Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Dieses Protokoll und Video werden soll als Ergänzung zum ursprünglichen Papier beschreibt das Software-Paket im Detail 4, sowie der Technische Bericht, der mit dem Software-Download auf der Website Danuser Lab kommt zu dienen. Die Leser werden aufgefordert, diese Unterlagen sorgfältig prüfen, ob es weitere Fragen zur Verwendung der Software. 1. Vor der Bildanalyse <ol><li> Jedes Zeitraffer-Film zu konvertieren in eine Folge von TIFF (Tagged Image File Format)-Image-Dateien. ...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker bietet eine einfache, grafische Benutzerschnittstelle für nahezu alle sichtbar EB1-GFP Kometen schnell und automatisch erkennen in einer Zelle oder Wachstumskegel, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und berechnen MT-Parameter. Andere Veröffentlichungen haben die Gestaltung ähnliche Arten von Software (zum Beispiel Marx et al ebenfalls verwendet quantitative Analyse von markierten EB1 Dynamik in Wachstumskegel 18.) Berichtet. Aber wird dieses Software in seiner einfachen Zugang, ...

Das Ziel dieser Methode ist, um quantitative Informationen über Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Protein (+ TIP) Dynamik in lebenden Wachstumskegel zu erhalten. MT + Tipps sind eine Gruppe von Proteinen, die an den Enden der plus-MT 9,10 lokalisieren. Sie führen eine Reihe von Funktionen, um die Parameter der MT dynamische Instabilität 11, einschließlich der Sätze der Polymerisation Katastrophe und Rettung zu regulieren. Ein allgemein verwendetes Verfahren zum Analysieren MT Dynamik ist, um das Verhalten des TIP + EB1, die spezifisch an wachsenden MT bindet plus-Enden 1,12 verfolgen. EB1 ist bekannt, dass mehrere andere Proteine ​​zu rekrutieren wachsenden MT plus-Enden 13,14, und wurde kürzlich als ein MT Reifung Faktor 15 festgestellt, die Förderung sowohl MT Wachstum und Katastrophe Frequenz 15,16. Viele Studien der MT Dynamik in Wachstumskegeln haben Hand-Tracking-Methoden, um Veränderungen in der EB1-GFP Dynamik über die Zeit zu messen 1-3 genutzt, wie EB1 localizatian MT plus-Enden können als Marker für MT-Polymerisation verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil für die Prüfung EB1-GFP Kometen als Proxy für MT Wachstum ist, dass MT Dynamik kann auch in Regionen mit signifikanter MT Überlappung gemessen werden. Während das Verfahren von Hand Verfolgung EB1-GFP Kometen hat nützliche Einblicke in MT vorgesehen Verhaltensweisen 1-3, es ist zeitaufwendig und kann vorgespannt werden. Zusätzlich wird, wie abweichende Wachstumskegel Verhaltensweisen sind wahrscheinlich das Ergebnis von winzigen Verschiebungen im Zytoskelett-Dynamik, die Analyse nur eine kleine Teilmenge von MT (in der Regel notwendig, wenn die Hand-Tracking) kann wichtige Informationen zu verpassen. So messen wir globale Dynamik MT Parameter mit dem Software-Paket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb der hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5. Diese Software, die im Labor entwickelt Danusers, wurde in mehreren Studien Charakterisierung MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 verwendet. Es ist ein Open-Source, unser-freundlich, MATLAB-basierte Paket, automatische Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Tips enthält. Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik werden von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumskurs Lebensdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). Die Software kann direkt von der Website Danuser Lab (unter &quot;Software&quot;) heruntergeladen werden. Während der Danuser Lab unterstützt derzeit eine neuere Schnittstelle für TIP + Tracking-Analyse, die in einem Software-Paket namens u-Track 2.0, das Original, Stand-alone-Software zur Verfügung stehen aufgenommen wird. Die zugrundeliegenden Algorithmen zwischen den beiden Programmen gleich sind (zumindest 2014), wobei nur ein Unterschied von Schnittstelle und Analyse Ausgänge. Für den Anfänger mit wenig MATLAB und / oder Computeranalyse Erfahrenz hat plusTipTracker benutzerfreundlichen Funktionen, einschließlich automatisierter statistischer Parameter Ausgänge. Hier beschreiben wir die Schritte zum Analysieren von Bildern von EB1-GFP Dynamik in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Dieses Protokoll wurde in einer aktuellen Arbeit untersucht die Dynamik MT 17 genutzt. Siehe auch Lowery et al. 2012 5 für ausführliche Anweisungen für die Kultivierung Wachstumskegel ausdrücken EB1-GFP. Während dieses Papier in erster Linie auf die Untersuchung EB1-GFP Dynamik in Wachstumskegel konzentriert, kann das gleiche Protokoll für andere Zelltypen, 17 verwendet werden. Für alle Zelltypen, sollte das Zeitintervall zwischen den Rahmen zwischen 0,5-2 sec für optimale + TIP Verfolgungs sein. Ein Zeitintervall von bis zu 4 Sekunden zwischen den Rahmen möglich ist, aber dies erhöht Intervallzeit zu zusätzlichen Spurfehler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Proteine ​​(+ Tips) zu lokalisieren, um den wachsenden Plus-Enden der MTS und regulieren MT Dynamik 1,2. Eine der bekanntesten und weithin genutzte + Tipps für die Analyse MT Dynamik ist die End-bindendes Protein, EB1, die alle wachsenden MT plus-Enden bindet, und somit ist ein Marker für die MT-Polymerisation 1. Viele Studien von EB1 Verhalten innerhalb Wachstumskegel haben zeitaufwendig und voreingenommen computergestützte, Hand-Tracking-Methoden zur Analyse einzelner MTs 1-3. Unser Ansatz ist es, globale Parameter des MT Dynamik mit dem Softwarepaket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb von hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5 quantifizieren. Diese Software ist eine MATLAB-basierte Open-Source-, benutzerfreundlichen Paket, das automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Filtern kombiniert. Hier präsentieren wir das Protokoll für die Verwendung plusTipTAufsteller für die Analyse von fluoreszenzmarkierten + TIP Kometen in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Jedoch kann diese Software auch zum MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 charakterisieren.

Mit dieser Software, wie hier beschrieben wird mehrere Dateien mit Informationen, + TIP Dynamik in lebenden Zellen zu quantifizieren ist. Die Funktion plusTipGetTracks identifiziert die Tracks (mit Beispiel in Abbildung 1 gezeigten Einstellungen), und stellt Parameter in Bezug auf die + TIP Tracks dann. Um die Informationen, dass die Software erhalten sehen, gehen Sie in das Verzeichnis, in roi_X Schritt 2.2 erstellt wurde. Die &quot;feat&quot; Ordner enthält &quot;overlayI...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Forschung

Biologie

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Beziehen Eier von Xenopus laevis Weibchen

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...