Name: rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Författarna kraftigt erkänner Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert och Louise Rimbault i Cochin Imaging Facility. Detta arbete stöddes av Inserm, CNRS och Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Framställning av T-lymfocyter <ol><li> Förbered primär mus eller humana T-celler, såsom beskrivits 10,11. </li><li> Odla humana T-celler i komplett RPMI-medium med 10% humant serum AB vid en densitet av 2-3 x 10 6 celler / ml. OBS: Användning av fetalt kalvserum (FCS) i stället för humant serum kan framkalla spontan polarisation av en stor fraktion av humana T-celler i odling. Förvara dessa celler i odling under 4-5 dagar och ytterligare process dem när som helst under denna pe...

<ol>
	<li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chemokines+and+their+receptors.">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li><li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance.">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li><li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation.">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li><li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions.">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li><li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta:+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells.">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li><li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration.">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li><li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior.">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li><li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+T+cell+shape,+motility,+and+sensitivity+to+antigen.">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409 (2007).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes.">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li></ol>

Med hjälp av en ny teknik för bild flödescytometri, en snabb och informativ gating strategi för att analysera cellulära och molekylära händelser som framkallas av kemokin stimulering presenteras. Från ett enda experiment, kan man få två huvudtyper av information: förändringar i cellmorfologi inducerade av kemokin stimulering och subcellulära fördelningen av olika proteiner under polariseringsprocessen. Intressant är bevis också för möjligheten att analysera ett stort antal celler, vilket möjliggör st...

Kemokiner är små lösliga proteiner som lockar celler till specialiserade platser 1. Därför deltar de i rätt placering av celler i vävnader, en avgörande funktion i utvecklingen och fysiologi. Immunförsvaret är inget undantag från denna regel eftersom det bygger på effekten av många olika celltyper som samverkar om att montera ett effektivt immunsvar. Genom att kontrollera den specifika platsen av en immuncelltypen i ett givet tillstånd, kemokiner är pre-krävs innan främmande antigener kan detekteras och neutraliseras. I T-lymfocyter i synnerhet, kemokiner binder till specifika ytreceptorer som, vid ingrepp, framkallar många intracellulära signaler (kalcium rise, ERK fosforylering, Rho GTPaser aktiverings, ökning av integriner affinitet och cytoskelettala förändringar) som gynnar T cellmotilitet 2,3. På cellnivå, kan man observera morfologiska förändringar framkallade vid chemokin stimulering.Dessa förändringar i cellformer är särskilt dramatisk i T-celler: vilande T-celler har en pärlliknande rund morfologi när de reser i blodet. Dock är avkänning av förekomsten av kemokiner i inflammatoriska ställen eller vid närhet lymfoidorgan kommer att ändra formen på T-celler som nu antar en typisk &quot;handspegel&quot; morfologi bestående av en bipolär formen: en framkant på framsidan och en bakkant, eller uropod, på baksidan 4. Dessutom kan intracellulära komponenter segregerar in i dessa två motsatta områden av en polariserad T-cell för att upprätthålla migrering. Exempelvis aktinfilament polymerisationsförfaranden ökar vid kemokin stimulering 5 och polymeriserad aktin ackumuleras på framsidan av en polariserad T-cell 2. Å andra sidan, flera proteiner, såsom fosforylerade proteiner hos Ezrin-radixin-moesin (ERM) -familjen som kopplar plasmamembranet till det kortikala F-aktin cytoskelettet, åter lokalisera vid uropod av polariseradT-celler 6. Intressant nog har vi och andra visat att denna polarisering process krävs för T-cell migration. I själva verket kommer någon behandling som stör polarisering hämma cellulär motilitet. Till exempel, hämning av aktiviteten av medlemmarna i den atypiska proteinkinaser C (PKC) familj, PKCζ och PKCι blockerar T-cell polarisering och deras vandrande skann av dendritiska celler 7. T-cell polarisering regleras också av Rho GTPaser. Vi har visat att moduleringen av RhoA aktivitet genom den nyligen beskrivna Fam65b protein stör T-cellförändringar i morfologi och deras förmåga att migrera i en Transwell-analys 6. Som polarisering är en förutsättning steg för cellulär motilitet är det alltså viktigt att kunna kvantifiera det som en huvud avläsning av kemokina svar. Cell form förändringar tidigare uppmätta manuellt 8. Emellertid är denna typ av kvantifiering mycket tidskrävande, så att vanligen endast ett fåtaltiotals celler beaktas. Här används en ny metod presenteras för att snabbt kvantifiera graden av form förändringar av T-lymfocyter exponerade för kemokin stimulering. En bild flödescytometri teknik (se tabell av särskilda reagenser / Utrustning) används, vilket kombinerar fördelarna med en flödescytometer och ett mikroskop 9 att kvantifiera effektivt mängden polarise celler i olika förhållanden kemokin stimulering. Förutom kvantifiering av de morfologiska förändringar som man kan mäta kraftigt med denna teknik är det också möjligt att utvärdera förändringar i subcellulära lokalisering av vissa proteiner vid chemokin signalering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="569">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Name of the material/Equipment</td>
			<td style="width:95px;">Company</td>
			<td style="width:80px;">Catalog number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">RPMI</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">61870-010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:140px;">Human serum AB</td>
			<td style="width:95px;">PAA</td>
			<td style="width:80px;">C11-021</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:140px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:95px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:80px;">P30-3300</td>
			<td style="width:255px;">Pre-heat to inactivate the complement.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">Human T cell nucleofactor kit</td>
			<td style="width:95px;">Lonza</td>
			<td style="width:80px;">VCA-1002</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Murine IL7</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">217-17</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:140px;">HBSS</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">14025-050</td>
			<td style="width:255px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Hepes</td>
			<td style="width:95px;">Gibco</td>
			<td style="width:80px;">15630-056</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:140px;">Murine CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">250-27B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:140px;">Human CCL19</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-29B</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:140px;">Human CXCL12</td>
			<td style="width:95px;">Peprotech</td>
			<td style="width:80px;">300-28A</td>
			<td style="width:255px;">Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:140px;">PFA</td>
			<td style="width:95px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:80px;">157-8-100</td>
			<td style="width:255px;">This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">&#160;BSA</td>
			<td style="width:95px;">Sigma</td>
			<td style="width:80px;">A3059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Saponin</td>
			<td style="width:95px;">Fluka</td>
			<td style="width:80px;">84510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">A12381</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">FITC-anti-HLA-ABC antibody</td>
			<td style="width:95px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:80px;">IM1838</td>
			<td style="width:255px;">clone B9.12.1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:140px;">Anti-P-ERM antibody</td>
			<td style="width:95px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:80px;">3149P</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:140px;">ImageStreamx Mark II</td>
			<td style="width:95px;">Amnis</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

Celler svarar på chemokin stimulering genom att förlora sin runda form i en process som kallas polarisering, och genom att ändra subcellulära lokalisering av många proteiner. Klassiska avbildningstekniker har använts för att studera dessa fenomen. Dock krävs det manuell förvärv av många celler följt av tidskrävande kvantifiering av morfologin och samlokalisering av färgning av tiotals celler. Här är en snabb och kraftfull metod som beskrivs för att studera dessa fenomen på prover som består av flera tusen celler med hjälp av en bild flödescytometri teknik som kombinerar fördelarna med ett mikroskop med de av en cytometer. Använda T-lymfocyter stimulerade med CCL19 och färgning för MHC klass I-molekyler och fintrådiga aktin, är en grindstrategi som presenteras för mätning samtidigt graden av formförändringar och omfattningen av samlokalisering av markörer som påverkas av CCL19 signalering. Dessutom har denna gating strategi tillät oss att Observe segregeringen av fintrådiga aktin (längst fram) och fosforyleras Ezrin-radixin-moesin (fosfor-ERM) proteiner (baktill) i polarise T-celler efter CXCL12 stimulering. Denna teknik var också nyttigt att observera den blockerande effekt på polarisering av två olika delar: hämning av aktin polymerisation av en farmakologisk hämmare och uttryck av mutanter av Par6 / atypiska PKC signaleringsvägen. Således är bevis visat att denna teknik är användbar för att analysera båda morfologiska förändringar och protein omfördelningar.

Det första exemplet väljs här gäller användningen av mänskliga primära T-lymfocyter som stimulerats med CCL19. Emellertid kan samma strategi användas med primär mus-T-celler, T-cellinjer eller någon annan celltyp som reagerar för kemokin stimulering. Strategin gating presenteras här innehåller en rad fönster som väljer de fokuserade händelser, då de enskilda cellerna. Slutligen intervallet fluorescensintensitet följes här som ett exempel på två markörer: MHC klass I HLA-ABC och filamentös aktin f?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Snabb och Robust analys av cellulär och molekylär Polarisering inducerad av Chemokine Signa

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Visualisering och kvantifiering av intracellulära interaktioner av Neisseria meningitidis Och mänskliga α-actinin av Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Avbildning av HIV-1 kuvert-inducerad Virologiskt Synapse och signalering av syntetiska lipiddubbelskikt

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Teknik för Real-time, samtidig avbildning av TCR och dess associerade signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analys av epitelskada Producerad av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Snabb analys av kromosomavvikelser hos mus B lymfocyter från PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snabb molekylär detektion och differentiering av influensavirus A och B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Snabb kvantifiering av Mitogen-inducerad blastogenes i T-lymfocyter för att identifiera immunmodulerande läkemedel

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

Dissekera multi signalering proteinkomplex av Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

En murin modell av Dengue virus-inducerad akut viral encefalit-liknande sjukdom

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...