li> Coloque las larvas dentro de la canasta eterización. Utilice menos de 10 larvas si el aprendizaje de la técnica. Utilice 30-40 larvas en la primera ronda, una vez familiarizado con la técnica. </li><li> Coloque la canasta con larvas en la botella de éter y cierre la tapa. NOTA: Éter presenta un peligro de incendio y también es perjudicial. Realice este paso bajo una campana de humos. </li><li> Larvas Etherize durante unos 3 min. Compruebe las larvas para el movimiento después de 3 min. Coloque de nuevo en la botella de éter durante otros 30 segundos si todavía se están moviendo. No Etherize durante más de 5 minutos, ya que esto puede aumentar la letalidad. NOTA: El tiempo óptimo eterización puede variar dependiendo de la temperatura y la humedad. </li><li> Transferir las larvas anestesiado de la canasta hasta el borde antiadherente de un portaobjetos de vidrio pegajosa. Con unas pinzas, y mientras mira a través del microscopio, recoger las larvas cada uno por uno y colocarlos en la diapositiva. Colóquelos lateralmente y golpear suavemente hacia abajo sus cuerpos from cabeza a la cola con el fórceps, que se extiende ligeramente a medida que avanza, para asegurarse de que están asegurados en la diapositiva. </li><li> Colocar la placa pegajosa con larvas en la platina del microscopio. </li><li> Insertar la aguja cargada dsRNA suavemente en el lado dorsal de las larvas para evitar daños en el SNC. Evite también la línea media dorsal, como el corazón larval se encuentra aquí. En esta y las siguientes etapas, utilice siempre la etapa de mover las larvas a la aguja (en lugar de utilizar el manipulador de aguja para mover la aguja). NOTA: El sitio de la inyección específica no importa como RNAi en T. castaneum parece ser sistémica. Sin embargo, es generalmente más fácil de inyectar en el lado dorsal de los segmentos torácicos o abdominales. </li><li> Después de insertar la aguja en las larvas, saque la aguja ligeramente hacia atrás para dejar espacio para el ARN de doble cadena para entrar en la cavidad del cuerpo de las larvas. </li><li> Empuje suavemente en la jeringa de inyección hasta que el color verde a su vez las larvas (o el color de la memoria intermedia de inyección) y buscar stretched y lleno. NOTA: Si el aprendizaje de la técnica, tratar de inyectar tanto como sea posible para determinar la cantidad de solución que se puede inyectar en una larva sin letalidad significativa. Es generalmente de aproximadamente 0,5-0,7 l. </li><li> Retire la aguja de las larvas. Al retirar la aguja, extraiga un poco atrás de la jeringa de inyección para evitar la pérdida de ARN de doble cadena (también tenga cuidado de no tirar en el aire). </li><li> Inyectar todas las larvas en la diapositiva. Asegúrese de eliminar las larvas que no fueron inyectados con éxito. Inyección completa antes de larvas despertar (en aproximadamente 10 min). </li><li> Retire la diapositiva con larvas inyectado desde el microscopio de inyección y dejar el portaobjetos durante 5 minutos más hasta que todas las larvas se recupere de la eterización. </li><li> Con unas pinzas y bajo un microscopio de disección, levante suavemente las larvas de la cabeza a la cola para liberarlos de la diapositiva pegajosa. Coloque las larvas recién publicado en una placa de Petri limpia. Deja las larvas en la placa de Petri durante 10-15 minutos para permitir la inyección wound a coagularse. </li><li> Colocar las larvas en una nueva botella con harina limpio y apropiadamente etiqueta con el nombre de la cepa, el tipo de dsRNA inyectado, la concentración de dsRNA, número de larvas inyectado, y la fecha. </li><li> Cultura las larvas inyectado a 30 ° C con 70% de humedad. Observar las larvas de RNAi fenotipos regularmente. NOTA: La última pupate estadio las larvas dentro de los 7 días. Entonces, las pupas se Eclose en adultos después de 7 días (si no hay anormalidad en el momento causado por RNAi). </li></ol> 9. Confirmación de la Rebaja y fenotípicas análisis <ol><li> Considere la posibilidad de evaluar la eficiencia de RNAi tumbar por varias técnicas de biología molecular diferentes, tales como cuantitativa transcripción reversa-PCR (QRT-PCR) y Western Blot. Ver protocolo de Miller et al. 2012 7 y Felipe y Tomoyasu 2011 11 para detallado qPCR y Western Blot, respectivamente. </li><li> Analizar RNAi fenotipos relacionados. NOTA: RNAi relacionadosfenotipos se pueden observar en diferentes etapas y bajo diferentes condiciones de cultivo, dependiendo de los genes que fueron dirigidos. RNAi puede afectar a la morfología del escarabajo, la metamorfosis, la fisiología y el comportamiento. ¿Con qué frecuencia la presencia de fenotipo se comprueba y bajo qué condiciones los escarabajos se crían deben adaptarse a las preguntas específicas que están siendo investigados por RNAi. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Hay una serie de cuestiones importantes que deben tenerse en cuenta para garantizar el éxito de RNAi, incluyendo la longitud y la concentración de las moléculas de ARN de doble cadena, la competencia entre las diferentes moléculas de ARN de doble cadena (al intentar derribar múltiples), y la posibilidad de fuera de objetivo efectos (OTE). dsRNA Longitud La longitud de las moléculas de dsRNA afecta la eficiencia de la respuesta sistémica RNAi, con un dsRNA ya ser más eficientes para desencadenar RNAi 7,14,15 (aunque actualmente se desconoce el límite más largo de dsRNA). La longitud de dsRNA debe ser más largo que 50 pb para inducir eficaz RNAi en T. castaneum 7. dsRNA entre 150 pb y 500 pb parece ser ideal para experimentos de RNAi. Aunque más largas moléculas de ARN de doble cadena se pueden utilizar también, tendrán una mayor probabilidad de OTE y el paso de genes de clonación será cada vez más difícil. dsRNA Concentración ve_content &quot;&gt; Diferentes grados de caída gen se puede lograr en función de la concentración de dsRNA. 1 g / l parece ser una concentración de partida razonable, que a menudo produce un fenotipo casi nula (puede variar dependiendo del gen (s) de interés ). RNAi se puede realizar con una concentración más alta (por ejemplo, 7-8 g / l) para obtener un fenotipo más fuerte RNAi. RNAi con una dilución en serie de dsRNA a veces puede ser beneficioso para producir una serie de fenotipos hypomorphic (datos suplementarios de Tomoyasu et al. 2009 8, y Borràs-Castells datos no publicados). RNAi Competencia Múltiples genes desmontables se puede lograr en T. castaneum mediante la inyección de varias diferentes moléculas de dsRNA simultáneamente. Sin embargo, también se sabe que tiene varias diferentes moléculas de dsRNA presentes en el organismo a menudo resulta en la competencia entre los dsRNAs para el acceso a los componentes de RNAi <shasta&gt; 7,14. Es importante la utilización de la misma longitud y la misma concentración para todos dsRNA al intentar múltiples genes desmontables para evitar un dsRNA fuera compitiendo los demás (aunque, más ajustes de la longitud dsRNA y concentración pueden ser necesarios cuando los niveles de expresión muy diferentes entre los genes diana). Nosotros, al igual que otros, hemos realizado con éxito caída doble y triple (por ejemplo, Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17 y Yang et al. 2009 18). Aunque factible, cuádruples RNAi (o más) puede ser un reto, ya que probablemente causaría una reducción significativa de la eficiencia de RNAi para los cuatro genes diana. Off de metas OTE es una preocupación inherente a los enfoques basados ​​en RNAi. Una forma de minimizar OTE es identificar regiones en el gen diana que comparten secuencias similares con otros genes y evitar estas regiones en el diseño de dsRNA. Un análisis BLAST simple en contra de la T. castaneum conjunto de genes predicho puede identificar tales regiones. Varias herramientas en línea también permiten la evaluación del potencial OTA (por ejemplo, E-RNAi 19). Realización de RNAi para dos regiones no superpuestas del gen diana es una manera fácil y eficiente para eliminar la posibilidad de que observaron fenotipos son causados ​​por OTE. La posibilidad de OTE se minimiza si RNAi para dos regiones no superpuestas produce los mismos fenotipos (a menos que las dos regiones no superpuestas comparten una secuencia similar). Evaluación de gen desmontables por medios distintos de los análisis fenotípico es a menudo crítico para efectivamente presentes datos relacionados con RNAi. Dos formas principales para evaluar genes desmontables son QRT-PCR y Western blot. QRT-PCR es una manera conveniente para medir el nivel del ARNm diana, y se ha utilizado en muchos estudios relacionados RNAi-incluyendo los de T. castaneum (véase Miller et al. 2012 7 por ejemplo). However, se debe tener cuidado, como hemos visto recientemente algunos casos en los que el nivel de ARNm objetivo hasta reguladas por RNAi (aunque el producto de proteína es regulada hacia abajo-) (Borràs-Castells datos no publicados). Aún no se sabe si este ARNm RNAi inducida sobre regulación puede ser generalizado o única de ciertos genes. El análisis de transferencia Western es otra manera de confirmar gen desmontables. Este método es bastante fiable, ya que mide la cantidad del producto de proteína final. El requisito de un anticuerpo específico contra la proteína producto del gen diana es una desventaja de este enfoque. La utilización de múltiples mediciones independientes además de análisis fenotípico aumentará la confianza de los datos fenotípicos obtenidos por análisis basado en RNAi. Desde su concepción en T. castaneum, RNAi principalmente se ha usado para estudiar la función de genes en el desarrollo y formación de patrones. Estos T. estudios de desarrollo castaneum han tenido mucho éxito en caracterizing evolutivamente conservados y divergieron funciones de los genes (revisado en 2008 Denell 1 y Klingler 2004 2). Sin embargo, estudios basados ​​en RNAi en T. castaneum no se limitan a la biología del desarrollo. Por ejemplo, el ARNi puede ser utilizado para estudiar la función de genes en una amplia gama de respuestas fisiológicas y de comportamiento, incluyendo la tolerancia al estrés, la depredación, la agresión, la elección de pareja, patrones de actividad, y los mecanismos de defensa. Una de las dificultades de la aplicación de RNAi a estos contextos es la probabilidad de efectos pleiotrópicos. A menudo, los genes de interés tendrán una variedad de papeles en todo el T. ciclo de vida castaneum, con lo que la eliminación de genes no deseados sin efectos fenotípicos difíciles. Sin embargo, la capacidad de realizar fácilmente RNAi en una variedad de etapas a menudo puede ser una estrategia eficaz para evitar estos efectos pleiotrópicos. Por ejemplo, la realización de RNAi en los adultos en lugar de larvas o pupas podría permitirnos eludir unintendido letalidad causada por la caída de genes durante el desarrollo temprano. La flexibilidad de la respuesta de RNAi en T. castaneum por lo tanto hace que este modelo una opción atractiva para la adaptación de RNAi para los experimentos de la función de genes en las respuestas fisiológicas y de comportamiento. El T. sistema castaneum también es ideal para su uso en un laboratorio de enseñanza. T. castaneum puede ser fácilmente cultivadas en una harina / mezcla de la levadura a temperatura ambiente (25 ° C) sin subcultivo frecuente, y las técnicas de ARNi en T. castaneum son lo suficientemente simple como para ser adaptado a un laboratorio con científicos jóvenes y de aprendizaje. Como RNAi se está convirtiendo en una técnica esencial en una variedad de campos biológicos, es fundamental que los estudiantes están expuestos a esta técnica. La naturaleza recta de avance de la técnica de RNAi larval en T. castaneum también alienta a más estudiantes a que participen en la investigación, por lo que T. castaneum un candidato ideal para un salón de clases sistema genético orientado. &lt;/ P&gt;

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Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

El escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum, está ganando popularidad en diversos campos de la biología, debido en parte a la facilidad de realización de la interferencia de ARN (RNAi) 1-3. Técnicas de genes basados ​​en RNAi desmontables permiten a los científicos para llevar a cabo la pérdida de la función de análisis sin utilizar métodos genéticos complejos. T. castaneum mostrar una respuesta sistémica RNAi robusta, por lo que es posible llevar a cabo RNAi en cualquier etapa a través de simple inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en la cavidad del cuerpo del escarabajo 4-6. Caída simultánea de múltiples genes también es factible en T. castaneum mediante la inyección de dos o más moléculas de dsRNA diferentes al mismo tiempo 7,8. Además, una serie de fenotipos hypomorphic se puede generar mediante la reducción de la concentración de inyección de dsRNA 8. Estas características hacen que las técnicas de genética inversa basada en RNAi atractivas alternativas a la genética a plazo tradicionales en T. castaneum. Dado que prácticamentetodo T. castaneum tejidos son susceptibles a moléculas de dsRNA extracelulares 9, esta técnica permite a los investigadores estudiar una amplia variedad de tejidos en diversos contextos. Además, si bien este informe se centra en la realización de RNAi en T. castaneum, muchos de los procedimientos aquí descritos son aplicables a otros insectos. Por lo tanto, este protocolo es útil para aquellos que deseen realizar la pérdida de la función de análisis en sus contextos de interés en T. castaneum, así como para los investigadores que desean aplicar una técnica basada en RNAi a otros insectos. La inyección de dsRNA en larvas permite un análisis funcional en una variedad de etapas de la vida del escarabajo, incluyendo la larva, pupa y adulto Etapas 4,5,10. Hemos informado anteriormente de nuestro protocolo de RNAi larval general, incluidos los procedimientos de biología molecular 11. En el presente informe, nos centramos en la descripción de los procedimientos de inyección de ARN de doble cadena, que se explican mejor con ayudas visuales. Proporcionamosprocedimientos detallados paso a paso de inyección, así como ejemplos de buenas y malas de inyección. Este protocolo visual complementa nuestro protocolo anterior, y cuando se combinan, proporcionan una visión más completa de los procedimientos de larvas de RNAi en T. castaneum. Además, se discuten los parámetros de moléculas de dsRNA que podrían afectar el éxito de RNAi, la aplicación de ensayos basados ​​en RNAi para la investigación fisiológica, así como la aplicabilidad del protocolo de RNAi de larvas en un laboratorio de enseñanza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

El escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum, ofrece un repertorio de herramientas experimentales para estudios genéticos y de desarrollo, incluyendo una secuencia totalmente anotada genoma, la transgénesis basado en transposón, y el ARN de interferencia efectiva (RNAi). Entre estas ventajas, las técnicas de genes desmontables basados ​​en RNAi son el núcleo de la investigación Tribolium. T. castaneum mostrar una respuesta sistémica RNAi robusta, por lo que es posible llevar a cabo RNAi en cualquier etapa de la vida por la simple inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en la cavidad del cuerpo del escarabajo. En este informe, se proporciona un resumen de nuestra técnica de RNAi larval en T. castaneum. El protocolo incluye (i) aislamiento de la etapa apropiada de T. larvas castaneum para inyección, (ii) la preparación para el ajuste de la inyección, y (iii) la inyección de dsRNA. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que nos proporciona un acceso rápido a phenotyp pérdida de funciónes, incluyendo múltiples fenotipos desmontables de genes, así como una serie de fenotipos hypomorphic. Dado que prácticamente todos los T. castaneum tejidos son susceptibles a dsRNA extracelular, la técnica de RNAi larval permite a los investigadores estudiar una amplia variedad de tejidos en diversos contextos, incluyendo la base genética de las respuestas organísmicos para el medio ambiente exterior. Además, la simplicidad de esta técnica estimula una mayor participación de los estudiantes en la investigación, por lo que T. castaneum un sistema genético ideal para su uso en el aula.

Uno de los pasos clave para la inyección de éxito es hacer una buena aguja. Como se describe en el paso 6, la punta de la aguja debe ser roto antes de inyectar T. castaneum. Ejemplos de agujas buenos y malos se muestra en la Figura 1. Una buena aguja tiene una punta afilada y rígido, con una abertura de diámetro de aproximadamente 0,05 mm (Figura 1B). La Figura 2 presenta una inyección de éxito (Figuras 2A y 2B), así como varios casos de inyecciones sin éxito (Figuras 2C-2F). Con una aguja de inyección de tamaño adecuado, la punta de la aguja penetra la cutícula larval con mínima resistencia (Figura 2A), y la solución dsRNA (verde) desemboca en las larvas sin ninguna fuga (Figura 2B). No sobre-inyección, ya que hará que el desbordamiento de la solución de ARN de doble cadena, incluso con una aguja de inyección de tamaño adecuado (Figura2C). Si la punta de la aguja es demasiado delgada, la punta de la aguja a menudo no penetrar en la cutícula de las larvas y curvas, lo que hace difícil la inyección (Figura 2D). Si esto sucede, el recorte de la punta de la aguja a veces ayuda. Agujas más grandes son a menudo aún utilizable, aunque con algunas dificultades para penetrar la cutícula larval (Figura 2E). Sin embargo, una gran cantidad de la solución de dsRNA es empujado fácilmente hacia fuera de la aguja incluso con una ligera presión en la jeringa de inyección, a menudo resulta en un desbordamiento de la solución de dsRNA (Figura 2F). Al realizar RNAi, es importante tener un control positivo para evaluar que el ARNi está funcionando correctamente, y un control negativo para verificar que el efecto observado no es un efecto no específico de dsRNA o una consecuencia de los procedimientos de inyección (tales como el daño causado por inyección, o anormalidad de eterización). La inyección de dsRNA EYFP de direccionamiento puede servir como unbuen control positivo cuando se utiliza la cepa de 5,7 pu-11. Cuando EYFP dsRNA se inyecta en la última etapa larval, una reducción significativa en la señal de EYFP en el futuro los primordios de ala puede observarse tan pronto como un día después de la inyección (Figura 3A). La caída de EYFP es completa dos días después de la inyección de la EYFP dsRNA (Figura 3B), y esta caída persiste a través de la (Figuras 3C y 3D) de la etapa de pupa y durante toda la vida del escarabajo si la concentración de dsRNA es lo suficientemente alta (por ejemplo, 1 g / l) 7. EYFP dsRNA también puede ser utilizado como un control negativo, ya que es una secuencia de gen no endógeno y no debe causar interrupciones morfológicos o fisiológicos (Figuras 3A-3D). Proporcionamos imágenes de larvas RNAi para vestigial (vg), un gen crítico ala 12, como otro ejemplo de cómo efcionará esta técnica de ARNi basados ​​en la inyección es en T. castaneum. Cuando dsRNA para VG se inyecta en larvas penúltima etapa (una etapa antes de la última etapa larval), una pérdida completa de las estructuras de las alas puede ser observado en la fase de pupa (Figuras 3E y 3F). El adulto que resulta también carece por completo las estructuras de las alas (Figuras 3G y 3H). El resultado RNAi para vg ejemplifica tanto la solidez y el carácter sistémico de RNAi en T. castaneum. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: (A) Ejemplos de agujas ininterrumpidas, buenas y malas (B) La punta de una buena aguja bien roto-(C) La punta de una aguja rota que es demasiado grande y romo (D) La punta... de una quiebra<html> n de aguja que es demasiado delgada. Las barras de escala (rojo) son de 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2:... (A) una aguja de inyección de tamaño adecuado inserta en el último instar de la larva (B) Larva inyecta apropiadamente con la solución de dsRNA verde (C) de desbordamiento de la solución de dsRNA en el punto causado por la sobre-inyección de inyección (D ) una aguja fina no poder penetrar en la cutícula de las larvas. (E) Una aguja de inyección grande insertado en el último instar de la larva. (F) Larva inyecta con una aguja grande, resultando en desbordamiento y las fugas de la solución de dsRNA. Las flechas indican las agujas.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Ejemplos de éxito RNAi en T. castaneum. (AD) última inyección de larvas de los resultados EYFP de dsRNA en una reducción de la expresión EYFP. (A) Las larvas un día después de la inyección. (B) Las larvas de dos días después de la inyección. (C) pupas de control. (D) resultante de pupas inyección larval EYFP dsRNA. Los controles negativos son la inyección de tampón (A, B) y dsRed inyección de dsRNA (C, D). Las puntas de flecha y las flechas indican la expresión EYFP o falta de ella en los primordios y ojos ala, respectivamente. (EH) Penúltima larval RNAi para vg. (E) de tipo salvaje pupa. (F) vg RNAi pupa. La falta de estructuras de las alas es ya visible en la fase de pupa (flecha). G) de tipo salvaje adulto. (H) vg RNAi adulto. Estructuras de ala relacionados faltan por completo (flecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Investigación

Biología

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Exploración de los recursos de hongos entomopatógenos de los barrenadores forestales de la madera

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Evaluación de hongos entomopatógenos en poblaciones silvestres de Monochamus alternatus para aplicaciones de biocontrol en barrenadores f

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...