Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Ce protocole et vidéo sont destinés à servir de compagnon à l&#39;article original décrivant le logiciel plus en détail 4, ainsi que le rapport technique qui vient avec le téléchargement de logiciels sur le site Web Danuser Lab. Les lecteurs sont encouragés à examiner attentivement ces documents s&#39;il ya des questions supplémentaires concernant l&#39;utilisation du logiciel. 1 Avant l&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Convertir chaque film en time-lapse en une séqu...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker fournit une interface utilisateur simple, graphique pour détecter rapidement et automatiquement la quasi-totalité visibles comètes EB1-GFP dans un cône de croissance cellulaire ou, le lien entre les comètes en pistes, et calculer les paramètres MT. Autres publications ont rapporté la conception de types de logiciels similaires (par exemple, Marx et al. Analyse quantitative a également utilisé des dynamiques EB1 marqués dans les cônes de croissance 18). Mais, ce logiciel semb...

Le but de cette méthode est d&#39;obtenir des informations quantitatives sur les microtubules (MT) plus fin de suivi dynamique dans la vie des cônes de croissance protéines (+ TIP). MT + TIP sont un groupe de protéines qui localisent les plus-extrémités de MT 9,10. Ils effectuent une vaste gamme de fonctions pour régler les paramètres de MT instabilité dynamique 11, y compris les taux de polymérisation, catastrophe, et de sauvetage. Une méthode très utilisée pour l&#39;analyse de la dynamique de la MT est de suivre le comportement du TIP EB1 +, qui se lie spécifiquement à la croissance de MT plus-ends 1,12. EB1 est connu pour recruter plusieurs autres protéines à la croissance de MT plus-ends 13,14, et a récemment été mis en place comme un facteur de maturation MT 15, la promotion de la croissance MT et la fréquence des catastrophes 15,16. De nombreuses études de la dynamique MT dans les cônes de croissance ont utilisé des méthodes de suivi de la main pour mesurer les changements dans la dynamique EB1-GFP au fil du temps 1-3, comme EB1 localizatià MT ainsi que les fins peuvent être utilisés en tant que marqueur pour la polymérisation MT. Un avantage clé de l&#39;examen de comètes EB1-GFP comme une approximation de la croissance MT est que la dynamique MT peuvent être mesurés même dans les régions de chevauchement significatif de MT. Bien que la méthode des comètes EB1-GFP suivi à la main a fourni des indications utiles sur les comportements MT 1-3, il est temps et peut être biaisée. En outre, la croissance aberrante comportements coniques sont probablement le résultat de changements minute à la dynamique du cytosquelette, en analysant seulement un petit sous-ensemble de MT (généralement nécessaire lorsque la main-tracking) peut manquer des informations importantes. Ainsi, nous mesurons la dynamique de MT mondiaux paramètres à l&#39;aide du logiciel, plusTipTracker 4, après l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel, développé dans le Danuser Lab, a été utilisé dans plusieurs études qui caractérisent la dynamique MT dans divers types de cellules 6-8. Il s&#39;agit d&#39;un open-source, nouser-amical, emballage à base de MATLAB qui inclut la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l&#39;analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), chemin de la croissance durée de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). Le logiciel peut être téléchargé directement depuis le site Danuser Lab (sous «Logiciel»). Alors que le Danuser Lab prend actuellement en charge une interface nouvelle pour + analyse de suivi de TIP, qui est intégré dans un logiciel appelé u-piste 2.0, le logiciel d&#39;origine, autonome restera disponible. Les algorithmes sous-jacents entre les deux programmes sont les mêmes (au moins à partir de 2014), avec seulement une différence de l&#39;interface et d&#39;analyse des sorties. Pour l&#39;utilisateur novice avec peu de MATLAB et / ou l&#39;analyse computationnelle expérence, plusTipTracker a plus de fonctionnalités conviviales, y compris les sorties de paramètres statistiques automatisés. Ici, nous décrivons les étapes d&#39;analyse d&#39;images de la dynamique EB1-GFP en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Ce protocole a été utilisé dans une étude récente examinant la dynamique MT 17. Voir aussi Lowery et al. 2012 5 pour obtenir des instructions détaillées sur les cônes de croissance de la culture exprimant EB1-GFP. Bien que ce papier essentiellement porté sur l&#39;examen dynamique EB1-GFP dans les cônes de croissance, le même protocole peut être utilisé pour d&#39;autres types de cellules 17. Pour tous les types de cellules, l&#39;intervalle de temps entre les images doit être comprise entre 0,5-2 sec pour optimiser le suivi + TIP. Un intervalle d&#39;au plus 4 secondes de temps entre les images est possible, mais cette augmentation des résultats en temps d&#39;intervalle dans les erreurs de suivi supplémentaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubules (MT) plus-fin-suivi protéines (+ TIP) se localisent à la plus-extrémités croissantes de MT et régulent la dynamique MT 1,2. Un des conseils les plus connus et largement utilisés-+ pour analyser la dynamique de MT est la Fin-binding protein, EB1, qui lie tous les MT ainsi que les fins de croissance, et donc, c&#39;est un marqueur de MT polymérisation 1. De nombreuses études sur le comportement des EB1 dans les cônes de croissance ont utilisé beaucoup de temps et, les méthodes de suivi de la main assistée par ordinateur biaisées pour analyser individu MT 1-3. Notre approche consiste à quantifier les paramètres globaux de la dynamique MT en utilisant le logiciel, plusTipTracker 4, suite à l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel est un open-source package convivial basé sur MATLAB, qui allie la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Ici, nous présentons le protocole d&#39;utilisation plusTipTRâtelier pour l&#39;analyse des comètes marquées par fluorescence TIP + en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Toutefois, ce logiciel peut également être utilisée pour caractériser la dynamique de MT dans divers types de cellules 8.6.

Grâce à ce logiciel, comme décrit ici fournira plusieurs fichiers d&#39;informations qui permettent de quantifier la dynamique + TIP dans les cellules vivantes. La fonction plusTipGetTracks identifie les pistes (en utilisant par exemple les paramètres présentés dans la figure 1), puis fournit des paramètres concernant les pistes TIP +. Pour afficher les informations que le logiciel a obtenu, allez dans le répertoire roi_X qui a été créé à l&#39;étape 2.2. Le do...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

L&#39;, logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d&#39;images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Recherche

Biologie

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Cultures de cellules neuronales de l&#39;aplysie pour l&#39;imagerie haute résolution des cônes de croissance

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Obtention des oeufs de Xenopus laevis femelles

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Détermination des tissus Utilisation de la transplantation Cap animale (ACT) Dosage dans<em&gt; Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...