Name: the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo
Uploaded: 2014-10-30T15:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo at JoVE.com

This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

नोट: पशु प्रयोगों में नीतिशास्त्र के लिए गौटिंगेन विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में पशु हैंडलिंग और प्रयोगों प्रदर्शन किया गया. उपकरण और पिपेट निर्माण के 1. तैयारी <ol><li> Electroporation के सेटअप बड़े काम दूरी के साथ एक stereomicroscope के होते हैं और इस्तेमाल डाई के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी और फिल्टर सेट से लैस है कि सुनिश्चित करें. </li><li> Electroporation के लिए एक समर्पित एकल कक्ष electroporator या एक आस्टसीलस्कप से जुड़ी एक सामान्य वर्ग पल्स जनरेटर का उपयोग. एक पिपेट धारक और एक स्नान इलेक्ट्रोड को electroporator outputs कनेक्ट. Micropipette धारक और स्नान इलेक्ट्रोड के लिए नकारात्मक टर्मिनल के लिए पल्स जनरेटर के सकारात्मक टर्मिनल से कनेक्ट करें. पिपेट धारक और स्नान इलेक्ट्रोड दोनों चांदी क्लोराइड की एक पतली परत के साथ लेपित चांदी के तारों को शामिल किया जाता है. </li><li> सटीक स्थिति की अनुमति के लिए एक micromanipulator पर पिपेट धारक माउंट. </li&gt; <li> आंतरिक रेशा साथ borosilicate ग्लास केशिकाओं से electroporation के micropipettes बनाना. </li><li> एक क्षैतिज micropipette खींचने का प्रयोग करें और bestman एट अल. 13 द्वारा वर्णित के रूप में पैच दबाना प्रयोगों के लिए pipettes के निर्माण के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल लागू होते हैं. </li><li> एक लंबी टांग और एकल कक्ष electroporation के लिए लगभग 15-20 MOhm के एक उच्च पिपेट प्रतिरोध में जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे टिप खोलने का निर्माण करने के मापदंडों को अपनाना. पिपेट प्रतिरोध कोशिकाओं के समूह की लेबलिंग के लिए, 3-4 MOhm, जैसे, कम होना चाहिए. </li><li> एक समर्पित एकल कोशिका electroporator साथ पिपेट प्रतिरोध या तो सीधे उपाय या एक परिभाषित वोल्टेज स्पंद के आवेदन के बाद एक आस्टसीलस्कप के साथ वर्तमान प्रवाह को मापने के बाद ओम कानून के साथ यह गणना. </li></ol> Electroporation समाधान 2. तैयारी <ol><li> मेंढक घंटी (98 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl में फ्लोरोफोरे युग्मित dextran भंग, 1 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी MGCएल 2, 3 मिमी की एकाग्रता में 5 मिमी ग्लूकोज, पीएच 7.8 करने के लिए समायोजित 5 मिमी ना-पाइरूवेट, 10 मिमी HEPES, परासारिता mOsmol / एल 230) था. कम डाई सांद्रता उपयोग किया जाता है अगर कोशिकाओं इतनी तेज लेबल नहीं किया जा सकता है. एक बड़ी मात्रा में स्टॉक समाधान तैयार है और छोटे aliquots में विभाजित. भंडारण (महीनों के लिए स्थिर) के लिए उन्हें रोक. नोट: dextrans विभिन्न आकारों और उत्सर्जन / उत्तेजना स्पेक्ट्रा की एक किस्म में उपलब्ध हैं (. जैसे, एलेक्सा 488 dextran 10kD, एलेक्सा 546-dextran 10kD, एलेक्सा 568-dextran 10kD, एलेक्सा 594-dextran 10kD, TMR-dextran 3kD). </li><li> Dextran समाधान (1-5 μl) की एक छोटी मात्रा के साथ एक लम्बी पिपेट टिप के साथ micropipette backfill. ध्यान पिपेट टिप से अवशिष्ट हवा बुलबुले को दूर करने के लिए उंगली से micropipette झटका. </li><li> पिपेट धारक में micropipette माउंट. पिपेट अंदर चांदी के तार डाई समाधान के साथ संपर्क में है कि सुनिश्चित करें. </li></ol> लारवल एक्स 3. चुनाव laevis &lt;/ उन्हें&gt; <ol><li> एक्स के सूरजमुखी मनुष्य लार्वा का प्रयोग करें प्रयोगों के लिए laevis. जंगली प्रकार के पशुओं में confocal / multiphoton इमेजिंग के दौरान autofluorescence उत्सर्जन दिखाने और इसलिए वर्णित प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि वर्णक से भरे melanophores अधिकारी. </li><li> Nieuwkoop और फैबर 14 के बाद premetamorphotic tadpoles मंच. प्रयोगों के लिए चरणों 45-53 के tadpoles का चयन करें. </li></ol> Fluorophore-युग्मित dextrans 4. Electroporation <ol><li> एक पेट्री डिश में ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस और (पीएच 7 को समायोजित इथाइल 3-aminobenzoate methanesulfonate,) 0.02% tricaine युक्त पानी की एक छोटी मात्रा के साथ कवर. </li><li> 0.02% tricaine युक्त पानी में tadpoles anesthetize. कुछ ही मिनटों के बाद जानवरों चलती संघर्ष. Tadpoles छूकर उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें. वे गैर जिम्मेदार होना चाहिए. </li><li> ध्यान से ऊतक कवर पेट्री डिश के लिए संवेदनाहारी से टैडपोल हस्तांतरण. </li><li> यकीन स्नान electr बनाओस्तोत्र electroporation के सर्किट बंद कर देता है. इलेक्ट्रोड गीला ऊतक के साथ संपर्क में है कि सुनिश्चित करना; टैडपोल के लिए एक सीधा संपर्क आवश्यक नहीं है. </li><li> Micromanipulator का उपयोग घ्राण अंग को micropipette टिप पास स्थिति. </li><li> पिपेट टिप के साथ घ्राण अंग को कवर त्वचा घुसना और सावधानी से मुख्य घ्राण उपकला या vomeronasal उपकला के केन्द्र स्थित संवेदी न्यूरॉन परत में टिप अग्रिम. </li><li> संवेदी न्यूरॉन्स में डाई हस्तांतरण करने के लिए सकारात्मक वर्ग वोल्टेज दालों ट्रिगर. एक ही वोल्टेज पल्स लागू करें (जैसे., 25 वी, नाड़ी लंबाई 25 मिसे) या एकाधिक दालों की गाड़ियों (जैसे., 50 वी, नाड़ी लंबाई 300 μsec, 200 हर्ट्ज पर 400 मिसे ट्रेन अवधि). लेबलिंग का विस्तार वांछित लिए इष्टतम वोल्टेज पल्स मापदंडों का निर्धारण: ध्यान दें. लेबल कोशिकाओं की संख्या कम करने के लिए वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और repetitions की संख्या कम करें. पी के उच्च वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और संख्या लागू करेंएक अधिक व्यापक लेबलिंग के लिए ulses. </li><li> Stereomicroscope की फ्लोरोसेंट रोशनी का उपयोग कर ट्रिगर दालों से सफल डाई बाहर निकालना और electroporation कल्पना. डाई सफल electroporation के बाद सेल शरीर और dendrite में तेजी से फैलता है. </li><li> दोहराएँ टैडपोल की दूसरी घ्राण अंग के लिए 4.5-4.9 कदम. </li><li> वसूली के लिए ताजा पानी से भरा एक बीकर में टैडपोल स्थानांतरण. सीए के बाद 5 मिनट के tadpoles संज्ञाहरण से जगा और सामान्य तैराकी आंदोलनों शुरू करते हैं. </li><li> 24 घंटे के बाद electroporated डाई संवेदी न्यूरॉन्स में फैलता है और अंततः axonal परिवहन के माध्यम से घ्राण बल्ब तक पहुँचता है. </li></ol> कोशिकाओं और axonal प्रक्रियाओं के vivo दृश्य के लिए 5. बढ़ते पशु <ol><li> 0.02% tricaine युक्त पानी में tadpoles anesthetize. </li><li> ध्यान से जैसे एक इमेजिंग कक्ष में tadpoles हस्तांतरण, एक छोटे सिलिकॉन रबर एक टैडपोल आकार के अवकाश के साथ पेट्री डिश को कवर किया. &lt;/ ली&gt; <li> Parafilm की एक पट्टी में एक छोटे आयत काटें. कट आउट खिड़की के माध्यम से अवगत कराया पूर्वकाल telencephalon छोड़ने, Parafilm के साथ टैडपोल कवर. टैडपोल घायल हुए बिना पकवान पर सुइयों के साथ Parafilm के ठीक करें. </li><li> टैडपोल 0.02% tricaine युक्त पर्याप्त पानी में डूबे हुए है सुनिश्चित करें. </li><li> एक ईमानदार multiphoton खुर्दबीन या confocal खुर्दबीन के मंच पर इमेजिंग कक्ष माउंट. </li><li> घ्राण बल्ब की छवियों का एक तीन आयामी ढेर मोल. इमेजिंग प्रक्रिया जितना संभव हो कम है और 10-15 मिनट से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें. </li><li> एक अलग टैंक में सामान्य पानी में टैडपोल लौटें और प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के. 5 मिनट के बाद, टैडपोल संज्ञाहरण से उठता है. </li><li> दोहराएँ, निर्दिष्ट समय अंतराल के बाद 5.1-5.7 कदम उदा., हर दिन है. </li></ol> कोशिकाओं और axonal प्रक्रियाओं के पूर्व vivo दृश्य के लिए 6 बढ़ते पशु <ol><li> वैकल्पिक रूप से खंड 5 कोप्रोटोकॉल की, लेबल संवेदी न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए एक excised मस्तिष्क तैयारी का उपयोग करें. </li><li> Anesthetize और रीढ़ की हड्डी के संक्रमण में मस्तिष्क की transection द्वारा टैडपोल मार डालते हैं. घ्राण अंगों, घ्राण नसों और पूर्वकाल telencephalon युक्त ऊतक का एक ब्लॉक आबकारी. </li><li> मेंढक घंटी समाधान के लिए ऊतक ब्लॉक स्थानांतरण और मस्तिष्क के उदर पक्ष को बेनकाब करने के लिए ठीक कैंची के साथ संयोजी ऊतक को हटा दें. </li><li> एक इमेजिंग चैम्बर के लिए ऊतक ब्लॉक स्थानांतरण और नायलॉन के धागे के साथ तारवाला एक प्लैटिनम फ्रेम के साथ यह तय कर लो. </li><li> एक confocal / multiphoton खुर्दबीन के मंच पर इमेजिंग कक्ष माउंट. </li><li> घ्राण बल्ब की छवियों का एक तीन आयामी ढेर मोल. </li></ol> 7. छवि प्रसंस्करण और डेटा मूल्यांकन <ol><li> कूप, पी एट अल द्वारा वर्णित के रूप में अनुकूलन और छवि गुणवत्ता और neuronal संरचनाओं के दृश्य को बेहतर बनाने के लिए छानने के गैर स्थानीय साधन लागू होते हैं. 15. नोट: लाइव नमूनों की गहरी ऊतक परतों में इमेजिंग प्रयोगों से डेटा अक्सर शोर कर रहे हैं. </li><li> एक सिंहावलोकन के लिए छवि के ढेर की अधिकतम तीव्रता अनुमानों बनाएँ. </li><li> समय-चूक के लिए इमेजिंग प्रयोगों संवेदी न्यूरॉन्स की एकल असंदिग्ध रूप से पहचान योग्य axons के लिए डेटा सेट स्क्रीन. </li><li> पेंग एट अल द्वारा वर्णित के रूप में neuronal प्रक्रियाओं के सॉफ्टवेयर की मदद से ट्रेसिंग के माध्यम से सेलुलर आकारिकी पुनर्निर्माण किया. 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. 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The authors have nothing to disclose.

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया लार्वा एक्स की घ्राण अंग की लेबलिंग संवेदी न्यूरॉन्स की अनुमति देता है फ्लोरोफोरे युग्मित dextrans और रहने वाले पशु में संवेदी अक्षतंतु विकास के बाद के दृश्य की electroporation द्वारा laevis. इन विवो electroporation के मापदंडों से अलग यह लेबल संवेदी न्यूरॉन्स की संख्या को नियंत्रित करने के लिए संभव है. यह बहुत कम या यहां तक ​​कि एकल कक्षों एक संवेदी उपकला, के न्यूरॉन्स के बड़े समूहों लेबल करने के लिए इस तरह संभव है. यह micropipette विशेषताओं और electroporation दालों के बारे में विशेष रूप से सतर्क रहने के लिए महत्वपूर्ण है न्यूरोनल लेबलिंग का विस्तार वांछित सुनिश्चित करने के लिए. हायर पिपेट resistances और वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और repetitions की संख्या में कमी और अधिक व्यापक लेबलिंग का कारण बन सकता पिपेट resistances और उच्च वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और दालों की संख्या कम है, जबकि लेबल कोशिकाओं की मात्रा को कम कर सकते हैं. गुelectroporation के लिए फ्लोरोसेंट dextrans की ई उपयोग लागू सेटिंग्स उपयुक्त हैं यदि तत्काल दृश्य प्रतिक्रिया प्रदान करता है. सावधान रहें कि आयाम, अवधि और संभावित सेल नुकसान हो या मौत भी 17 सेल कर सकते हैं प्रोटोकॉल में प्रदान मूल्यों से अधिक है कि दालों की संख्या के लिए मानकों का प्रयोग. Micropipettes के भरा हुआ या टूट टिप्स भी सफल electroporation के बाधा कर सकते हैं. एक्स की घ्राण अंग में vivo electroporation में postmetamorphotic मेंढक की त्वचा मुश्किल है और आसानी से एक micropipette के साथ प्रवेश नहीं किया जा सकता क्योंकि laevis लार्वा चरणों तक सीमित है. neuronal प्रक्रियाओं के vivo दृश्य गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों में या रक्त वाहिकाओं से उत्तेजना / उत्सर्जन प्रकाश के प्रकीर्णन द्वारा बाधा जा सकता है. इस समस्या की वजह से एक बड़ा मस्तिष्क को उच्च लार्वा चरणों में विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है और ठीक axonal प्रक्रियाओं की स्पष्ट पहचान और अधिक कठिन बना शोर संकेत हो सकता है. <p= &quot;jove_content&quot;&gt; प्रस्तुत प्रोटोकॉल परमिट वर्ग पूरे सेल पैच में लेबलिंग की तरह, पशु विदारक लेबलिंग के दौरान कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए, ऊतक स्लाइस तैयारी या वैकल्पिक तरीकों के लिए आवश्यक के रूप में ऊतक फिक्सिंग बिना बरकरार घ्राण प्रणाली में संवेदी न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए -clamp प्रयोगों 18. इन विवो समय चूक इमेजिंग के साथ कुछ या एकल संवेदी न्यूरॉन्स की लेबलिंग के संयोजन है, यह लंबे समय के अंतराल पर एक परिपक्व संवेदी न्यूरॉन्स की केशिकागुच्छीय कनेक्शन कल्पना करने के लिए संभव है. इस तरह से यह कई सप्ताह से अधिक अपरिपक्व संवेदी न्यूरॉन्स की axonal प्रक्षेपण पैटर्न के विकास पर नजर रखने के लिए भी संभव है. यह रहने वाले पशु में एकल axons की विकास पैटर्न की निगरानी की अनुमति देता है के रूप में यह दूसरा विकल्प विशेष रूप से दिलचस्प है. इस अक्षतंतु मार्गदर्शन और pathfinding कि नियंत्रण सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए संभावना को खोलता है. Odorant रिसेप्टर अभिव्यक्ति सहित कई कारकों, विभिन्न axoएन मार्गदर्शन अणुओं और संवेदी न्यूरॉन्स की odorant प्रेरित / सहज गतिविधि संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु 4,5 का लक्ष्य खोज को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है. प्रोटोकॉल के आवेदन घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी जैसे अन्य प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है., विकासशील मस्तिष्क या घ्राण बल्ब की मित्राल कोशिकाओं की तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों की / पूर्वज स्टेम सेल. इसके अलावा प्रदर्शन तकनीक भी लेबल न्यूरॉन और / या जुड़े circuitry के 7,19 के बारे में कार्यात्मक जानकारी पाने के लिए झिल्ली पारगम्य कैल्शियम रंजक कैल्शियम संवेदनशील dextrans साथ संयोजन में इस्तेमाल किया या इंजेक्शन जा सकता है. dextrans लिए युग्मित fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला की उपलब्धता कई व्यक्ति की कोशिकाओं या अलग अलग रंग के साथ आबादी की लेबलिंग परमिट. इसके अलावा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उदाहरण एन्कोडिंग के लिए डीएनए समाधान, प्लाज्मिड, electroporation के लिए उपयुक्त है और आगे versatili वृद्धि कर सकते हैंTy और तकनीक 6 की उपयोगिता. प्रोटोकॉल आगे dextrans और डीएनए या आरोप लगाया morpholinos के संयुक्त electroporation के जीन अभिव्यक्ति 13,17 हेरफेर करने के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है. वर्णित विधि निश्चित रूप से जटिल और कशेरुकी घ्राण प्रणाली में axonal मार्गदर्शन विनियमित कि अभी भी पूरी तरह समझ नहीं प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक electroporation के लिए और anesthetized एक्स की घ्राण प्रणाली का संवेदी न्यूरॉन्स की axonal प्रक्रियाओं का विवो दृश्य में लागू किया जा सकता है laevis, लेजर confocal स्कैनिंग या multiphoton माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1) का उपयोग. Electroporation फ्लोरोफोरे युग्मित dextrans दर्ज करने के लिए और तेजी से घ्राण अंग की कोशिकाओं के अंदर प्रसार करने के लिए अनुमति देता है. यह वोल्टेज दालों के ट्रिगर के बाद सफल लेबलिंग सत्यापित करने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी लागू करने के लिए उपयोगी है. , Electroporation के मापदंडों के आधार पर जैसे., पिपेट प्रतिरोध, कोशिकाओं (चित्रा 2A, बी) या घ्राण अंग की एकल कक्षों (चित्रा -2) के समूहों चिह्नित कर रहे हैं. लेबल संवेदी न्यूरॉन्स के axons घ्राण तंत्रिका (चित्रा 2 डी) में देखे जा सकते हैं और axonal प्रक्रियाओं सफल electroporation के बाद, घ्राण बल्ब में भी आमतौर पर 24 घंटे देखा जा सकता है(चित्रा 3). संवेदी न्यूरॉन्स के समूहों के electroporation घ्राण बल्ब (चित्रा 3 ए) में मोटे तारों पैटर्न visualizing की अनुमति देता है. सिंगल सेल electroporation के घ्राण बल्ब (चित्रा -3 सी-ई) में केशिकागुच्छीय संरचनाओं के लिए व्यक्तिगत axonal प्रक्षेपण पैटर्न, axonal bifurcations और कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. एक्स के पारदर्शी सूरजमुखी मनुष्य tadpoles विवो confocal या anesthetized टैडपोल की अक्षुण्ण मस्तिष्क में लेबल संवेदी न्यूरॉन्स की multiphoton इमेजिंग में laevis परमिट. एक ही लेबल संवेदी न्यूरॉन (चित्रा 4) के विवो दृश्य में दोहराया द्वारा axonal विकास पैटर्न के विकास के कई दिनों / हफ्तों में लगाया जा सकता है. घ्राण बल्ब में अक्षतंतु पैटर्न काफी भिन्न हो सकते electroporation की समय बिंदु पर संवेदी न्यूरॉन की परिपक्वता पर निर्भर करता है. परिपक्व न्यूरॉन्स पहले से ही गुच्छा कि सुविधा विस्तृत axonal शाखाओं के अधिकारीglomeruli से जुड़े एड क्षेत्रों. परिपक्व न्यूरॉन्स की axonal विकास पैटर्न बल्कि स्थिर है, लेकिन अक्षतंतु शाखाओं और केशिकागुच्छीय Tufts के शोधन के बढ़ाव (चित्रा -4 ए-ई) नमूदार हैं. संवेदी न्यूरॉन्स, विस्तारित समय अवधि के लिए vivo में मनाया जा सकता है जैसे., अब से तीन सप्ताह (चित्रा 4F-आई). दूसरी ओर, अपरिपक्व न्यूरॉन्स के axons गुच्छेदार arborizations पास नहीं है, प्रारंभिक विकास की प्रक्रिया में अब भी कर रहे हैं और अभी तक उनके अंतिम केशिकागुच्छीय लक्ष्य से जुड़ा नहीं है. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, परिपक्वता के दौरान इन न्यूरॉन्स का विकास पर नज़र रखने की अनुमति देता है जैसे., अक्षतंतु बढ़ाव, bifurcations और गुच्छेदार arborizations (चित्रा 4J-एल) की स्थापना. अधिक उदाहरण के लिए भी Hassenklöver और Manzini 12 देखें. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; संवेदनाहृत एक्स की घ्राण अंग की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का चित्रा 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन. (ए) के मुख्य घ्राण उपकला में संवेदी न्यूरॉन्स (मो) या vomeronasal अंग (VNO) laevis लार्वा फ्लोरोसेंट dextran समाधान के साथ भरा एक गिलास पिपेट का उपयोग electroporation के माध्यम से दिया जाता है. लेबल न्यूरॉन्स के axons घ्राण तंत्रिका (पर) के माध्यम से पीछा किया और अंत में घ्राण बल्ब (ओ) तक पहुँचने. (बी) टैडपोल anesthetized है और लेबल न्यूरॉन्स बार बार विशिष्ट समय अंतराल में एक confocal या multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जांच की जा सकता है. (सी) लेबल कोशिकाओं की axonal विकास पैटर्न के वृद्धिशील विकास सप्ताह के दिनों का समय spans से अधिक का पालन किया जा सकता है. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> चित्रा 2. चुनावघ्राण अंग में संवेदी न्यूरॉन्स की troporation. कम प्रतिरोध pipettes के साथ (ए) Electroporation घ्राण अंग में कई कोशिकाओं की लेबलिंग की ओर जाता है. इस प्रतिनिधि उदाहरण में कई घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs, भरे तीर) और दो स्तंभ के आकार का समर्थन कोशिकाओं (अनुसूचित जातियों, तारक) दाग रहे थे. धराशायी लाइनों पिपेट प्रतिरोध बढ़ रही है, लेबल कोशिकाओं की संख्या सीमित करता, घ्राण उपकला (ँ). (बी) electroporation के मापदंडों शोधन, उदा. की सीमाओं हदबंदी. इस उदाहरण में, एक एकल संवेदी न्यूरॉन (भरे तीर) और एक आसन्न समर्थन सेल (तारांकन) electroporation के बाद दाग रहे थे. घ्राण उपकला (खुला तीर) छोड़ने एकल अक्षतंतु ध्यान दें. (सी) सफल एकल कोशिका electroporation के एक व्यक्ति संवेदी न्यूरॉन (भरी नोक) और घ्राण उपकला में अपने जुड़ा अक्षतंतु (खुला तीर) की विशेष लेबलिंग की ओर जाता है. <sटुनिशिया&gt; (डी) एकल लेबल अक्षतंतु (खुला तीर) घ्राण बल्ब में घ्राण तंत्रिका (पर) के माध्यम से पीछा किया जा सकता. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> चित्रा 3. excised घ्राण बल्ब में घ्राण अक्षतंतु अनुमानों Visualizing. (ए) घ्राण बल्ब में संवेदी न्यूरॉन्स की axonal अनुमानों के मोटे टोपोलॉजी कम प्रतिरोध electroporation के pipettes का उपयोग कर देखे जा सकते हैं. एक घ्राण बल्ब गोलार्द्ध और उसके संबंधित घ्राण तंत्रिका (पर) चित्रित कर रहे हैं. विभिन्न fluorophores के लिए युग्मित चार dextrans घ्राण अंग के चार दूरस्थ स्थानों पर electroporated गया: पार्श्व (हरा), मध्यवर्ती (पीला), मो (लाल) और VNO (नारंगी) औसत दर्जे का. यह गौण घ्राण बल्ब (एओबी) और मुख्य घ्राण बल्ब (भीड़) के तीन मुख्य प्रक्षेपण क्षेत्रों visualizing की अनुमति देता है. <strओंग&gt; (बी) घ्राण बल्ब की संरचना पर आरोपित एकल घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के विभिन्न axonal विकास पैटर्न. चित्रित अलग लार्वा नमूनों से व्युत्पन्न कई एकल कक्ष stainings के तीन आयामी पुनर्निर्माण संयुक्त रहे हैं. घ्राण बल्ब में पेश और गोलाकार ग्लोमेरुली (भरे तीर) में गुच्छेदार arborizations / synapses के गठन एकल घ्राण axons की (सीई) उदाहरण. एक्स में ध्यान दें कि घ्राण एक्सोन (भरे तीर, भी Hassenklöver और Manzini 12 देखें) एक, दो या कई ग्लोमेरुली को जोड़ने से पहले नियमित रूप से (खुला तीर) bifurcate laevis. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> एकल घ्राण न्यूरॉन axons की विवो समय चूक इमेजिंग में चित्रा 4. (एई)सफल एकल कक्ष electroporation के बाद लेबल अक्षतंतु बार बार घ्राण बल्ब (ओ) में देखे जा सकते हैं. इस उदाहरण से एक सप्ताह के लिए जांच की गई कि एक व्यक्ति अक्षतंतु से पता चलता है. समग्र आकृति विज्ञान में काफी परिवर्तन नहीं करता है और दो प्रमुख शाखाओं में बंटी अंक (खुला तीर) की पहचान की जा सकती है. अन्य दो केशिकागुच्छीय Tufts स्थिर (तारों) बने हुए हैं, जबकि समय के पाठ्यक्रम पर, एक केशिकागुच्छीय गुच्छा, निरंतर कमी (भरी नोक) आए कि ध्यान दें. (एफआई) इस प्रतिनिधि उदाहरण लंबी अवधि टिप्पणियों की व्यवहार्यता को दर्शाता है जो इस विशिष्ट अक्षतंतु जांच की गई के रूप में अधिक से अधिक तीन सप्ताह के लिए. इसके विकास के पैटर्न का कोई स्पष्ट परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है. (जीएल) विकास की प्रक्रिया में एक अपरिपक्व संवेदी अक्षतंतु का एक उदाहरण दिखाया गया है. यह अभी तक glomeruli करने और विशेषता केशिकागुच्छीय Tufts याद कर रहे हैं जुड़ा हुआ नहीं किया गया है. Axonal शाखाओं लम्बी रहे 5 दिनों के बाद, अक्षतंतु कई बार और ठीक arborizations हैं बंटवाराकी स्थापना की.

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

एक मॉडल के रूप घ्राण प्रणाली axonal विकास पैटर्न और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए<em&gt; Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

एक<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</emAmylopathy अध्ययन के लिए&gt; मॉडल प्रणाली

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