Name: high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

Примечание: Этот протокол может быть использован для различных приложений, таких как количественного фагоцитоза и полимеризации актина, используемый в нашей ранее опубликованной работе 12. Протокол поддается различных модификаций и типов В таблице 1 приведены клеточны?...

<ol>
	<li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology. , (2012).</li><li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components.">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

Основные ограничения флуорометрического техники являются экспериментальными дисперсия, а также потеря клеток, связанная с тщательной промывки и использования не прилипшие клетки. Разница наблюдается в основном за счет изменения флуоресцентных частиц, как взвешивани...

Количественное определение флуоресцентного сигнала широко используются во множестве научных методов, начиная от ПЦР, проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и FRET анализ ELISA для мультиплексирования. Флуоресценции изображений и количественное имеет широкое применение и могут быть отличным инструментом для количественного анализа различных клеточных процессов. Использование флуоресцентных маркеров и их сигнал был революцию в последнее десятилетие, и появление люминесцентных читателей плит способствовало высокой пропускной количественного флуоресценции, испускаемого при клеточных процессов. Флуорометрический анализ может служить отличным инструментом в количественной фагоцитоза. Фагоцитоз был изучен с момента открытия фагоцитов по Мечников в 1800 1. На протяжении многих лет, различные методы были использованы для изучения этого важного процесса важное значение для иммунной защиты против вторжения бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных патогенов 2-5, Предыдущие методы количественного используется микроскопии и стереологических методов для того, чтобы визуализировать клетки, которые phagocytosing, которые затем были количественно путем подсчета интернализованных частиц (вручную или с использованием программного обеспечения) 6-8. Некоторые недостатки использования микроскопа сами по себе для количественного анализа является то, что ручного подсчета бактерий является трудоемким и более склонны к предвзятости наблюдателя. Другой метод, используемый в количественного фагоцитоза является микробиологическое методика обшивки бактерий из клеточных лизатов (следующих фагоцитоза) на бактериальной культуры пластин, но этот метод может не учитывать бактерицидных механизмов и наличием частично интернализированных бактерий. Этот метод еще более трудоемким по сравнению с микроскопией и занимает несколько дней, чтобы анализировать. Проточной цитометрии, кажется, самый быстрый, самый эффективный способ количественного фагоцитоза и была использована многими группами 9-11, но высокая стоимость обычно ассоциируется с инструмент, необходимые для их анализа делает наиболее дорогой метод по сравнению с ранее упомянутых анализов. Флуорометрический метод хорошей альтернативой проточной цитометрии для анализа интернализации частиц, так как он предлагает объективную количественную оценку флуоресценции с использованием оборудования, которое не так препятствующая стоимость. Другие дополнительные преимущества флуорометрии являются высокая эффективность и высокие возможности пропускную способность для количественной оценки флуоресценции мечеными интернализованных частиц. Преимущества флуорометрии могут быть экстраполированы на количественной оценки других, чем фагоцитоза процессов. Например, флуорометрического анализа могут быть применены для изучения любой процесс, приводящий к изменениям в экспрессии внутриклеточной или мембраносвязанных рецепторов, изменений в клеточной проницаемости / жизнеспособности, трансфекции эффективности и модуляции в полимеризации актина. Один недостаток флуорометрического техники является то, что, в зависимости от меток, используемых, может быть высокойэксперимента к эксперименту изменчивость, которая, как правило, могут быть решены путем демонстрации данных через относительные количественного, таких как изменение раза или увеличения от контроля процентов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

Цель флуорометрического анализа, чтобы служить в качестве эффективного, экономически эффективным, высокой метода пропускной анализа фагоцитоз и другие клеточные процессы. Этот метод может быть использован на различных типах клеток, как адгезивные и не адгезивные, чтобы изучить различные клеточные свойства. При изучении фагоцитоза, флюорометрический техника использует фагоцитарных типов клеток, таких как макрофаги и флуоресцентно меченых частиц, опсонизированных флуоресценции может быть погашен в присутствии трипанового синего. После обшивки адгезивных макрофагов в 96-луночных планшетах, флуоресцентных частиц (зеленый или красный) и вводят клетки позволили фагоцитируют для различных количеств времени. После интернализации люминесцентных частиц, клетки промывают трипановым синим, что облегчает исчезновение флуоресцентного сигнала от бактерий, которые не интернализированных, или просто прилипших к поверхности клетки. После промывки трипанового, клетки промывают PBS с фиксированной,й окрашивали DAPI (ядерная Blue Label люминесцентные), который служит для обозначения ядра клеток. Простым флуорометрического количественного через пластины чтения ядерной (синий) или частицы (красный / зеленый) флуоресценции можно рассмотреть соотношение количества относительных флуоресценции единиц зеленый: синий и определить фагоцитарную индекс, указывающий на количество люминесцентных бактерий интернализованных на ячейку. Продолжительность анализа с использованием 96-луночного метод и многоканальные пипетки для стирки, от конца до конца фагоцитоза сбора данных, меньше, чем 45 мин. Проточная цитометрия может быть использован таким же образом, но преимущество флуорометрии является его высокая пропускная способность, быстрый метод оценки с минимальным манипуляции образцов и быстрого количественного определения интенсивности флуоресценции на клетку. Аналогичные стратегии могут быть применены к не прилипшие клетки, живые меченых бактерий, полимеризации актина и, по существу любой процесс с использованием флуоресценции. Таким образом, флюометрия является перспективным методом его низкой стоимости, высокой throughpут возможности в изучении клеточных процессов.

Два основных способа количественного фагоцитоз и последующее полимеризацию актина посредством использования этого протокола состоит в наблюдении непрерывного или синхронизированный фагоцитоз. Микроскопический анализ (рис 1B) иллюстрирует флуоресцентные из...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Оценки воздействия наркотиков на основе антител на мышиных костного мозга и перитонеальных макрофагов активации

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Высокая пропускная способность в Vitro оценки задержки вспять агентов на ВИЧ транскрипции и сращивания

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...