Name: electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비 <ol><li> 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오. </li><li> 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요. </li><l...

<ol>
	<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome.">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-mediated+degradation+of+IRP2:+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity.">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li><li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements.">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li><li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+iron+regulatory+protein-1+(IRP1)+by+oxidative+stress.">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li><li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+iron+metabolism.">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li><li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA.">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li><li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-responsive+elements:+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation.">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li><li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA.">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li><li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements.">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li><li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1,+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation.">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li><li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter.">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li><li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency.">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li><li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+and+the+cell+cycle:+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3'-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy.">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li><li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA.">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron.">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li><li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein,+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch.">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein(s)+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages.">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li><li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction.">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li><li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis.">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li><li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis.">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li><li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload:+from+pathophysiology+to+clinical+practice.">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li><li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+(IRP)-1+and+-2+genes.">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li><li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-/-+mice:+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels.">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530 (2014).</li><li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy.">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li><li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+RNA-protein+interactions.">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li></ol>

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생...

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 &quot;젤 지연&quot;또는 &quot;bandshift&quot;쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다. EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 &lt;/ SUP&gt;. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃). RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( &quot;supershift&quot;) 7. EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된 <em&gt; α (HIF2α) (18), 및 기타의 mRNA 19-21. UTR &#39;TfR1의 mRNA는 3에서 여러 IRES를 포함하는 동안, UTR&#39;프로토 타입 H-와 L-페리틴의 mRNA는 5 일 IRE가 포함되어 있습니다. IRE / IRP의 상호 작용은 특히 입체 43S 리보솜 서브 유닛의의 연결을 차단하여 페리틴 mRNA의 번역을 억제; 또한, 그들은 endonucleolytic 분열에 대한 TfR1 mRNA의 안정화. IRP1과 IRP2 공유 광범위한 서열의 유사성과 철에 굶주린 세포에서 높은 IRE 결합 활성을 나타낸다. IRP2은 프로 테오 열화를 겪는 동안 철 구비 세포에서, IRP1는 그것 IRE 결합능 희생 aconitase 세포질로 변환 쿠반의 Fe-S 클러스터를 조립한다. 따라서, IRE / IRP 상호 작용은 세포 철 상태에 의존 할뿐만 아니라, H 2 O 2, 산화 질소 (NO) 또는 저산소증과 같은 다른 신호들에 의해 조절된다. 여기서는 E에 의해 조 세포 및 조직 추출물에서 IRE - 결합 활성을 평가하기위한 프로토콜을 묘사MSA. 우리는 IRE 서열은 원래 의해 하류 T7 RNA 중합 효소 사이트의 센스 방향에 도입 된 플라스미드 DNA 템플릿 (I-12.CAT)로부터 시험 관내 전사에 의해 생성 된 32 P - 표지 H-페리틴 IRE 프로브를 사용 어닐링 합성 올리고 뉴클레오티드 (22)의 복제.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="430">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:195px;">Name of the Materials&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">leupeptin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2884</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PMSF</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td align="right">78830</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BioRad Protein Assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15518-012</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UTP [alpha-32P]</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>NEG507H</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation liquid</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">141349</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">heparin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0777</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase T1</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Equipments&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue Ruptor</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">9001271</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean II xi Cell&#160;&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1834</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">20 wells combs 1.5mm thick</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1868</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mm spacers</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1849</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerPac</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>164-5070</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 &quot;겔 위상차&quot;또는 &quot;bandshift&quot;분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5&#39;-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 &#39;이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다. 활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW...

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Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Cryopreserved 샘플 복구를 위해 손수 함 장치 실수로 극저온 저장 탱크 떨어졌고

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

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애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...