Name: a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00
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私たちは、財政支援のために、次の感謝したいと思います：BBSRC研究所戦略計画の資金調達 - CF＆TMW。 BBSRC東バイオDTP資金 - LG。エジンバラのダーウィン·トラスト - MLH。我々はまた、この原稿にTREM2最適化を含めるための許可を博士バリーMcCollに感謝したいと思います。

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

配慮と計画は、あらゆる実験に先立って不可欠であり、最終的に使用されるテクニックの成功を決定することができます。使用するために適切な抗体、転送および可視化方法を選択しようとすると、WBを使用したタンパク質検出の進歩は、潜在的な障害ブロックの過多を提示することができます。幸いなことに、タンパク質の存在とサンプル間ますます微妙な発現差を決定するために日常的に使用することができるQFWB注意深くチェックし、適切な対策を使用する。このプロトコルは、回避し、および/またはそれに関連する多くの一般的な落とし穴のいくつかを克服するために、蛍光定量的ウェスタンブロッティングと同様に、いくつかのトラブルシューティングの戦略の包括的なガイドを提供します。 感度を維持し、真の定量化と比較可能な測定値を得るために用いられる重要なステップは次のとおり組織サンプルから1）堅牢なタンパク質抽出する。 2）試料調製。 3）正確なタンパク質Loadinのgの全タンパク質分析によって決定。 4）I-ブロットを使用して、タンパク質の最適な転送を、赤外線イメージャと関連ソフトウェアを使用して、0.1％のTween20を含むブロッキング緩衝液中で一次および二次抗体の5）準備、および6）が正しいの可視化と分析。 赤外蛍光検出本当に定量的であり、より伝統的なECL検出技術3,11に比べてより高い感度を提供する。この検出システムは、多面的であり、そのようなものとしてQFWBに限定されるものではない。このシステムは、全体の組織切片12の可視化および定量化を可能にする、低電力での免疫組織学的標識イメージングが可能である。これは定量的評価の点で従来の顕微鏡では、従来の免疫蛍光の取り込みに匹敵する遠赤色イメージングを見ることができ、解像度の点で潜在的な将来の発展の一つの領域である。 しかし、Pの微妙な変化に対してより大きな感度を有するそれは可変性を確保するために重要であるrotein式が最小に維持され、制御措置が強固なプロトコルに厳しい。検出は実数および転送する点で、製造業者のガイドラインをテストする場合、これは決定するために、サンプル負荷が均一であることの保証、一次および二次抗体の最適化を提供するために全タンパク質染色ゲルの生成に続いて、組織サンプルからの厳密なタンパク質の抽出から始まる時間効率的なタンパク質伝達を得る。 それにもかかわらず、WBのための条件が最適化されている場合でも、まだ問題は完全にここで検討されていない可能性が西部劇を実行しているとそこに関連することがあります。これらには、タンパク質の可溶化および抽出緩衝液の選択などの要因に限定されるものではない。いくつかのバッファは、タンパク質濃度アッセイに干渉する可能性があり、いくつかの組織は、このような自動化されたmaceraの使用などのより堅牢な技術を必要とする、可溶化することが特に困難であるティンは、マックの解離とともに、Mチューブなどの容器を密封した。加えて、-80℃で抽出し、抽出されない材料の保存のための簡単​​な対策は直ちに抽出した後、最適な標識を取得し、悪い結果を週後の差を有することができる。 現代のQFWBの方法は、タンパク質発現の微妙な違いをキャプチャするためのより高感度であることが証明されており、そのようなECLなどの従来の技術と比較すると、より汎用性の同時二重標識3を許可している。これは、ウェスタンブロッティングプロトコルは、堅牢かつ正確な定量、統計分析のために容易に再現可能であることが不可欠です。このプロトコルは、高感度で、異なる組織サンプルおよび種3、様々横切っタンパク質の検出のために日常的に使用されるのに十分に堅牢であり、同じQFWB内の低および高存在量タンパク質の定量化を可能にする、従って消耗使用量を削減するだけでなく、実験の1時間あたりの1また、この技術の感度の増大は、ますます人気の検証ができます- 。OMICの研究9,14をただし精度が重要であり、適切な管理措置を含めることは、それによって誤ったデータ収集を回避するために付着されなければならない。

ウェスタンブロット（WB）は、本来、組織ホモジネート1として、複雑な生物学的サンプル中の目的のタンパク質の存在または非存在を決定するために、1970年代後半に開発された分析技術である。一般的に起因するキーの抗体 - 抗原相互作用のために、タンパク質イムノブロットと呼ばれる、方法論は、5つの別個のステップで構成されます。それらの等電点によるタンパク質の1）電気泳動分離。 2）ニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜への転移; 3）目的のタンパク質に特異的な一次抗体を用いて標識する。 4）一次抗体に対する二次抗体とのインキュベーション。 5）可視化。 可視化手法は、安全性および感度を改善するための時間と進化してきた。第WBsをのいくつかは、より多くの広く使用されている化学発光（ECL）法、次に比色とに進行放射標識タグを用いて行った。 Radioactivi比色およびECL方法論は、例えばアルカリホスファターゼまたはストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）2のような酵素レポーターとの間接標識技術を使用し、一方、tyが直接特定の抗原のためのプローブに標識した。色素原または発光生成物の標識化の強度は、強いまたは弱い信号強度は、サンプル中の目的のタンパク質の多かれ少なかれ存在を示すことにより、デンシトメトリーを用いて測定される。 ECLは、最初に、続いて3を設置し、より洗練されたデジタル画像化技術を用いてX線フィルム上で開発された、より敏感なので好ま方法2が、すべての3つの方法である。 WBのデジタル画像の進歩のみならず、興味のあるタンパク質の存在または非存在を決定するために研究を可能にしたが、他のサンプルと比較したとき、選択されたタンパク質の発現レベルの推定を可能にし、したがって、と呼ぶことができる「半定量的＆＃8221 ;.測定された蛍​​光のレベルを直接サンプル内の数量と単一のタンパク質の発現に関連させる最近、真に定量的かつより高感度のウェスタンブロッティング技術が開発された：定量（QFWB）ウェスタンブロッティング蛍光。 ECL標識とQFWBを比較した場合、蛍光二次抗体の使用は、線形検出プロファイル4を生成する。これは、信号の直線性は、一般に、遍在的に発現されるハウスキーピング遺伝子5,6と、すなわち 、直接タンパク質の発現に関連した5μgの信号飽和以下の低いタンパク質負荷で発生するECL技術とは対照的である。この格差は、最も可能性の高い潜在的な信号飽和の可能性が高く、その結果、ビオチン化二次的に結合するアビジンECL基質についての利用可能な結合部位より多くによって引き起こされる。これは、ONLと呼ばれているのECLベースイムノブロット法の主な理由の一つですyは「半定量的」7。信号の飽和点は、発現レベルの微妙な差を測定する際に非常に重要であると不正確な測定をもたらすことができる。近年、増え続ける感度と微妙な表情差の識別を詳述広範なプロテオミクス技術の出現は、検証実験8,9のために真に定量的なウェスタンブロッティング上で増え続けるの依存度をもたらした。 、敏感な堅牢かつ真に定量的な方法論の適用が故に重要である。 多くの &quot;最適化&quot;ウェスタンブロッティングの方法論は、頻繁に設定したり、原因の正式な文書化されたプロトコルでは明らかではないかもしれません微妙な方法論的な調整に複製することは困難証明する独立した研究所によって利用されてきた。これはQFWBための確立された堅牢なプロトコルであり、さらに一般的な問題のthaのトラブルシューティングに貴重な戦略を提供していますtは実装時に発生する可能性がある。 このプロトコルは、もともとマウス脳ホモジネートの使用に最適化されたが、その後、組織サンプルおよび種4,9,10の広い範囲にわたって効果的に使用されてきた。特定の問題のトラブルシューティングに必要な潜在的なプロトコルのバリエーションが含まれています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

1970年代後半には、ウェスタンブロット、存在感、複雑な生物学的サンプル中の特定のタンパク質の相対存在量を評価するための技術の最初公に報告された使用を見た。それ以来、ウエスタンブロッティング法は、分子生物学実験的レパートリーの共通成分となっています。用語「ウェスタンブロット」を使用してのPubMedのざっと検索が22万公表原稿を超えて重要な年2014年までにこの技術を利用してきたことを示唆して、最後の10年間は​​、開発と相まってテクニカルイメージングの進歩を見てきました感度を改善し、線形検出のより大きな範囲が得られている敏感な蛍光標識。その結果、生物学者はこれまで以上に高い感度と精度を比較発現解析を行うことを可能にするウェスタンブロット（QFWB）ベースの今、真に定量化蛍光である。多くの &quot;最適化&quot;ウェスタンブロッティング方法論が存在し、異なる研究室で利用されている。これらは、しばしば微妙ですが、文書化されていない手続きの改正の要件に実施することは困難証明する。このプロトコルは、トラブルシューティングの戦略と完全に確立され、堅牢なQFWB方法の包括的な説明を提供します。

QFWB感度および検出の直線範囲は、従来のECL検出よりも大きいように、実効的な解釈を助ける正確なデータが収集されることを保証するために重要である制御手段の数は、存在する。まず、ポジティブ対照試料を含めることは、 図1に示すように第二に、転送の最適化は、膜にゲルから高および低分子量タンパク質の同等の動作を保証するために、図2に示したように、第三に、抗体の最適化は、特に、二次その最適化はしばしば見落とされているが、抗体は、関心対象のタンパク質の正しい解釈を妨害することができるバンディング非特異的生成することができる。 図3を参照してください。第四に、それはまた、タンパク質が検出不能に見えるが存在することが予想される場合、これは単に二RAISを用いて補正することができる二次抗体の問題であってもよい場合もある異なる種の宿主中で編図4を参照してください。第五に、総タンパク質標識および分析は、遍在内部参照標準3のために表されている伝統的な単一のタンパク質（群）の使用と比較してはるかに堅牢かつ定量化可能な方法である。これらの単一のタンパク質の多くは、示差的に神経変性疾患のモデルとの間、異なる組織サンプルにおいて発現されることが見出されており、発現の均一性は、同じ組織3内に変更することができる。標準誤差を示すために比較し、各サンプルに対して測定し、種々の分子量の範囲において、各レーンにおけるタンパク質負荷を定量化することによって、総タンパク質分析と組み合わされた場合、図6に示されているように、したがって、ローディング対照ゲルの製造は、サンプル負荷の均一性を確認する。重要なことに、これらのトラブルシューティングの手法とコントロールの全てが分析さtの感度および一貫性のみに有効であるオペレータ（ 図5）によって適用ools。最後に、この技術は、ストリッピング及び要因を含むが、長期貯蔵条件下での感受性の増大、減少、背景、デュアルカラー検出および膜安定性に限定されずにECLよりも柔軟性を有する膜の再プロービングに向いている。 図7を参照してください。

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

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