Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Este protocolo y el vídeo tienen el propósito de servir como un compañero al documento original que describe el paquete de software en más detalle 4, así como el informe técnico que acompaña la descarga del software en el sitio web Danuser Lab. Se anima a los lectores a revisar estos documentos cuidadosamente si hay preguntas adicionales con respecto al uso del software. 1. Antes de Análisis de Imágenes <ol><li> Convertir cada película de lapso de tiempo en una secuenc...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker proporciona una interfaz de usuario sencilla, gráfica para detectar de forma rápida y automática prácticamente todos los cometas visibles EB1-GFP en un cono o el crecimiento celular, vincular las cometas en pistas, y calcular los parámetros de MT. Otras publicaciones han informado el diseño de tipos similares de software (por ejemplo, Marx et al. También utilizó el análisis cuantitativo de la dinámica de EB1 marcadas en los conos de crecimiento 18). Pero, este programa parece...

El objetivo de este método es la obtención de información cuantitativa respecto a los microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de la dinámica en los conos de crecimiento que vive proteína (+ TIP). MT + consejos son un grupo de proteínas que se localizan en las plus-extremos de los MT 9,10. Llevan a cabo una serie de funciones para regular los parámetros de MT inestabilidad dinámica 11, como los porcentajes de polimerización, la catástrofe, y el rescate. Un método muy usado para el análisis de la dinámica de MT es realizar un seguimiento del comportamiento de la EB1 TIP +, que se une específicamente a la creciente MT plus-termina 1,12. EB1 es conocido por reclutar otras proteínas a la creciente MT plus-termina 13,14, y recientemente se ha establecido como un factor de maduración de MT 15, promoviendo tanto el crecimiento de MT y la frecuencia catástrofe 15,16. Muchos estudios sobre la dinámica de MT en los conos de crecimiento se han utilizado métodos de la mano-de seguimiento para medir los cambios en la dinámica EB1-GFP en el tiempo 1-3, como localizati EB1a MT-más extremos pueden ser utilizados como un marcador para la polimerización de MT. Un beneficio clave para el examen de los cometas EB1-GFP como un proxy para el crecimiento MT es que la dinámica de MT se pueden medir incluso en las regiones de solapamiento significativo MT. Mientras que el método de los cometas EB1-GFP-tracking mano ha proporcionado información útil sobre MT comportamientos 1-3, es mucho tiempo y puede estar sesgado. Además, ya que el crecimiento aberrante comportamientos cono son probablemente el resultado de los cambios de hora en la dinámica del citoesqueleto, analizando sólo un pequeño subconjunto de los MT (suele ser necesario cuando la mano-seguimiento) puede perder información importante. Por lo tanto, medimos los parámetros globales de dinámica MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, después de la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software, desarrollado en el Laboratorio de Danuser, se ha utilizado en varios estudios que caracterizan la dinámica de MT en diversos tipos de células 6-8. Es un código abierto, noser-amistoso, paquete basado en MATLAB que incluye la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. Una larga lista de parámetros específicos de la dinámica de MT se calculan por este software (ver referencia 4 para más detalles), pero para el análisis de la dinámica de MT en los conos de crecimiento, los parámetros más útiles son MT velocidad senda del crecimiento (en micras / minuto), la senda del crecimiento curso de la vida (en segundos), y la longitud de la pista de crecimiento (en micras). El software se puede descargar directamente desde la página web Danuser Lab (en &quot;Software&quot;). Mientras que el Laboratorio Danuser actualmente soporta una nueva interfaz para el análisis de seguimiento + TIP, que se incorpora en un paquete de software llamado u-pista 2.0, el software original, independiente seguirá estando disponible. Los algoritmos subyacentes entre los dos programas son los mismos (por lo menos a partir de 2014), con sólo una diferencia de salidas de la interfaz y de análisis. Para el usuario principiante con poco MATLAB y / o análisis computacional expericia, plusTipTracker tiene más características fáciles de usar, incluyendo salidas de parámetros estadísticos automatizados. A continuación, describimos los pasos para el análisis de imágenes de la dinámica EB1-GFP en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Este protocolo se utilizó en un artículo reciente sobre la dinámica de MT 17. Ver también Lowery et al. 2012 5 para instrucciones detalladas de los conos de crecimiento del cultivo que expresan EB1-GFP. Si bien este documento se centró principalmente en el examen de la dinámica de EB1-GFP en los conos de crecimiento, el mismo protocolo se puede utilizar para otros tipos de células 17. Para todos los tipos de células, el intervalo de tiempo entre tramas debe estar entre 0,5-2 seg para el seguimiento óptimo + TIP. Un intervalo de tiempo de hasta 4 segundos entre tramas es posible, pero este aumento de los resultados de tiempo de intervalo en errores de seguimiento adicionales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtúbulos (MT) plus de fin de seguimiento de las proteínas (+ consejos) localizar a las crecientes más-extremos de MTs y regulan la dinámica de MT 1,2. Uno de los consejos más conocidos y utilizados ampliamente + para el análisis de la dinámica de MT es la proteína, EB1 Fin de Unión, que une a todos los que crecen MT plus-extremos, y por lo tanto, es un marcador para la polimerización MT 1. Muchos estudios de comportamiento EB1 dentro conos de crecimiento se han utilizado mucho tiempo y, métodos tendenciosos mano de seguimiento con ayuda de computadora para analizar individuo MTs 1-3. Nuestro enfoque consiste en cuantificar los parámetros globales de la dinámica de MT utilizando el paquete de software, plusTipTracker 4, tras la adquisición de alta resolución, imágenes en directo de EB1 etiquetados en los conos de crecimiento embrionarias cultivadas 5. Este software es un código abierto, paquete basado en MATLAB, fácil de usar que combina la detección automática, el seguimiento, la visualización y el análisis de las películas de + Filtros marcadas con fluorescencia. A continuación, presentamos el protocolo para el uso de plusTipTracker para el análisis de los cometas TIP marcadas con fluorescencia + en los conos de crecimiento laevis cultivadas Xenopus. Sin embargo, este software también puede ser utilizado para caracterizar la dinámica de MT en diversos tipos celulares 6-8.

El uso de este software aquí descrito ofrecer varios archivos de información que cuantifican + dinámica TIP en las células vivas. Los plusTipGetTracks función identifica las pistas (utilizando la configuración de ejemplo que se muestran en la Figura 1) y, a continuación, proporciona parámetros respecto a las pistas TIP +. Para ver la información que el software ha obtenido, vaya al directorio roi_X que se creó en el paso 2.2. La carpeta &quot;hazaña&quot; contiene...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

El paquete de software basado en MATLAB código abierto, plusTipTracker, se puede utilizar para analizar series de imágenes de fluorescencia + Filtros marcado para cuantificar la dinámica de microtúbulos.

Usando plusTipTracker Software a Medida microtúbulos dinámica en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Conos de Crecimiento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Investigación

Biología

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

La obtención de huevos de Xenopus laevis mujeres

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...