Name: larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Vi tackar Centrum för bioinformatik och funktionsgenomik (CBFG) vid Miami University för teknisk support. Detta arbete stöddes av Miami University startbidrag (YT) och National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

1. T. castaneum Aktier och Odling <ol><li> Besluta om en T. castaneum stam att använda för experimentet. OBS: Flera labb etablerade T. castaneum stammar är tillgängliga. Ga-1 (Georgia-1) är moderstammen i Ga-2 som användes för genomsekvense 3. Eftersom Ga-1 aktier flesta DNA-polymorfismer (såsom single nucleotide polymorphisms, SNP) med Ga-2, och är friskare än Ga-2 på grund av mindre inavel, är den idealisk för RNAi-experiment. Pu-11 är ett annat praktiskt påfrestning att använda , eftersom dess unika förbättrad gula fluorescerande protein (EYFP) uttryck i framtiden flygeln primordia tillåter oss att skilja den sista larv instar från andra instars (se figur S4 av et al. Clark-Hachtel 2013 12). Det är viktigt att dokumentera vilken skalbagge stam användes i experimentet, som genetiska bakgrunder förefaller signifikant affect RNAi fenotyper 13. </li><li> Förbered T. castaneum kultur mjöl genom tillsats av 5% (vikt) av i förväg siktat öljäst till organisk hel-vetemjöl (efter blandning, förvara kultur mjöl vid -20 ° C). Alikvotera kultur mjöl (vid rumstemperatur) i 6 oz plast Drosophila stock flaskor (omkring 40 g / flaska). </li><li> Kultur T. castaneum vid 30 ° C med 70% luftfuktighet. Använd en fuktighetskontrollerad inkubator om möjligt. Lägg 30-40 vuxna per odlingsflaska (män: kvinnor förhållandet 1: 1) för att starta kulturen. OBS: Även om formen är sällan ett problem vid 30 ° C, lägre temperaturer (t.ex. 25 ° C) med 70% luftfuktighet kan orsaka mögeltillväxt i kulturen mjöl. Sänk luftfuktigheten om detta inträffar. </li><li> Överför de vuxna till en ny kultur flaska varannan vecka för subodling (se steg från 5,2 till 5,5 för hur man isolera vuxna från kultur mjöl). OBS: Det tar ungefär tre veckor att få det sista stadiet larver. Alternattivt, T. castaneum kulturer kan hållas vid en lägre temperatur (20-25 ° C), om än med en längre odling period (utvecklings tid vid 25 ° C är ungefär dubbelt så stor som vid 30 ° C). </li></ol> 2 Beredning av lösningar och instrument för Larv dsRNA Injektion <ol><li> Syntetisera dsRNA-molekyler som är homologa med målgenen genom transkription in vitro. Förvara vid -80 ° C. Se Filip och Tomoyasu 2011 11 för detaljerade molekylärbiologiska förfaranden. Se även diskussion om ett antal parametrar som måste beaktas när man utformar dsRNA molekyler. </li><li> Gör 10 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,6 vid 25 ° C) genom att blanda 8,5 ml 1 M Na 2 HPO 4 med 1,5 ml av 1 M NaH 2 PO 4. Kontrollera pH med en pH-meter och justera. </li><li> Gör 1 ml 10x injektion buffert genom att blanda 10 | il av 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,6 vid 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 pl grön livsmedelsfärg och 790 l av dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O). Späd 10x injektionsbuffert till 2x injektion buffert (200 l 10x injektion buffert + 800 l DDH 2 O). Lagra både 10x och 2x injektion buffertar vid 4 ° C tills det behövs. </li><li> Förbered Sticky glas. <ol><li> Täck en hel glasskiva med en form av flyttbar lim för larv injektioner. För vuxna eller PUPP injektioner, göra två tunna remsor av lim längs de längre kanterna på bilden. </li><li> Låt limmet torka i flera dagar, vilket säkerställer att limmet fortfarande är klibbigt nog att hålla sig skalbaggar till bilden, samtidigt som resterande böjlig nog för att underlätta deras avlägsnande efter injektion. OBS: Om limmet förblir alltför klibbigt, använd ett finger och knacka på limmet, vilket kommer att minska klibbigheten. Varje bild kan innehålla upp till 40 eller 50 skalbaggar, och kan återanvändas tills det inte säkert hålla djuren. Alterntivt kan dubbelhäftande tejp också användas, även om bandet ibland Ej klister nog att hålla larver. </li></ol></li><li> Gör en eterisering Basket. <ol><li> Ta bort kolven från en 10 ml engångsspruta, och skär sprutan på mitten runt 6 ml linjen. </li><li> Kassera den nedre halvan av sprutan. Kortfattat värma den skurna ytan av den övre delen av sprutan med en gasbrännare, och snabbt driva smält plast på en bit nylonnät för att limma mesh på sprutan. Klipp bort överflödigt nät när plasten härdar. </li></ol></li><li> Förbered eter flaskan. Lägg 30 ml eter till en smal klöv 100 eller 250 ml glasflaska. Tillsätt flera bitar av mjukpapper för att öka förångning av eter. OBS: Eter utgör en brandrisk och är också skadligt. Hantera alltid eter under en huv. Stäng locket tätt när den inte används. OBS: Is kan användas som ett säkrare alternativ (till exempel i ett klassrum), även om sedation är mindre effektiv. </li></ol> 3 Beredning av Larv Injection Apparatus <ol><li> Lägg ut en XY mekanisk skede på en dissekera mikroskop. OBS: XY mekaniska steg är tillgängliga från stora mikroskop företag. Alternativt kan billiga steg mikroskop också användas för de flesta dissekera mikroskop med vissa modifieringar (se Material tabellen till exempel). </li><li> Placera en mekanisk nål manipulator nära XY mekaniska scenen. </li><li> Sätt ihop en injektionsspruta. Använd en fyra-vägs avstängningskran (med Luer-anslutningar) för att ansluta en 30 ml engångsspruta till en glas nålhållare, vilket tillåter manipulering av injektionssprutan utan att påverka trycket i injektionsnålen (se Philip och Tomoyasu 2011 11 för den detaljerade injektionsspruta montering). </li></ol> 4. Draginjektionsnålar <ol><li> Dra borosilikatglas nålar (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lång) med ennål avdragare. OBS: För Sutter P-87 eller P-97, använd inställningen &quot;Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tid = 90&quot; eller följa kapitel 2 i Pipette Cookbook: Oförenligt Cell, C. elegans, Drosophila, och Zebrafish - Rekommenderade program. De optimala inställningarna varierar beroende på vilken modell av nålen avdragare. Inställningen för en generisk Drosophila injektionsnål är en bra utgångspunkt. </li><li> Store drog nålar i ett plasthölje (t.ex. en plast CD-fodral) och säkra med avtagbar montering kitt. </li></ol> 5. Isolering och Val av larver <ol><li> Placera en # 25 sikt på en sikt mottagare. </li><li> Placera innehållet i odlingsflaska (skalbaggar och kultur mjöl) på sikten, och sålla innehållet omedelbart. Lämna inte innehållet på sikten utan siktning, som larver kommer snabbt försöka gräva genom sikten och fastna. Aggressivt sålla innehållet att låta mjölet fallaigenom och lämnar äldre larver (vanligtvis 6: e och 7: e INSTAR larver), puppor och vuxna (tillsammans med deras gjutna-off nagelband, exuviae) bakom ovanpå sikten. </li><li> Överför det material som finns kvar på sikten (skalbaggar och exuviae) till utsädet pannan. Håll knacka pannan för att förhindra skalbaggar från att fly. </li><li> Avlägsna exuviae och mjölpartiklar som finns kvar på ytan av de skalbaggar genom att försiktigt blåsa över fröet pannan. </li><li> Tryck fröet pan att flytta innehållet till botten av pannan. Sedan lämnar pannan outnyttjad i flera sekunder. Vänta de vuxna, som är mer rörliga än andra stadier, att komma ut ur högen. Ta vuxna med hjälp av en konst pensel (t.ex. 1 cm bredd). </li><li> Separat puppor genom att försiktigt knacka fröet pan samtidigt hålla mynningen av pan något nedåt, så puppor tendens att rulla snabbare mot munnen. Använd en pensel för att ta bort puppor, vilket innebär att endast larver på fröet pannan. </li><li> Place den isolerade larver i en ren petriskål. Välj ett lämpligt skede av larver för injektion och placera dem i en separat petriskål. OBS: Tidigt förra stadiet larver (1-2 dygn efter sista larv molt) är ofta lämpliga vid analysen av RNAi effekten på vuxna morfologier samt metamorfos. Det är dock ibland nödvändigt att utföra RNAi på näst sista (eller ännu tidigare) steget att utvärdera tidig genfunktion (t.ex. figurerna 3E-3H. Se även Clark-Hachtel et al. 2013 12). Använd puppor som storleksreferens för att identifiera stadiet av larver. Det sista stadiet larver är något längre än puppor. Alternativt kan pu-11 användas för att identifiera den sista stadiet larver samt att bestämma tidsförloppet för utveckling av förra stadiet larver (Figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12). </li><li> Håll den valda larver i en petriskål tills eterisering. Placera restenlarver och andra stadier av skalbaggar (som puppor och vuxna) tillbaka till en odlingsflaska med mjöl och returnera den till inkubatorn. </li></ol> 6 Beredning av injektionsnålar <ol><li> Placera en tidigare drog glasnål på en glasobjektsglas med antingen klibbiga please eller dubbelhäftande tejp. Använd pincett, testa drog änden av nålen samtidigt som du tittar igenom dissekera mikroskop för att se var spets böjar. Ta området något mot toppsidan av där nålen krökar med tången och vridning för att bryta. </li><li> Håll goda nålar och kasta andra. Betrakta en bra nål som har en öppning som är varken för stor eller för liten (ca 0,05 mm diameter. Figurerna 1A och 1B), och är vinklat för att göra penetrering av larver ytterhud enklare (figurerna 1B och 2A-2B). Betrakta en dålig nål som (i) är för liten, vilket gör upptaget av dsRNA lösningen in i nålen svårigkult (steg 7) (figurerna 1D och 2D), (ii) alltför stor, vilket orsakar larv skada och möjlig dödlighet vid injektion (Figurer 1C och 2F), (iii) trubbig, vilket gör penetrering av nagelband svårt och ökande skada. </li><li> Stick in nålen i nålhållaren. <ol><li> Först skruva loss nålspetsen hållaren och placera den bakre änden av nålen i hållaren tips. Sedan placera gummipackningen under hållaren spetsen (minst 1 cm från den bakre änden av glasålen). </li><li> Sätt i baksidan av nålen i hållaren, med gummipackningen helt in i öppningen av nålen hållaren. Skruva spetsen tillbaka på hållaren. </li></ol></li><li> Placera den monterade nålhållaren på nålen manipulator. Håll nålhållaren nära horisontalplanet. Justera läget av manipulatorn, så att nålens spets är belägen i centrum av vyn när man tittar genom den MICRoscope. </li></ol> 7 Förhandstilldelning dsRNA Solution i Needle <ol><li> Förbered dsRNA injektionslösningen strax före injicering genom justering av koncentrationen med DDH 2 O och blandning av dsRNA lösningen med lika stora volymer 2x injektionsbuffert (steg 2,3). Förvara den blandade lösningen på is. Se diskussion avseende dsRNA koncentration. </li><li> Skär spetsen av en 20 | il av engångstyp pipettspetsen. Pipettera 10 | il av lösningen i den trimmade pipettspetsen. Ta försiktigt bort pipettspetsen från pipetten samtidigt som vätskan på spetsen genom baktryck. Alternativt försiktigt bort spetsen och sedan flytta lösningen till slutet av spetsen genom att ge tryck med hjälp av ett finger. </li><li> Placera pipettspetsen med dsRNA lösningen på mikroskop scenen med hjälp av klibbiga please med öppningen vänd mot nålspetsen. </li><li> Titta i mikroskopet, för sakta laddade spets mot nålen tills spetsen pånålen är innanför den inlästa pipettspetsen och in i lösningen. </li><li> Titta i mikroskopet, försiktigt dra tillbaka kolven i injektionssprutan för att dra långsamt dsRNA lösningen i nålen. OBS: Överfyll inte nålen. Som i slutet av dsRNA lösningen närmar sig nålspetsen, sänka takten för att dra och stoppa lastning lösning innan nålspetsen skulle nå luft. Om luften når spetsen, kommer lösningen att snabbt dras in i nålhållaren, vilket resulterar i allvarliga föroreningsproblemen. Detaljerade rengöringsrutiner av nålhållaren beskrivs i Philip och Tomoyasu 2011 11. </li><li> Avlägsna trycket från injektionsspruta och nål genom att öppna kranen. Därefter flyttar pipettspetsen bort från spetsen av nålen. Höj nålen upp från scenen för att förhindra oavsiktligt skada nålen medan placera larverna på scenen. Ta den tömda pipettspetsen från scenen. </li></ol&gt; 8. dsRNA Injektion <ol><li> Placera larver i eterisering korgen. Använd mindre än 10 larver, om att lära sig tekniken. Använd 30-40 larver i en omgång gång bekväm med tekniken. </li><li> Placera korgen med larver i etern flaskan och stäng locket. OBS: Eter utgör en brandrisk och är också skadligt. Utför detta steg under en huv. </li><li> Etherize larver under ca 3 min. Kontrollera larverna för rörelse efter 3 min. Placera dem tillbaka i etern flaska för ytterligare 30 sekunder om de fortfarande rör sig. Inte etherize under mer än fem minuter, eftersom detta kan öka dödlighet. OBS: Den optimala eterisering tiden kan variera beroende på temperatur och luftfuktighet. </li><li> Överför etherized larver från korgen till den icke-vidhäftande kanten av en glas klibbig slide. Använd pincett och samtidigt tittar i mikroskopet, plocka upp varje larver en efter en och placera dem på bilden. Lägg dem i sidled och försiktigt knacka ner deras kroppar from huvud till svans med pincett, något stretching dem som du går, se till att de är säkrade till bilden. </li><li> Placera den klibbiga slide med larver på mikroskop scenen. </li><li> Sätt i dsRNA laddade nålen försiktigt i ryggsidan av larverna att undvika skador på CNS. Undvik också ryggens mittlinje, eftersom larv hjärta ligger här. I denna och senare steg, använd alltid steget att flytta larverna till nålen (istället för att använda nålen roboten att flytta nålen). OBS: Det specifika injektionsstället spelar ingen roll eftersom RNAi i T. castaneum tycks vara systematiska. Det är dock oftast enklast att injicera i ryggsidan av bröst eller buken segment. </li><li> När du har satt in nålen i larverna, dra nålen något tillbaka för att ge utrymme för dsRNA att komma in i larvkroppshålan. </li><li> Tryck försiktigt på injektionssprutan tills larverna turn green (eller färgen på injektions buffert) och ser stretched och full. OBS: Om att lära sig tekniken, försök att injicera så mycket som möjligt för att bestämma mängden av lösning som kan injiceras i en larv utan betydande dödlighet. Det är i allmänhet ca 0,5-0,7 l. </li><li> Ta bort nålen från larverna. Medan nålen tar bort något drar tillbaka på injektionsspruta för att undvika dsRNA förlust (även noga med att inte dra in luft). </li><li> Injicera all larver på bilden. Se till att ta bort larver som inte framgångsrikt injiceras. Komplett injektion innan larver vaknar (i ca 10 min). </li><li> Ta bilden med injicerade larver från injektions mikroskop och lämna bild för ytterligare 5 minuter tills alla larver återhämta sig från eterisering. </li><li> Med pincett och under en dissekera mikroskop, försiktigt lyfta larverna från huvud till svans för att frigöra dem från den klibbiga slide. Placera nyutgivna larver i en ren petriskål. Låt larver på petriskål i 10-15 min så att injektionen wound att koagulera. </li><li> Placera larver i en ny flaska med rent mjöl och etikett på lämpligt sätt, inklusive stamnamn, typ av dsRNA injiceras, koncentration av dsRNA, antal larver injiceras, samt datum. </li><li> Kultur den injicerade larver vid 30 ° C med 70% luftfuktighet. Observera larverna för RNAi regelbundet fenotyper. OBS: Det sista stadiet larver förpuppas inom 7 dagar. Därefter kommer puppor Eclose till vuxna efter 7 dagar (om det inte finns något onormalt i timing orsakad av RNAi). </li></ol> 9 Bekräftelse av Knockdown och Fenotypiska Analyser <ol><li> Överväg bedöma effektiviteten av RNAi riva av flera olika molekylärbiologiska tekniker, såsom kvantitativ omvänd transkription-PCR (QRT-PCR) och Western blotting. Se et al. Miller 2012 7 och Philip och Tomoyasu 2011 11 för detaljerad qPCR och Western Blot-protokoll, respektive. </li><li> Analysera RNAi relaterade fenotyper. OBS: RNAi närståendefenotyper kan observeras på flera olika stadier och under olika odlingsbetingelser, beroende på vilka gener som var riktade. RNAi kan påverka skalbagge morfologi, metamorfos, fysiologi och beteende. Hur ofta närvaron av fenotyp kontrolleras och under vilka förutsättningar skalbaggar föds upp bör anpassas till de specifika frågor som undersöks genom RNAi. </li></ol>

<ol>
	<li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo.">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li><li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium.">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li><li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum.">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li><li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera).">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li><li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium.">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10 (2008).</li><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi.">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431 (2012).</li><li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles.">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li><li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Drosophila.">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li><li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects.">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., &amp; development. 1, 11-15 (1999).</li><li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection.">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li><li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle.">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li><li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain.">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5 (2013).</li><li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference.">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, 2456-2459 (2002).</li><li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li><li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest,+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum,+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps.">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+(II)+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless.">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

<html> Det finns ett antal viktiga frågor som måste övervägas för att säkerställa framgång för RNAi, inklusive längd och koncentration av dsRNA molekyler, konkurrens mellan olika dsRNA molekyler (vid försök multipel slå ner), och möjligheten att ej åsyftade effekter (OTE). dsRNA Längd Längden på dsRNA molekyler påverkar effektiviteten av den system RNAi svaret, med en längre dsRNA är mer effektivt att utlösa RNAi 7,14,15 (även om längre gränsen för dsRNA är för närvarande okänt). Den dsRNA längd måste vara längre än 50 räntepunkter till framkalla effektiva RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellan 150 bp och 500 bp verkar vara perfekt för RNAi-experiment. Även längre dsRNA molekyler kan också användas, kommer de att ha en ökad risk för OTE och genen-kloning steg kommer att bli allt svårare. dsRNA Koncentration ve_content &quot;&gt; Olika grader av genen knockdown kan uppnås beroende på koncentrationen av dsRNA. 1 ug / ul tycks vara en rimlig startkoncentration, vilket ofta ger en nära-noll-fenotyp (kan variera beroende på den gen (er) av intresse ). RNAi kan utföras med en högre koncentration (t.ex., 7-8 ng / ^ il) för att erhålla en starkare RNAi fenotyp. RNAi med en serieutspädning av dsRNA kan ibland vara fördelaktigt att producera en serie av hypomorphic fenotyper (Supple Data av Tomoyasu et al. 2009 8, och Borràs-Castells opublicerade data). RNAi Konkurrens Flera gen knockdown kan åstadkommas på T. castaneum genom injicering av ett flertal olika dsRNA molekyler samtidigt. Emellertid är det också känt att ha flera olika dsRNA molekyler i organismen resulterar ofta i konkurrensen mellan dsRNAs för tillträde till RNAi komponenterna <supp&gt; 7,14. Det är viktigt att använda samma längd och samma koncentration för alla dsRNA vid försök flera gen knockdown för att undvika en dsRNA ut-konkurrerar andra (även om ytterligare justeringar av dsRNA längd och koncentration kan behövas när uttrycksnivåer varierar stort målgenerna). Vi, liksom andra, har framgångsrikt utfört dubbel och trippelknockdown (t.ex. Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, och Yang et al. 2009 18). Även möjligt, fyrdubbla RNAi (eller flera) kan vara en utmaning, eftersom det sannolikt skulle leda till betydande minskning av RNAi effektivitet för alla fyra mål gener. Off-inriktning OTE är en inneboende oro för RNAi-baserade metoder. Ett sätt att minimera OTE är att identifiera områden i målgenen som delar liknande sekvenser med andra gener och undvika dessa regioner vid utformningen dsRNA. En enkel BLAST-analys mot T. castaneum förutspådde gen set kan identifiera sådana områden. Flera online verktyg kan också utvärdera potentiella OTE (t.ex. E-RNAi 19). Performing RNAi för två icke-överlappande regioner av målgenen är ett enkelt och effektivt sätt att eliminera möjligheten att observerade fenotyper orsakas av OTE. Möjligheten att OTE minimeras om RNAi för två icke-överlappande regioner producerar samma fenotyper (om inte de två icke-överlappande områden delar en liknande sekvens). Utvärdera gen knockdown av andra än fenotypisk analys medel ofta är avgörande för att på ett effektivt sätt presentera RNAi-relaterade uppgifter. Två viktiga sätt att utvärdera gen knockdown är QRT-PCR och Western blot-analys. QRT-PCR är ett bekvämt sätt att mäta graden av mål-mRNA, och har använts i många RNAi relaterade studier inklusive de i T. castaneum (se Miller et al. 2012 7 till exempel). However, ska försiktighet iakttas, eftersom vi nyligen har sett några fall där mål-mRNA nivån är uppregleras av RNAi (även om protein produkten nedregleras) (Borràs-Castells opublicerade data). Det är för närvarande okänt om detta RNAi inducerade mRNA uppreglering kan vara omfattande eller unikt för vissa gener. Western blot-analys är ett annat sätt att bekräfta gen knockdown. Denna metod är ganska tillförlitliga eftersom den mäter mängden av den slutliga proteinprodukten. Kravet på en specifik antikropp mot proteinet produkten av målgenen är en nackdel med detta tillvägagångssätt. Använda flera oberoende mätningar utöver fenotypisk analys kommer att öka förtroendet för de fenotypiska data som erhålls genom RNAi-baserade analyser. Sedan dess utformning i T. castaneum, har RNAi främst använts för att studera geners funktion i utvecklingen och mönsterbildning. Dessa T. castaneum utvecklingsstudier har varit mycket framgångsrika i känneterizing evolutionärt bevarade och avvek funktioner gener (översikt i Denell 2008 1 och Klingler 2004 2). Men RNAi-baserade studier i T. castaneum är inte begränsade till utvecklingsbiologi. Till exempel kan RNAi utnyttjas för att studera genfunktion i ett brett spektrum av fysiologiska och beteendemässiga reaktioner, inklusive stresstolerans, predation, aggression, partnerval, aktivitetsmönster, och försvarsmekanismer. En svårighet att tillämpa RNAi till dessa sammanhang är sannolikheten för pleiotropa effekter. Ofta kommer gener av intresse att ha en mängd olika roller i hela T. castaneum livscykel, vilket gör avlägsnandet av gener utan oavsedda fenotypiska effekter svåra. Däremot kan möjligheten att enkelt utföra RNAi på en mängd olika stadier ofta vara en effektiv strategi för att undvika dessa pleiotropiska effekter. Till exempel kan utföra RNAi hos vuxna istället för larver eller puppor tillåta oss att kringgå unintenderade dödlighet orsakad av gen knockdown under tidig utveckling. Flexibiliteten i RNAi respons i T. castaneum gör därför den här modellen ett attraktivt val för att anpassa RNAi experiment av geners funktion i fysiologiska och beteendemässiga reaktioner. The T. castaneum systemet är också idealisk för användning i en undervisningslaboratorium. T. castaneum lätt kan odlas på ett mjöl / jäst blandningen vid rumstemperatur (25 ° C) utan frekvent subodling och RNAi-tekniker i T. castaneum är enkla nog att kunna anpassas till ett laboratorium med unga, lärande forskare. Eftersom RNAi blir en viktig teknik i en mängd olika biologiska områden, är det viktigt att eleverna utsätts för denna teknik. Den rättfram karaktär larver RNAi-tekniken i T. castaneum uppmuntrar också fler studenter att delta i forskning, vilket gör T. castaneum en utmärkt kandidat för ett klassrum orienterat genetiskt system. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, ökar i popularitet inom olika områden av biologin beror delvis på hur lätt utföra RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserade gen knockdown tekniker hjälper forskarna att utföra förlorad funktionsanalyser utan att använda komplexa genetiska metoder. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi i något skede genom enkel injektion av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan 4-6. Samtidig knockdown av flera gener är också möjlig i T. castaneum genom insprutning av två eller flera olika dsRNA molekyler samtidigt 7,8. Dessutom kan en rad hypomorphic fenotyper genereras genom att minska koncentrationen av injicerat dsRNA 8. Dessa funktioner gör RNAi-baserade omvända genetiska tekniker attraktiva alternativ till traditionella termins genetik i T. castaneum. Eftersom så gott somalla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulära dsRNA molekyler 9, denna teknik gör det möjligt för forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang. Även om denna rapport är inriktad på att utföra RNAi i T. castaneum, många procedurer som beskrivs här gäller för andra insekter. Därför är detta protokoll användbar för dem som vill utföra förlorad funktionsanalyser i sina sammanhang av intresse i T. castaneum, liksom för forskare som vill tillämpa en RNAi-baserad teknik för att andra insekter. Injektion dsRNA till larver gör funktionsanalys på en mängd olika skalbaggar levnadsstadier, inklusive larver, pupal och vuxna stadier 4,5,10. Vi har tidigare rapporterat vår övergripande larv RNAi-protokollet inklusive molekylärbiologiska förfaranden 11. I den aktuella rapporten fokuserar vi på att beskriva dsRNA injektion rutiner vilka bäst förklaras med visuella medhjälpare. Vi tillhandahållerdetaljerade steg-för-steg-injektion förfaranden samt goda och dåliga insprutnings exempel. Denna visuella protokoll kompletterar vår tidigare protokollet och när de kombineras, de ger en mer heltäckande bild av de larver RNAi förfaranden T. castaneum. Dessutom diskuterar vi parametrarna för dsRNA molekyler som kan påverka framgången för RNAi, tillämpning av RNAi-baserade analyser för fysiologisk forskning, samt tillämpligheten av larver RNAi-protokollet i en undervisningslaboratorium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:324px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Organic whole wheat flour&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Heartland Mill Inc. Kansas</td>
			<td style="width:175px;">G1</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Brewer&#8217;s Yeast&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2903312</td>
			<td style="width:324px;">Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz plastic Drosophila stock bottles&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11-888</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-881N</td>
			<td style="width:324px;">8 in. dia. x 2 in.D. Use&#160; #25 (Nominal opening 710&#181;m) for larvae, pupae, and adults.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04 881 10P</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600&#181;m)&#160; Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sieve receiver</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>04-866B</td>
			<td style="width:324px;">8 in. diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 quart spouted sample pan&#160;</td>
			<td>Seedburo Equipment Co.</td>
			<td>Model 33</td>
			<td style="width:324px;">collection pan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>BioCold Environmental Inc</td>
			<td>BC26-IN</td>
			<td style="width:324px;">Keep it 30C with 70% humidity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">S374500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>S397-500&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>P217-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Food dye&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Kroger</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">green, blue, or red preferable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope glass slide&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Tack-It Over&#38;Over</td>
			<td style="width:181px;">Aleene&#39;s</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;">Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Plastic CD case</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Boroslilicate Glass capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-50-15</td>
			<td style="width:324px;">O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-87 or P-97&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone seal</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>HI01PK01</td>
			<td style="width:324px;">2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Removable mounting putty&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Loctite Fun-Tak</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compressed gas duster</td>
			<td style="width:181px;">OfficeMax</td>
			<td style="width:175px;">OM96091</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td style="width:175px;">11231-30</td>
			<td style="width:324px;">Dumoxel #3 (to manipulate beetles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tool</td>
			<td>11252-20</td>
			<td style="width:324px;">INOX #5 (to break needle tips)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl ether, anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:175px;">E138-500</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nylon mesh</td>
			<td style="width:181px;">Flystuff/Genessee Scientific</td>
			<td>57-102</td>
			<td style="width:324px;">120-um pore size/49% open area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media bootle 100-ml</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td>89000-926</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:324px;">SteREO Discovery V12. Injection microscope.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:181px;">Fisher/Zeiss</td>
			<td>12-070-513&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Zeiss</td>
			<td>4354600000000000</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Y mechanical stage&#160;</td>
			<td>Microscopenet.com</td>
			<td>A512</td>
			<td style="width:324px;">Inexpensive alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1&#160;</td>
			<td style="width:324px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30-ml disposable syringe&#160;</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309650</td>
			<td style="width:324px;">BD Luer-Lok Tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Four-way stopcock&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co.</td>
			<td>EW-30600-03</td>
			<td style="width:324px;">Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">art paint brush</td>
			<td style="width:181px;">Amazon</td>
			<td style="width:175px;">Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece</td>
			<td style="width:324px;">Any general paint brush will work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

larval rna interference in the red flour beetle, tribolium castaneum

Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, erbjuder en repertoar av experimentella verktyg för genetiska och utvecklingsstudier, inklusive ett fullt kommenterad genomsekvens, transposon-baserade genmodifiering, och effektiv RNA-interferens (RNAi). Bland dessa fördelar, RNAi-baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi helst livsfas genom att helt enkelt spruta in dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan. I denna rapport ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik T. castaneum. Protokollet omfattar (i) isolering av den riktiga etappen av T. castaneum larver för injektion, (ii) förberedelse för inställningen injektion, och (iii) dsRNA injektion. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger oss snabb tillgång till förlust av funktions phenotypes, däribland flera gen knockdown fenotyper samt en serie hypomorphic fenotyper. Eftersom så gott som alla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulärt dsRNA tillåter larver RNAi-tekniken forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang, bland annat den genetiska grunden för organism svar på den yttre miljön. Dessutom enkelheten i denna teknik stimulerar fler studentengagemang i forskning, vilket gör T. castaneum en idealisk genetiskt system för användning i ett klassrum.

En av de viktigaste stegen för lyckad injektion är att göra en bra nål. Som beskrivs i steg 6 måste spetsen på nålen brytas före injektion T. castaneum. Exempel på goda och dåliga nålar visas i Figur 1. En bra nål har en skarp och stel spets, med en öppningsdiameter omkring 0,05 mm (figur 1B). Figur 2 visar en lyckad injektion (Figur 2A och 2B) samt flera fall av misslyckade injektioner (figur 2C-2F). Med en korrekt storlek injektionsnål, tränger nålspetsen larvnagelbanden med minimalt motstånd (Figur 2A) och dsRNA lösningen (grön) strömmar in i larverna utan något läckage (Figur 2B). Inte över-inject, eftersom det kommer att orsaka överflöde av dsRNA lösningen även med rätt storlek på injektionsnål (Figur2C). Om nålspetsen är för tunn, ofta misslyckas nålspetsen att penetrera larver nagelband och kurvor, vilket gör injektionen svårt (Figur 2D). Om detta händer hjälper trimning nålspetsen ibland. St är ofta fortfarande användbar, om än med vissa svårigheter att tränga larver nagelband (figur 2E). Dock är en stor del av dsRNA lösningen lätt tryckas ut från nålen, även med lätt tryck på injektionsspruta, ofta resulterar i ett överflöd av dsRNA-lösning (Figur 2F). När du utför RNAi, är det viktigt att ha en positiv kontroll för att bedöma att RNAi fungerar korrekt, och en negativ kontroll för att kontrollera att effekten observeras inte är en icke-specifik effekt av dsRNA eller en följd av injektionsförfaranden (exempelvis skador genom injektion, eller onormalt från eterisering). Injektion av dsRNA inriktning EYFP kan fungera som engod positiv kontroll vid användning av pu-11 stam 5,7. När EYFP dsRNA injiceras i det sista larvstadiet, kan observeras en signifikant reduktion i EYFP signal i de framtida ving primordia så tidigt som en dag efter injektion (Figur 3A). Den knockdown av EYFP är fullständig två dagar efter injektion av EYFP dsRNA (figur 3B) och denna knockdown kvarstår genom puppstadium (figurerna 3C och 3D) och under hela livet av skalbagge om dsRNA koncentration är tillräckligt hög (såsom en ^ g / ^ il) 7. EYFP dsRNA kan också användas som en negativ kontroll eftersom det är en icke-endogen gensekvens och bör inte orsaka morfologiska eller fysiologiska störningar (figurerna 3A-3D). Vi gav bilder av larver RNAi för vestigial (VG), en kritisk ving gen 12, som ett annat exempel på hur eftivt denna injektion baserade RNAi teknik är i T. castaneum. När dsRNA för vg injiceras i näst sista larvstadiet (ett steg före den sista larvstadiet), kan en fullständig förlust av vingstrukturerna i puppstadium (figurerna 3E och 3F). Den resulterande vuxna också helt saknar vingstrukturer (figur 3G och 3H). Den RNAi resultat vg exemplifierar både robusthet och det gäller systemiska RNAi i T. castaneum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1: (A) Exempel på obrutna, bra och dåliga nålar (B) Spetsen på en väl bruten bra nål (C) Spetsen på en bruten nål som är för stor och trubbig (D) Tipset... av en pank<html> n nål som är för tunt. Skala barer (röd) är 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:... (A) En korrekt storlek injektionsnål in i den sista instar larven (B) Larv lämpligt injicerades med den gröna dsRNA-lösning (C) Spill i dsRNA-lösning vid insprutningspunkten som orsakas av över-injektion (D ) En tunn nål misslyckas med att penetrera larver nagelband (E) En stor injektionsnål in i det sista stadiet larv.. (F) Larva injiceras med en stor nål, vilket resulterar i spill och läckage av dsRNA lösningen. Pilar indikerar de nålar.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Exempel på framgångsrika RNAi i T. castaneum. (AD) Senaste larv injektion av EYFP dsRNA resulterar i en reduktion av EYFP expression. (A) Larver en dag efter injektion. (B) Larver två dagar efter injektion. (C) Kontroll puppor. (D) Puppor resulterande från larver EYFP dsRNA injektion. De negativa kontrollerna är buffert injektion (A, B) och dsRed dsRNA injektion (C, D). Arrowheads och pilarna visar EYFP uttryck eller saknar därav i flygeln primordia och ögon, respektive. (EH) Pennaultimata larver RNAi för vg. (E) vildtyp puppa. (F) vg RNAi puppa. Bristen på vingkonstruktioner syns redan i puppstadium (pil). G) vildtyp vuxna. (H) vg RNAi vuxen. Wing relaterade strukturer helt saknas (pil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum at JoVE.com

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA-interferens (RNAi) -baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. Här ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik Tribolium castaneum. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger snabb åtkomst till förlust-of-funktion fenotyper, där forskarna att studera genfunktioner i olika sammanhang.

Larvernas RNA-interferens i Röda Flour Beetle,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Använda RNA-medierad strategi Interference Matning att screena för gener involverade i kroppsstorlek förordningen i rundmasken<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Mätning av Larvernas aktivitet i<em&gt; Drosophila</em&gt; Aktivitetskontroll

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

Praktisk användning av RNA-interferens: muntliga leverans av dubbelsträngat RNA i Liposom bärare för kackerlackor

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Kärnisolering från vuxen musnjure för RNA-sekvensering med en kärna

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektiv oral RNA-interferens (RNAi) administrering till vuxna anopheles gambiae myggor

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Tillämpning av RNA-interferens i pinewoodnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Undersökning av entomopatogena svampresurser från skogsbovar

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence period is considered an acceptable alternative to chemical control. However, EPF resources have been significantly less explored for FWBs, in contrast to agricultural insect pests. This paper presents a protocol for exploring EPF resources from FWBs using wild Monochamus alternatus populations as an example. In this protocol, the assignment of traps baited with M. alternatus attractants to different populations guaranteed the collection of adequate samples with natural infection symptoms, during the emergence periods of the beetle. Following finely dissecting integuments and placing them onto a selective medium, fungal species were isolated from each part of beetle bodies and identified based on both molecular and morphological traits.
Several fungal species were certified as parasitic EPFs via re-infection of healthy M. alternatus with spore suspensions. Their behavioral phenotypes on M. alternatus were observed using scanning electron microscopy and further compared with those on the Coleopteran model insect Tribolium castaneum. For EPFs that present consistent parasitism phenotypes on both beetle species, evaluation of their activities on T. castaneum provided valuable information on lethality for future study on M. alternatus. This protocol helped the discovery of EPF newly reported on M. alternatus populations in China, which could be applied as an efficient approach to explore more EPF resources from other FWBs.

<meta charset="utf8"></head><body>Författare Spotlight: Utvärdering av entomopatogena svampar i vilda Monochamus alternatus-populationer för biologisk bekämpning i skogsborrar

Here we present a protocol for obtaining entomopathogenic fungi from a forest wood borer and a substitutive way to evaluate their entomopathogenic activities using a Coleopteran model insect. This method is efficient and convenient for exploring entomopathogenic fungal resources from wood-boring insect pests in natural forests.

Isolering, beteendeidentifiering och patogenitetsbedömning av entomopatogena svampar från en skogsbometer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...