Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

הפרוטוקול והסרטון הזה נועדו לשמש כבן לוויה למאמר המקורי המתאר את חבילת התוכנה בפירוט רב יותר 4, כמו גם את הדוח הטכני שמגיע עם תוכנות להורדה באתר האינטרנט של המעבדה Danuser. קוראים מוזמנים לעיין במסמכים אלה בזהירות אם יש שאלות נוספות בנוגע לשימוש בתוכנה. <p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker מספק ממשק משתמש פשוט, גרפי כדי לזהות במהירות ובאופן אוטומטי שביטים EB1-GFP כמעט כל גלויים בקונוס תא או צמיחה, לקשר שביטים למסלולים, ולחשב פרמטרים MT. פרסומים אחרים דיווחו העיצוב של סוגים דומים של תוכנה (לדוגמא, מרקס et al. ניתוח כמו גם מנוצל של דינמיקת EB1 מתויגת ב...

מטרתה של שיטה זו היא לקבל מידע כמוני אודות microtubule (MT) בתוספת-מעקב סוף החלבון (+ טיפ) דינמיקה בחיים קונוסים צמיחה. MT + טיפים מועילים בקבוצה של חלבונים הלמקם את התוספת-הקצוות של MTS 9,10. הם מבצעים מגוון רחב של פונקציות להסדיר פרמטרים של חוסר יציבות MT הדינמי 11, כוללים שיעורים של פילמור, קטסטרופה, והצלה. שיטה המשמשת היטב אחד לניתוח דינמיקת MT היא לעקוב אחר ההתנהגות של EB1 עצה +, אשר נקשר באופן ספציפי לMT גדל בתוספת-מסתיים 1,12. EB1 ידוע לגייס כמה חלבונים אחרים לMT גדל בתוספת-מסתיים 13,14, ולאחרונה כבר נקבע כגורם התבגרות MT 15, קידום שניהם צמיחת MT ותדירות אסון 15,16. מחקרים של דינמיקת MT בתוך קונוסים צמיחה רבים מנוצלים שיטות עבודת יד מעקב כדי למדוד שינויים בדינמיקת EB1-GFP לאורך הזמן 1-3, כlocalizati EB1לMT יכול לשמש תוספת מסתיימת כסמן לפילמור MT. יתרון עיקרי לבחינת שביטים EB1-GFP כמדד לצמיחת MT הוא שדינמיקת MT ניתן למדוד גם באזורים של החפיפה MT משמעותית. בעוד השיטה של שביטים EB1-GFP יד מעקב סיפקה תובנות שימושיות לMT התנהגויות 1-3, זה זמן רב ויכול להיות מוטה. בנוסף, כצמיחה חריגה התנהגויות קונוס עשויות התוצאה של משמרות דקות בדינמיקת cytoskeletal, ניתוח תת קבוצה קטנה בלבד של MTS (בדרך כלל נדרשות כאשר יד מעקב) עלול להחמיץ מידע משמעותי. לפיכך, אנו מודדים פרמטרים דינמיקת MT הגלובליים באמצעות חבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, לאחר הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו, שפותחה במעבדת Danuser, נעשתה שימוש במספר מחקרים המאפיינים את דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8. זה קוד פתוח,אה ידידותי, חבילה מבוססת MATLAB הכוללת זיהוי אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר הם מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), מסלול של צמיחה חיים (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). את התוכנה ניתן להוריד מאתר אינטרנט המעבדה Danuser ישירות (תחת &quot;תוכנה&quot;). בעוד המעבדה Danuser תומכת כעת ממשק חדש לניתוח מעקב עצה +, אשר שולב לתוך חבילת תוכנה בשם u-מסלול 2.0, התוכנה המקורית, עצמאית תישאר זמינה. האלגוריתמים הבסיסיים בין שתי התוכניות הם אותם (לפחות כמו של 2014), עם רק הבדל של תפוקות ממשק וניתוח. למשתמש המתחיל עם MATLAB הקטן ו / או התנסות אנליזה חישוביתence, יש plusTipTracker תכונות ידידותי למשתמש יותר, ובכלל זה תפוקות פרמטר סטטיסטיות אוטומטיות. כאן, אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis תרבותי צפרדעים. פרוטוקול זה נוצל בשנים האחרונה בעיתון בחינת דינמיקת MT 17. ראו גם אל אפלולי ואח. 2012 5 להוראות מפורטות לגבי קונוסים צמיחת culturing להביע EB1-GFP. בעוד מאמר זה התמקד בעיקר בבחינת דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחה, באותו הפרוטוקול יכול לשמש לסוגי תאים אחרים 17. לכל סוגי התאים, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות בין 0.5-2 שניות למעקב עצה + אופטימלי. מרווח זמן של עד 4 שניות בין המסגרות אפשרי, אבל זה עלה תוצאות מרווח זמן בשגיאות מעקב נוספות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubule (MT) בתוספת-מעקב-end חלבונים (+ טיפים) בתרגום לתוספת-סיום הגדילה של MTS ולהסדיר דינמיקת MT 1,2. אחד הטיפים הידועים ביותר ושימוש נרחב + לניתוח דינמיקת MT הוא כריכה-End החלבון, EB1, הקושר את כל תוספת-קצות MT גדלו, ובכך, מהווה סמן לפילמור MT 1. מחקרים של EB1 התנהגות בתוך קונוסים צמיחה רבים השתמשו זמן רב ו, שיטות עבודת יד מעקב בעזרת מחשב מוטה לנתח פרט MTs 1-3. הגישה שלנו היא לכמת פרמטרים הגלובליים של דינמיקת MT שימוש בחבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, בעקבות הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו היא חבילה מבוססת MATLAB, קוד פתוח, ידידותי למשתמש, המשלבת איתור אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. כאן, אנו מציגים הפרוטוקול לשימוש plusTipTracker לניתוח השביטים עצה + fluorescently שכותרתו בקונוסים צמיחת laevis תרבותיים צפרדעים. עם זאת, תוכנה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8.

שימוש בתוכנה זו, כמתואר כאן יספק כמה קבצי מידע שלכמת דינמיקת עצה + בתאים חיים. PlusTipGetTracks הפונקציה מזהה את הרצועות (באמצעות הגדרות דוגמא מוצגות באיור 1), ולאחר מכן מספק פרמטרים לגבי מסלולי עצה +. כדי להציג את המידע שהתוכנה קי?...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...