Name: soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (steinernematidae, heterorhabditidae)
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta e Victoria Miranda-Thompson por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Agradecemos o apoio da National Science Foundation (subvenções IOS-0840932 e IOS-0724978) a SP estoque.

1. Coleta de Amostras de solo <ol><li> Considere que cobre uma área mínima de 2 - 4 m 2 para cada local de amostragem. </li><li> Recolha de amostras de solo a uma profundidade de pelo menos 15 cm (Figura 4). </li><li> Tome pelo menos 5 amostras aleatórias dentro desta área. </li><li> Tome 3 subamostras por amostra. Dependendo do objetivo do estudo, ou combinar as subamostras ou mantê-los separados. </li><li> Coloque cada amostra em um saco plástico. Considere duplo ensacamento para ev...

<ol>
	<li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil.">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).</li><li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).</li><li>Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., &#214;zcan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+entomopathogenic+nematodes+(Rhabditida:+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae)+in+Turkey.">Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey.</a> Biodiversit., &amp; Conservation. 12, 375-386 (2003).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).</li><li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+(Coleoptera:+Curculionidae).">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li><li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem.">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., &amp; environment. 113, 336-341 (2006).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).</li><li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae+and+Heterorhabditidae)+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona.">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li><li>Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+morphology+and+systematics.">Nematode morphology and systematics.</a> Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).</li><li>Stock, S. P., Goodrich&#8211;Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts:+The+inside+out+of+a+mutualistic+association.">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li><li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes.">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li><li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures.">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li></ol>

Esta demonstração é a primeira de duas apresentações que descrevem um número de técnicas que são comummente usados ​​para estudar EPN e suas bactérias simbióticas. Estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que empregam EPN como organismos modelo para a pesquisa. Vários levantamentos de solos de EPN têm mostrado que a sua abundância e distribuição pode variar entre...

Muitos nematóides estão associados com insetos, e suas interações hospedeiro variam de benéfico para prejudicial. Aqui, vamos nos concentrar em um grupo de nematóides que são patógenos de insetos, também conhecido como nematóides entomopatogênicos (ou EPN). Duas famílias de nematóides pertencem a este grupo de nematóides: Steinernematidae e Heterorhabditidae 11,13. O seu efeito patogênico é de fato conferida pela sua interação com anaeróbios facultativos bactérias entéricas (bactérias Xenorhabdus associar steinernematids e bactérias Photorhabdus associar heterorhabditids) 2. As bactérias são vetorizado de um hospedeiro a outro por insetos a única fase livre nematóide de vida, a terceira fase juvenil infecciosa (também conhecida como juvenil Dauer, juvenil infecciosa ou IJ), que vive no solo. Uma vez dentro do inseto, os nematóides liberar as bactérias na hemolinfa do inseto, que matam o inseto hospedeiro por septicemia maciça. As bactérias tambémdegradam os tecidos do insecto e se tornar fonte de alimento dos nematóides, permitindo-lhes a amadurecer e multiplicar. Normalmente, uma ou duas gerações de nematóides adultos são produzidos dentro do cadáver do inseto. A progênie dos últimos reassociates geração de adultos com algumas células bacterianas em um mais especializar maneira que sua relação nutricional anterior e cultivar essas células em seus intestinos que se deslocam para fora do inseto carcaça no solo onde irão aguardar outro inseto parasitar 6,11,14 (Figura 1). Desde sua descoberta em 1927, EPN foram consideradas alternativas valiosas para pesticidas químicos como eles podem parasitar uma grande variedade de insetos que são pragas agrícolas 3,4,5. No entanto, ao longo das últimas duas décadas, esses nematóides e suas bactérias simbióticas ter sido reconhecido como um sistema modelo para o estudo de aspectos maleável biológicos, ecológicos e evolutivos de host-micróbio interactions 14. O objetivo desta apresentação é mostrar os métodos e técnicas mais comumente utilizadas para a amostragem do solo e isolamento de EPN. Uma variedade de ferramentas está disponível e pode ser usado para a coleta de amostras de solo, incluindo: corers solo, espátulas, escavadoras pós-buracos, brocas, tubos de amostragem, pás de mão, entre outros (Figura 2). Dependendo do objectivo do estudo, duas estratégias de amostragem pode ser considerada: a) estratificado, b) amostragem (Figura 3). A amostragem estratificada é normalmente usado como parte de um estudo intensivo de uma área específica ou demarcada sobre um dado período de tempo. Em geral, uma seção transversal é demarcado e amostras de solo são tomadas a intervalos previstos na transecção ao longo de um período de tempo (Figura 3A) 15. A amostragem aleatória é geralmente empregada quando o foco em uma área extensa. Esta estratégia de amostragem foi usado para estudar a diversidade de EPN fesde uma grande área geográfica ou região (Figura 3B) 12. Uma série de fatores podem ser considerados, dependendo do foco do estudo, incluindo uma grande variedade de elevações, texturas de solo e habitats (por exemplo., Campos cultivados, florestas, pastos, parques, praias, matas ciliares, etc.) Mostramos a técnica de atracção de insectos, que foi originalmente descrito por Bedding e Akhurst 1 e representa uma alternativa simples e selectiva para a recuperação a partir de amostras de solo de EPN. Este é um processo selectiva que é baseado na premissa de que os nemátodos (estádio IJ) será atraído para uma série de insectos e que parasitam. Esta técnica também pode ser considerada para o isolamento de outros agentes patogénicos de insectos, tais como fungos, bactérias e 8,10. Também demonstramos a técnica armadilha branco modificado que é utilizado para a recuperação de nemátodo progenitura de hospedeiros infectados insectos 7,14. Este é um esforço method que oferece a vantagem de recuperar uma &quot;limpa&quot; nematóide progênie livre de restos de cadáveres de insetos degradantes. Finalmente, as técnicas descritas e mostradas neste artigo correspondem aos concebido e / ou realizados no nosso laboratório, bem como os descritos por vários colegas e colaboradores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1119">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:309px;">Company</td>
			<td style="width:241px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:299px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:271px;">Galleria mellonella</td>
			<td style="width:309px;">Timberline</td>
			<td style="width:241px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td>for insect baiting technique</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:309px;">Whatman/VWR</td>
			<td>28450-048</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">25384-088</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">ZIPloc Plastic Bags</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:271px;">Mechanical Pipettor P1000, P200 ml</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>89130-562; 89130-566&#160;</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">pippetor tips 1000ml, 200 ml</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">16466-004 ; 53510</td>
			<td>infection chamber and White trap assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Bleach</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td>N/A</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td>N/A</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">70% Ethyl alochol</td>
			<td style="width:309px;">AAPER</td>
			<td>17212945</td>
			<td>soil sampling , desisnfecting</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:271px;">Shovels</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubular soil sampler</td>
			<td>Accuproducts</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Soil Probe, long handle</td>
			<td>Nupla&#160;</td>
			<td style="width:241px;">PRB4T 69401 Classic</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Measuring tape</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flagging tape, various colors</td>
			<td style="width:309px;">Ace Hardware or local hardware store</td>
			<td style="width:241px;">N/A</td>
			<td>soil sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">tissue culture flasks</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td style="width:241px;">Falcon, 29185-304&#160;</td>
			<td>White trap, collection of EPN</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:271px;">wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth</td>
			<td style="width:309px;">VWR</td>
			<td>16650-107</td>
			<td>White trap, collection of EPN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (steinernematidae, heterorhabditidae)

Nematóides entomopatogênicos (aka EPN) representam um grupo de nematóides que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Esses nematóides pertencem a duas famílias: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Até agora, mais de 70 espécies já foram descritas no Steinernematidae e existem cerca de 20 espécies no Heterorhabditidae. Os nematóides têm uma parceria de mutualismo com bactérias Enterobacteriaceae e, juntos, eles agem como um complexo potente inseticida que mata uma grande variedade de espécies de insetos. Aqui, vamos nos concentrar nas técnicas mais comuns considerados para a recolha de EPN do solo. A segunda parte desta apresentação centra-se na técnica de atracção de insectos, uma abordagem amplamente utilizada para o isolamento de EPN de amostras de solo, e a técnica de armadilha branco modificado, que é utilizado para a recuperação destes nematóides de insectos infectadas. Estes métodos e técnicas são passos fundamentais para o sucesso da criação EPN cultUres em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que consideram estes nematóides como organismos modelo para a pesquisa em outras disciplinas biológicas. As técnicas indicadas nesta apresentação correspondem às realizadas e / ou concebida por membros da SP laboratório, bem como os descritos por vários autores.

Coleta de Amostras de solo Em estágio Terceiro juvenis infectantes de EPN são os únicos estágios gratuitos de vida no ciclo de vida desses nematóides que residem no solo (Figura 1). Portanto, a recolha de amostras de solo é um método muito eficiente para recuperar estes nemátodos. Figura 4 mostra um perfil de solo que indica a profundidade a que devem ser recolhidas amostras. Preservar a umidade de uma amostra é um fator chave para a sobrevivência ...

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Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Research

JoVE Journal

Environment

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Projeto e operação de uma contínua<sup&gt; 13</sup&gt; C e<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Câmara de uniforme ou Diferencial, metabólica e estrutural, Fábrica de Marcação por Isótopo

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Ambiente

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrado Campo Lysimetry e Porewater Amostragem para Avaliação de Química Mobilidade em Solos e Vegetação Fundada

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An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

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Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados

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