Name: visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIH prêmios 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com as normas e diretrizes do Instituto de Estudos de Animais no Albert Einstein College of Medicine. 1. Crescimento Condições de C. neoformans H99 (sorotipo A) <ol><li> Crescer indivíduo C. neoformans (Cn) colônias em placas de ágar Sabouraud. </li><li> Um dia antes do experimento, selecione uma colônia e inocular 10 ml de caldo Sabouraud. </li><li> Permitir que a cultura a crescer durante a noite a 37 ° C com agitação ...

<ol>
	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

Aqui, descrevemos um método através do qual as interacções macrófagos-fúngicas podem ser registados e analisados ​​em tempo real, ao longo de um período de 24 horas. Nosso laboratório tem usado esse protocolo para estudar muitos dos aspectos temporais da exocitose não-lítica e continuará a usar microscopia em tempo real para determinar os componentes morfológicos que cercam este processo. Para esta técnica para produzir resultados ideais, deve ser dada especial atenção a d...

As fases de uma infecção fúngica entre células criptocócica e macrófagos são bem documentados 1-3. Após as células de levedura são ingeridos pelos macrófagos, uma grande variedade de interacções podem ocorrer: o macrófago pode lisar a libertar a sua carga de fungos para o espaço extracelular, ou pode controlar a infecção, mantendo as células de levedura dentro dos limites da sua membrana celular 4. No entanto, há vários anos, um novo resultado foi descrito de forma independente por dois grupos: exocitose não-lítico, um processo em que um macrófago expurgado algumas ou todas as células criptocócica para o ambiente circundante ou uma célula vizinha e tanto o hospedeiro e patógeno permanecer viáveis ​​5 -8. Vários estudos têm tentado compreender os mecanismos moleculares por trás dessa interação, mas que ainda não têm uma compreensão completa sobre o que impulsiona este fenômeno. A capacidade de capturar imagens em tempo real e posteriormente analisar infectar múltiplased macrófagos permite responder a muitas perguntas sobre as propriedades físicas que cercam exocitose não-lítica em relação ao tempo, a capacidade espacial, mudança na morfologia e até mesmo estresse de macrófagos durante uma infecção fúngica. Ao permitir que as células a serem alojados num ambiente que seja comparável ao de uma incubadora, podemos entrever a natureza dinâmica das interacções celulares de macrófagos-fúngica. Os pesquisadores usaram esta técnica para estudar vários componentes deste processo. O papel do fagossoma neste processo foi feito utilizando a coloração fluorescente aparente e actina agentes de bloqueio 9, enquanto que um outro grupo utilizado este método para mostrar que a exocitose não-lítico foi bloqueada em células que têm tido a LAVAGEM nucleação domínios proteicos suprimido 10. O efeito de sinalização de citoquinas também foi verificado por microscopia em tempo real 11. Este processo não está limitado a C. neoformans como foi também observado com Candida albicans, diferentr patógeno, que tem a capacidade de infectar macrófagos 12. Estes achados são exemplos de como este método pode fornecer uma riqueza de informações para uma área que sabemos tão pouco.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:227px;">DF0109-17-1</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sabouraud Dextrose Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0382-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dubelcco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum ( FCS)&#160;</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCTC 109</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21340-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3003 Tissue Culture Petri Dishes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellStripper</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-g</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NC 9222016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAb 18B7</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Non-commerical antibody produced in our lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

Muitos aspectos da infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans têm sido extensivamente estudada e bem definido. No entanto, uma interação especial, que não é claramente compreendido é exocitose não-lítico. Neste processo, as células de levedura são libertadas para o espaço extracelular através de um mecanismo mal entendido que deixa ambos os macrófagos e Cn viável. Aqui, nós descrevemos a seguir como um grande número de macrófagos infectados individualmente por um período de 24 horas de infecção por microscopia de tempo decorrido. Macrófagos infectados estão alojados numa câmara de aquecimento, com uma atmosfera de CO 2 ligado a um microscópio que fornece as mesmas condições que uma incubadora de cultura de células. Microscopia digital ao vivo pode fornecer informações sobre as interações dinâmicas entre um hospedeiro e patógeno que não está disponível a partir de imagens estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada pode fornecer pistas de como macrófagos lidar com infecções fúngicas, e vice-versa. Esta técnica isa ferramenta poderosa para estudar as dinâmicas que estão por trás de um fenômeno complexo.

As imagens que esta técnica produz podem ser analisados ​​em uma variedade de maneiras de coletar informações em torno do que acontece depois que as células tenham fagocitado C. neoformans. Como pode ser visto na Figura 1, há aproximadamente 100 macrófagos que estão infectados ou não infectados. Cada um desses macrófagos dá ao espectador a oportunidade de estudar interações patógeno-hospedeiro em um nível muito microscópico. Como as Figuras 2 e 3</str...

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Imunologia e Infecção

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The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

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