Name: detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Etik erklæring: De-identificerede humane væv og plasmaprøver blev opnået fra Hendrick Medical Center under en Institutional Review Board godkendte protokol. 1. Tilsætning af biotinyleret antistof BEMÆRK: Overvågning af dette trin er valgfrit. Se alternativ protokol, hvis ikke overvågning. <ol><li> Opnå kommercielt tilgængelige avidin afledte coatede plader (se Materialer og udstyr Table). </li><li> Tilsættes 50 pi phosphatpufret saltvand (PBS) pH 7,2 til brønde. BEMÆRK: præinkubere PBS ved 28 ° C for at minimere temperatur relateret resonans skift. </li><li> Open bioassay scanner software og følg installationsguiden for at definere den eksperimentelle procedure, som udvælgelse af råemner, standarder og prøver i pladen layout, temperaturindstilling (28 ° C), antal scanninger pr min (1), og længden af ​​eksperimentet ( 150 min rumme præparative trin). </li&gt; <li> Sæt forberedt assaypladen i etiketten fri bioassay scanner og starte den første scanning. Når den første scanning er færdig, skal du vælge &quot;self reference til start&quot;. Baseline er det første sæt af scanninger indsamlet ved starten af ​​forsøget. Hvis dette er den første læsning udføres på dette specifikke plade, kan scanneren køre at ækvilibrere temperaturen og eliminere drift i baseline. Se figur 2 for et skærmbillede af en basislinje efterfulgt af prøvetilsætning. </li><li> Efter baseline har stabiliseret sig, eller mindst 5 scanninger, pause læse- og skubbe pladen. </li><li> Fjern PBS ved dumpning i vasken og tilsættes 50 pi RL21A biotinyleret antistof ved [10 ug / ml i PBS pH 7,2] for alle, men kontrol brønde på pladen. Tilføj 50 pi PBS til kontrolbrøndene. </li><li> Sæt pladen tilbage i bioassay scanner og genoptage læsningen, indtil mætning er nået, ca. 1,5 timer. </li><li> Pause læse- og skubbe pladen. </li><li> Vask<html> plade 3 gange med 200 pi / brønd phosphatbufret saltvand + 0,05% Tween 20 (PBST) efterfulgt af 3 skylninger med 200 pi / brønd PBS pH 7,2. Gentag med PBS. Tryk overskydende PBS fra plade på papirservietter forud for at flytte til næste trin. BEMÆRK: Dette trin kan udføres på en automatisk pladevasker eller vaske pladen 3 gange med 200 pi PBST ved dumpning væske i en vask og erstatte PBST med en pipette. </li><li> Der tilsættes 50 pi PBS pH 7,2 til alle aktive brønde. </li><li> Sæt pladen tilbage i bioassay scanner og genoptage læsningen at overvåge efter vask resonans. </li><li> Stop læse og skubbe pladen. </li></ol> Alternativ protokol for Trin 1: <ol start="13"><li> Der tilsættes 50 pi RL21A biotinyleret antistof ved [10 ug / ml PBS] til alle brønde. </li><li> Inkuber ved stuetemperatur i 1,5 timer eller natten over ved 4 ° C. </li><li> Vask pladen 3 gange med 200 pi / brønd PBST efterfulgt af 3 skylninger med 200 pi / brønd PBS som i trin 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Tilsætning af analyt <ol><li> Fjern PBS og tilsættes 50 pi per brønd af passende assay buffer. Til dette assay blev kommercielt tilgængelige normalt humant serum anvendes fortyndet 1:20 i PBS. </li><li> Open bioassay scanner software og følg installationsguiden for at definere eksperimentelle procedure. </li><li> Sæt pladen i bioassay scanner og begynde en baseline læse. Hvis dette er den første læsning udført på dette specifikke plade, lad scanneren køre i ligevægt temperatur og fjerne afdrift i baseline. </li><li> Efter baseline har stabiliseret sig, eller mindst 5 scanninger, pause læse- og skubbe pladen. </li><li> Fjern assaypuffer fra brøndene. </li><li> Spike kontrol med HLA A * 02, 01 monomer bærer relevant (FLSL) eller irrelevante (SLLV, YLEV eller KVL) peptider i koncentrationer fra [,625-10 pg / ml] i assaypuffer. Tilføj 50 pi standarder til kontrol- pladens huller </li><li> Der tilsættes 50 pi analyt i assaypuffer til prøvenbrønde af pladen. For dette assay tilsat kommercielt tilgængelig human serum blev anvendt. </li><li> Sæt pladen tilbage i bioassay scanner og genoptage læsningen, indtil mætning er nået, ca. 30-60 min. </li><li> Pause læse- og skubbe pladen. </li><li> Vask pladen 3 gange med 200 pi / brønd PBST efterfulgt af 3 skylninger med 200 pi / brønd PBS som i trin 1.9. </li><li> Der tilsættes 50 pi assaypuffer til alle aktive brønde. </li><li> Sæt pladen tilbage i bioassay scanner og genoptage læsningen at overvåge efter vask resonans. </li><li> Stop læse og skubbe pladen. BEMÆRK: assaypuffer kan være PBS, Vævskulturmedier eller humant serum fortyndet 1:20 i PBS afhængigt af målet for assayet. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Analyser ved hjælp af bioassay scanner software eller eksport rå datafiler til foretrukne statistisk analyse software. Bioassayet scanner softwaren automatisk genererer den bindende kurve baseret påplade layout tilvejebragt under forsøgsopstilling. BEMÆRK: Hvis du ikke bruger bioassay scanner software til analyse, følg trin 3,2-3,4. </li><li> Fratræk baseline og negative kontrol fra hver efterfølgende datapunkt. </li><li> Beregn middelværdi og standardafvigelse for replikate brønde ved hvert tidspunkt. </li><li> Generer en graf over den bindende kurve eller vælge Afslut punktdata for søjlediagrammer. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Forfatterne, Debra Wawro Weidanz og Robert Magnusson, er henholdsvis administrerende direktør og Chief Technology Officer hos Resonant Sensorer Incorporated, som producerer de bioassay pladelæser og assayplader anvendes i denne artikel.

Den heri beskrevne fremgangsmåde introducerer en biomarkør screening for kræftdiagnostik, der ville muliggøre hurtig påvisning af opløselige peptid / HLA-komplekser i patientens serum, plasma, urin eller spytprøver i et højt gennemløb 96- eller 384-brønds format. Dette assay, der anvender T-celle-receptor efterligner monoklonale antistoffer og et mærke-frit detection system skærer analyse tid til mindre end 1 time i forhold til 3,5 timer ved konventionel ELISA. Denne high-throughput fremgangsmåde muliggør hurtig lagdeling af patienter til kliniske forsøg til terapeutiske cancervacciner eller biopharmaceuticals. Aktuelle metoder til påvisning af disse sygdomstargets kræver affinitetsoprensning og HPLC-MS / MS af individuelle patientprøver, en besværlig og tidskrævende proces. Selv om denne metode er modtagelig for konventionelle ELISA-metoder, der er bekymring for, at sekundære påvisningsreagenser såsom anti-β2 mikroglobulin antistof kunne ændre strukturen af ​​spirende HLEt molekyle og inhiberer binding til TCRm begrænsende detektion. Label-fri afsløring lindrer disse bekymringer. Denne procedure kan modificeres til anvendelse på andre label-fri systemer, såsom en overfladeplasmonresonans system. Dette ville imidlertid i høj grad reducere de højere throughput kapacitet i forhold til den biologiske system, der anvendes i denne undersøgelse. Denne protokol kan effektivt modificeret til detektering af ikke-HLA biomarkører i patientens serum og plasma med overholdelse et par kritiske trin. Overvågning af den oprindelige antistof coating proces anbefales til optimering af overfladen, som &lt;200 pm skift sandsynligvis vil resultere i lavt signal til det efterfølgende trin detektion. Baseline og post-vask læser er anvendelige til endepunktsanalyse som overflod af serumproteiner kan maskere binding af lav analytkoncentrationen. Endelig kan temperaturvariation af prøver resultere i brønd til brønd variation. Det anbefales, at alle prøver præinkuberes end etiketten fri biosassay enhed temperaturregulator sættes ved 2-3 ° C over stuetemperatur. Bør tillades Køle- prøver tid nok til at nå driftstemperaturen. Fremtidige ændringer af denne protokol vil omfatte multiplexing af TCRm på pladens overflade. Bioassayet for øjeblikket er modtagelig for spotting af brønde ved en densitet på mindst 8-plex. Ved at indføre 4-8 TCRm til hver brønd, pr prøvevolumener test reduceres og muliggøre indsamling af stadig mere komplekse data per patient. Denne evne kan yderligere oplyse patienterne med hensyn til behandlingsmuligheder.

Klasse I humant leukocyt antigen (HLA) prøver peptider af 8-11 aminosyrer i længde afledt fra proteasomalaktivitet nedbrydning af det intracellulære protein repertoire og præsenterer disse peptider på overfladen af hver celle med kerne 1,2. HLA-kompleks er &quot;naturens biomarkør&quot;, der indikerer sundhed hver celle (figur 1) til cirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Anerkendelse af sygdom forbundet peptider resulterer i fjernelse af de ulovlige celle ved CTL. Således reaktion adaptive immunrespons er meget effektiv til at fjerne viral infektion og tumor. Men immunsystemet udøver pres, der ofte fremmer selektion for vira eller tumor, der kan unddrage sig en effektiv CTL respons. T-celle-receptor efterligner (TCRm) monoklonale antistoffer (mAb&#39;er), der genkender specifikke peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser, såsom dem afledt af brystkræft associerede proteiner, makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF19-27) 3 og NY-ESO-1 157-165, muliggøre påvisning og destruktion af brystkræftceller i fravær af en effektiv anti-tumor CTL respons 4,5. Dette repræsenterer arbejde er fokuseret på HLA-A * 0201-molekylet, som udtrykkes med op til 30% af befolkningen. Men identifikation af andre relevante HLA / peptidkomplekser, efterfulgt af produktionen af ​​TCRm muliggør udvikling af målrettede immunterapier og følgesvend sygdomsdiagnostik, udvide anvendeligheden af ​​dette arbejde til en meget bredere befolkning. En del af peptid / HLA-komplekser på vej til celleoverfladen frigives i plasmaet. På grund af den meget komplekse karakter af peptid / HLA pools, aktuelle metoder til minedrift immunopeptidome for HLA associerede biomarkører er tidskrævende. Denne proces kræver affinitetsoprensning af opløseligt HLA fra plasma, adskillelse af HLA associerede peptider ved revers fase højtryksvæskekromatografi(RP-HPLC) og peptid-sekventering ved tandem massespektrometri (MS / MS) 6,7. Selv om denne proces er en farbar vej for opdagelsen af nye terapeutiske mål, er det en besværlig proces som en følgesvend diagnostisk værktøj til HLA tilknyttede mål, der allerede i det terapeutiske vaccine eller biofarmaceutisk rørledning 8-10. TCRm rettet mod disse mål give værktøjer til hurtig følgesvend diagnostisk udvikling har til formål at stratificere patienterne i relevante kliniske forsøg og give mere informerede behandlingsmuligheder. I dette arbejde, er et gennembrud biomarkør screening for kræftdiagnostik præsenteret som anvender TCRm og en etiket-fri bioassay, der overvåger de biologiske interaktioner med minimale procestrin. Etiketten fri bioassay er baseret på en metode, der udnytter styret tilstand resonans (GMR), der opstår i dielektriske bølgeleder riste 11-14. Når bredbånd lys kontakter diffraktiverivning i pladerne er nødvendige for dette system er to specifikke bølgelængder reflekteres. Den bindende vekselvirkning mellem et immobiliseret receptor og dens ligand overvåges i realtid ved at spore resonansen bølgelængdeforskydningen med en spektrumanalysator 12. Separate resonanstoppe forekomme hændelse TE (elektrisk vektor normal til planet for forekomst) og TM (magnetisk vektor vinkelret på planet af forekomst) polarisationstilstandene leverer flere datapunkter, der potentielt kan forøge påvisning nøjagtighed 11,14. Anvendelse af antistof pre-sensibiliserede plader i denne etiket-fri assaysystem assayet driftstid med dataanalyse er ca. 45 min. Desuden kan flere patientprøver forespørges i en 96- eller 384-brønds format, en klar fordel i forhold til en HPLC-MS / MS baseret format.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Ifølge den amerikanske Cancer Society, vil mere end 200.000 kvinder blive diagnosticeret med invasiv brystkræft hvert år, og ca. 40.000 vil dø af sygdommen. Den humane leukocyt antigen (HLA) Klasse I prøver peptider afledt fra proteasomalaktivitet nedbrydning af cellulære proteiner og præsenterer disse fragmenter på celleoverfladen for forespørgsel fra cirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Dannelse af T-celle-receptor efterligner (TCRm) monoklonale antistoffer (mAb&#39;er), der genkender brystcancer specifikt peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser, såsom dem, der stammer fra makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF 19-27) og NY-ESO- 1 157-165 muliggøre påvisning og destruktion af brystkræftceller i fravær af en effektiv anti-tumor CTL respons. Intakte klasse I HLA / peptid-komplekser udgydt af brystcancerceller og udgør potentielt relevante kræft biomarkører. I dette arbejde, et gennembrud biomarkør screening for kræft diagnoses inkorporere T-celle receptor efterligner monoklonale antistoffer kombineret med en roman, label-fri biosensor udnytte guidet tilstand resonans (GMR) sensorteknologi præsenteres. Påvisning af skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, tilsat humant serum og patientens plasma påvises. Virkningen af ​​dette arbejde kan revolutionere personlig medicin gennem udvikling af companion sygdomsdiagnostik for målrettede immunterapier.

Et repræsentativt sæt eksperimenter blev udført ved anvendelse af velkarakteriserede TCRm, RL21A, et murint IgG2a monoklonalt antistof, som specifikt genkender et peptid (MIF 19-27 eller FLSL) inden for rammerne af HLA-A * 02: 01 molekyle 3. Det beslægtede peptid / HLA monomer, samt irrelevant HLA monomer 15, blev anvendt til at demonstrere den beskrevne procedure. Figur 3 illustrerer assayformat. RL21A er specifikt for FLSL / HLA monomer med lille krydsreaktivitet med andre peptid / HLA-komplekser 3. Denne specificitet er sammenfattet ved hjælp af etiketten uden bioassay (figur 4). Følsomheden af etiketten fri bioassay for dette eksperiment er i det lave nanomolære område som bestemt ved titrering af RL21A antistof på immobiliseret FLSL / HLA monomer (figur 5). Selvom baggrund signal er signifikant forøget i serumprøver, sÆRLIGE detektering af FLSL / HLA monomer i spidse human serum opnås i figur 6 og en koncentrationsgradient er let mærkbar i disse prøver. Endelig supernatanter fra MDA-MB-231-cellelinien, tidligere vist at præsentere FLSL / HLA-A * 02: 01-molekyle, er vist at indeholde opløseligt FLSL monomer ved hjælp af denne etiket fri assay platform (figur 7). Efterfølgende tilsætning af FLSL / HLA monomer forøger signalet på RL21A (figur 7). På grund af følsomheden af systemet, brønd til brønd variation, herunder negative resonans forskydninger kan opstå som følge af temperatursvingninger som ses som en funktion af de standardafvigelser i figur 4 og 5. Disse variationer kan reduceres dramatisk ved præinkubation af alle prøver og bioassayet pladelæser ved en temperatur i lille overskud af stuetemperatur (dvs. 28 ° C). I figur 8, kortvarigt, 96brønds polystyrenplader blev coatet med [10 ug / ml] i RL21A i 2 timer ved stuetemperatur, vasket med PBST, blokeret med 0,5% fedtfattig mælk, vasket med PBST og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med seriefortyndinger af FLSL HLA monomer i normal human serum fortyndet 1:10 i PBS for at generere en standardkurve eller patient plasma fortyndet 1:10 i PBS. Pladen blev vasket med PBST, inkuberet 1 time ved stuetemperatur med kanin-anti-humant β2 mikroglobulin [1: 5000] til påvisning af intakt HLA og vasket i PBST. Pladerne blev derefter inkuberet i 30 minutter med gede-anti-kanin IgG [1: 10.000] og vasket med PBST. Kolorimetrisk påvisning blev udført ved anvendelse af ABTS (2,2&#39;-azinobis [3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre] -diammonium salt) substrat med en 15 min inkubationstid og observeres ved 405 nm på en mikropladelæser. FLSL / HLA blev påvist i tre patientprøver. I figur 8B blev patientplasma RL.064 fortyndet 1:20 i PBS og derefter tilføjeed til pladen og overvåges på etiketten uden detektor til 60 min. Specifik påvisning af FLSL / HLA kompleks i patient serum blev gennemført. Student t-test blev udført under anvendelse plotning og statistik software (p &lt;0,05). I figur 8C blev vævssnit farvet med 1 ug / ml med muse-anti-HLA-A2 (BB7.2) som en positiv kontrol, RL21A, IgG2b og IgG2a henholdsvis som negative kontroller. Farvning blev detekteret ved anvendelse af et anti-muse-detektion kit, DAB (diaminobenzadin) og hematoxylin- QS for nuklear farvning som anvist af fabrikanten. Farvning af tumorvæv ved RL21A bekræfter præsentation af FLSL / HLA-komplekser. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figur 1:. Tumorantigenet præsentation af klasse I human leukocyt antigen Kræft transformation er en intracellulær lidelse. HLA prøve intracellular proteiner og afsløre cancer-relaterede ændringer på celleoverfladen. CTL og TCRm er i stand til at genkende cancerceller gennem HLA-peptid-komplekser særskilte til disse celler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figur 2:. Skærmbillede af datafangst i bioassay scanner software Eksempel på dataopsamling viser den indledende baseline scanning efterfulgt af RL21A antistof ud over en plade med 10 ug / ml FLSL / HLA-kompleks. Koncentrationerne af antistof er som angivet. Hver linje repræsenterer en individuel brønd overvåges over tid. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figur 3:. Assayformat Illustration af antistoffer immobiliseret på den diffraktive gitteroverfladen af assaypladen opfange relvante peptid / HLA-komplekser i opløsning. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figur 4: egenart RL21A for FLSL / HLA kompleks Demonstration af specificiteten af biotinyleret RL21A TCRm for sin relevant (FLSL) HLA monomer i forhold til irrelevant HLA monomer (YLEV, SLLV, og KVL).. Biotinyleret RL21A TCRm [10 ug / ml] blev immobiliseret på avidin coated assay pladens overflade, og detektion blev udført under anvendelse af umærket relevant eller irrelevant HLA monomer [10 ug / ml] i PBS. RL21A var specifik for FLSL / HLA Complex. To-vejs ANOVA blev udført under anvendelse plotning og statistik software (p &lt;0,001). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figur 5:. Binding følsomhed RL21A til dets kognate peptid / HLA-kompleks Illustration af Detectipå grænsen og bindende følsomhed RL21A til FLSL / HLA-kompleks. Biotinyleret HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] blev immobiliseret på assaypladen overflade og umærket RL21A blev tilsat til pladen i seriefortyndinger i PBS som angivet. Detection for dette system var i den lave nanomolære område. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figur 6: Påvisning af HLA-komplekser i Spiked Humant serum Demonstration af påvisning af HLA i humant serum.. Biotinyleret RL21A TCRm [10 ug / ml] blev immobiliseret på avidin coatede assaypladen overflade. Pooled normal human serum tilsat relevant (FLSL) eller irrelevant (SLLV) HLA monomer blev fortyndet 1:20 i PBS og derefter tilsat til pladen og overvåges på etiketten uden detektor til 60 min. Specifik påvisning af FLSL / HLA-kompleks i human serum blev opnået. Generelt baggrund signal (irrelevant SLLV monomer) er højare fortyndede serumprøver forhold til oprensede analytter i PBS (se figur 4). To-vejs ANOVA blev udført under anvendelse plotning og statistik software (p &lt;0,0001). <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figur 7:. Opløselige HLA-komplekser blev påvist i brystkræft cellekultursupernatanter Evnen til at påvise HLA i brystkræft cellesupernatanter demonstreres. Biotinyleret RL21A TCRm, RL9A TCRm (negativ kontrol) og en isotype kontrol blev immobiliseret på assaypladen overflade. Spiked [5 ug / ml] og uden tilsætning MDA-231 cellekultursupernatanter tilsat og binding blev overvåget i 60 min på etiketten uden detektor. FLSL og SLLV HLA monomer spiked prøver repræsenterer positive kontroller for RL9A og RL21A binding. One-way ANOVA blev udført under anvendelse plotning og statistik software (p &lt;0,0001). Figur 8:. Specifik påvisning af FLSL / HLA-komplekser i patientprøver (A) En traditionel enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) blev anvendt til at detektere FLSL / HLA specifikke komplekser i patientens plasma. (B) Biotinylated RL21A TCRm eller IgG2a [10 ug / ml] blev immobiliseret på avidin assayplade. (C) Breast tumorvæv fra patient RL.064 blev farvet som tidligere beskrevet 3 for at kontrollere tumor præsentation af FLSL / HLA-komplekser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større udgave af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intakte klasse I HLA / peptid-komplekser udgydt af kræftceller, der repræsenterer en potentiel relevant cancer biomarkør. Ved hjælp label-free sensor teknologi og T-celle-receptor efterligner monoklonale antistoffer, påvisning af skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, tilsat humant serum og patientens plasma påvises, muliggør udvikling af en ny cancer diagnostisk platform.

Påvisning af humant leukocyt antigen Biomarkører i Breast Cancer hjælp Label-fri biosensorteknologi

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Påvisning af Invasiv pulmonal aspergillose hos maligne hæmatologiske lidelser patienter ved hjælp af lateral strømning og Teknologi

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigen-præsenterende celler (KaAPC) til effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Udtømning af humane antigen-specifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Udnytte den Antigen capsidet-Indbygning strategi for udvikling af adenovirusserotype 5-vektoriserede Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital mikroskopi af leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt Interaktioner i mesenteriale Veins i mus

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generering<em&gt; De Novo</em&gt; Antigenspecifikke humane T-celle receptorer ved retroviral transduktion af Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive påvisning af biomarkører ved hjælp af en molekylær prægning baseret kapacitiv Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Et Protein Microarray analyse for serologisk bestemmelse af Antigen-specifikke antistof reaktioner følgende Clostridium difficile infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...