Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Questo protocollo e il video hanno lo scopo di servire come un compagno per la carta originale che descrive il pacchetto software in modo più dettagliato 4, così come la relazione tecnica che accompagna il download del software sul sito web di Danuser Lab. I lettori sono invitati a rivedere questi documenti con attenzione se ci sono domande supplementari per quanto riguarda l&#39;utilizzo del software. 1 Prima di Image Analysis <ol><li> Convertire ogni filmato time-lapse in un...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più--end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine ​​(+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine ​​che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altre proteine ​​per crescere MT plus-conclude 13,14, ed è stato recentemente istituito come un fattore di maturazione MT 15, MT promuovere sia la crescita e la frequenza catastrofe 15,16. Molti studi di dinamica MT all&#39;interno di coni di crescita hanno utilizzato metodi di mano-tracking per misurare i cambiamenti nelle dinamiche EB1-GFP nel tempo 1-3, come EB1 localizatia MT, più-end possono essere usati come marker per MT polimerizzazione. Uno dei principali vantaggi per l&#39;esame comete EB1-GFP come proxy per la crescita MT è che la dinamica MT possono essere misurati anche nelle regioni di sovrapposizione significativa MT. Mentre il metodo di tracciamento a mano comete EB1-GFP ha fornito indicazioni utili in MT comportamenti 1-3, è che richiede tempo e può essere prevenuto. Inoltre, come la crescita aberrante comportamenti cono sono probabilmente il risultato di cambiamenti minute dinamica del citoscheletro, analizzando solo un piccolo sottoinsieme di MTS (di solito necessario quando la mano-tracking) possono perdere informazioni significative. Così, misuriamo globali parametri delle dinamiche MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, dopo l&#39;acquisizione ad alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software, sviluppato in Danuser Lab, è stata utilizzata in diversi studi che caratterizzano dinamiche MT in vari tipi di cellule 6-8. Si tratta di un open-source, cier-amichevole, pacchetto basato su MATLAB, che comprende il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono calcolati da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l&#39;analisi delle dinamiche MT in coni di crescita, i parametri più utili sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), traccia la crescita durata (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). Il software può essere scaricato direttamente dal sito web Danuser Lab (sotto &quot;Software&quot;). Mentre il Danuser Lab supporta attualmente una nuova interfaccia per il monitoraggio TIP + analisi, che è integrata in un pacchetto software chiamato u-track 2.0, l&#39;originale, software stand-alone rimarrà disponibile. Gli algoritmi sottostanti tra i due programmi sono uguali (almeno dal 2014), con solo una differenza di uscite dell&#39;interfaccia e di analisi. Per l&#39;utente inesperto con poco MATLAB e / o l&#39;analisi computazionale esperimentiza, plusTipTracker ha più caratteristiche user-friendly, tra cui le uscite dei parametri statistici automatizzati. Qui, descriviamo la procedura per l&#39;analisi di immagini dinamiche EB1-GFP in coltura Xenopus laevis coni di crescita. Questo protocollo è stato utilizzato in un recente documento esamina le dinamiche MT 17. Per istruzioni dettagliate relative coni di crescita coltura esprimono EB1-GFP Vedi anche Lowery et al. 2012 5. Anche se questo documento è concentrata principalmente sull&#39;esame dinamiche EB1-GFP in coni di crescita, lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri tipi di cellule 17. Per tutti i tipi di cellule, l&#39;intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere compresa tra 0,5-2 sec per il monitoraggio ottimale + TIP. Un intervallo di tempo di fino a 4 secondi tra i frame è possibile, ma questo aumento risultati in tempo intervallo di tracking error supplementari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine ​​(+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l&#39;analisi dinamica MT è l&#39;End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell&#39;acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l&#39;analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l&#39;utilizzo di plusTipTRacker per l&#39;analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.

Usando questo software, come descritto qui fornirà diversi file di informazioni che quantificano + dinamiche TIP nelle cellule viventi. I plusTipGetTracks funzione identifica le tracce (con esempio impostazioni mostrate nella figura 1), e quindi fornisce parametri relativi alle tracce TIP +. Per visualizzare le informazioni che il software ha ottenuto, andare nella directory roi_X creata nel passaggio 2.2. La cartella &quot;impresa&quot; contiene &quot;overlayImages&quot;, ...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Ricerca

Biologia

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...