Name: electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Os procedimentos experimentais com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da McGill University (protocolo 4966). 1. Preparação de extratos de proteínas a partir de células cultivadas <ol><li> Lavar as células cultivadas duas vezes com 10 ml de fosfato de gelo-solução salina tamponada (PBS). </li><li> Raspe células aderentes quer com um polícia de borracha ou um raspador de células de plástico em 1 ml de suspensão de PBS, arrefecido com gelo transferência p...

<ol>
	<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome.">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-mediated+degradation+of+IRP2:+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity.">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li><li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements.">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li><li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+iron+regulatory+protein-1+(IRP1)+by+oxidative+stress.">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li><li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+iron+metabolism.">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li><li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA.">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li><li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-responsive+elements:+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation.">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li><li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA.">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li><li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements.">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li><li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1,+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation.">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA.">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron.">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li><li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein,+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch.">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein(s)+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages.">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li><li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction.">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li><li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis.">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li><li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis.">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li><li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload:+from+pathophysiology+to+clinical+practice.">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li><li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+(IRP)-1+and+-2+genes.">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li><li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-/-+mice:+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels.">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530 (2014).</li><li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy.">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li><li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+RNA-protein+interactions.">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li></ol>

Herein, we describe a protocol that has been developed to study the IRE-binding activities of IRP1 and IRP2, and we show representative data. By using different probes, this protocol can also be adjusted for the study of other RNA-binding proteins. A critical step is the size of the probe. Usage of long probes, which is common when the exact binding site is unknown, can result in RNA/protein complexes that do not migrate differently than the free RNA. In this case, it is advisable to remove unbound RNA by treatment with ...

A EMSA foi originalmente desenvolvido para o estudo da associação de proteínas de ligação de DNA com sequências de ADN alvo 1,2. O princípio é semelhante para as interacções de ARN / proteína 3, o que é o foco deste artigo. Resumidamente, o ARN é negativamente carregado e irá migrar em direcção ao ânodo durante a electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (ou géis de agarose). A migração dentro do gel depende do tamanho do ARN, que é proporcional à sua carga. De ligação específica de uma proteína de ARN altera a sua mobilidade, e as complexo migra mais lenta em comparação com o ARN livre. Isto é devido principalmente a um aumento na massa molecular, mas também às alterações na carga e, eventualmente, conformação. Utilizando um RNA rotulado como sonda permite fácil monitoramento do &quot;atraso gel&quot; ou &quot;bandshift&quot;. Uso de 32 sondas de ARN marcadas com P é muito comum e oferece uma elevada sensibilidade. A migração de RNA / complexos de proteínas e RNA livre são detectadospor autorradiografia. Inconvenientes são o meia-vida curta de 32 P (14,29 dias), a deterioração gradual da qualidade da sonda devido a radiólise, a exigência de uma licença de radioatividade e infra-estrutura para o trabalho de radioatividade, e potenciais preocupações de biossegurança. Portanto, foram desenvolvidos métodos alternativos não isotópicas para etiquetar a sonda de RNA, por exemplo, com fluoróforos ou biotina, que permitem a detecção por imagem fluorescente ou quimioluminescente 4,5. As limitações destes métodos são o custo mais elevado e frequentemente sensibilidade reduzida em comparação com a marcação isotópica, e o potencial de marcadores não isotópicos para interferir com a interacção de ARN / proteína. Géis de poliacrilamida não desnaturantes são adequados para a maioria das aplicações de EMSA e são normalmente utilizados. Na ocasião, géis de agarose pode representar uma alternativa para a análise de grandes complexos. A principal vantagem de EMSA é que ele combina simplicidade, sensibilidade e robustez 4 &lt;/ Sup&gt;. O ensaio pode ser concluída dentro de algumas horas e não requer instrumentação sofisticada. Interacções de ARN / proteína pode ser detectada por EMSA em concentrações tão baixas como 0,1 nM ou menos, e dentro de uma ampla gama de condições de ligação (pH 4,0-9,5, a concentração de sal monovalente 1-300 mM, e a temperatura 0-60 ° C). ARN / proteína a formação do complexo também pode ser estudada pelo ensaio de ligação ao filtro. Este é um procedimento simples, rápido e barato, baseado na retenção dos complexos de ARN / proteína em um filtro de nitrocelulose, enquanto que uma sonda de RNA livre passa por 6. Em comparação com a EMSA, é limitado nos casos em que a sonda de ARN contém múltiplos locais de ligação, ou o extracto em bruto contém mais do que uma proteína de ligação a ARN que se ligam a sonda no mesmo local. Enquanto múltiplas interacções ARN / proteína vai escapar à detecção por ensaio de ligação ao filtro, que pode ser facilmente visualizado por EMSA. Em alguns casos, a visualização é vésperan possível quando dois complexos de ARN / proteína co-migrar (por exemplo, humano IRP1 / IRE e IRP2 / complexos IRE), por adição de um anticorpo contra uma das proteínas de ligação a ARN para a reacção de EMSA, obtendo-se ainda mais sobre o gel de retardo ( &quot;supershift&quot;) 7. O EMSA tem sido amplamente utilizado para estudar e IRP1 IRP2, que são reguladores pós-transcricional do metabolismo do ferro 8-10. Eles operam através da ligação a IRES, estruturas hairpin filogeneticamente conservados dentro das UTRs de vários mRNAs 11. IRES foram descobertos pela primeira vez nos mRNAs que codificam 12 ferritina e transferrina receptor 1 (TfR1) 13, proteínas de armazenamento de ferro e absorção, respectivamente. Mais tarde, IRES foram encontrados em específico-erythroid aminolevulinato sintase (ALAS2) 14, aconitase mitocondrial 15, ferroportin 16, transportador de metal divalente 1 (DMT1) 17, hipóxia fator induzível 2 <em&gt; α (HIF2α) 18, e outro mRNAs 19-21. O protótipo H- e mRNAs L-ferritina conter um IRE na sua UTR 5 &#39;, enquanto TfR1 ARNm contém múltiplos IRES em sua extremidade 3&#39; UTR. Interações IRE / PIA especificamente inibir a tradução do mRNA ferritina por estericamente bloqueando a sua associação dos 43S da subunidade ribossômica; Além disso, eles estabilizar TfR1 mRNA contra clivagem endonucleolítica. IRP1 e share IRP2 extensa seqüência de similaridade e apresentam alta atividade de ligação IRE em células sedentos de ferro. Em células repletas de ferro, IRP1 monta um aglomerado cubano Fe-S que converte para aconitase citosólico em detrimento da sua actividade de ligação ao IRE, enquanto IRP2 sofre degradação proteossoma. Assim, as interacções IRE / PIA depender do estado celular de ferro, mas também são regulados por outros sinais, tais como H 2 O 2, o óxido nítrico (NO) ou hipoxia. Aqui, descrevemos o protocolo para avaliar a atividade IRE de ligação a partir de extratos de células de tecido cru e por eMSA. Utilizou-se um marcado com 32 P H-ferritina sonda IRE que foi gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de ADN de plasmídeo (I-12.CAT), onde a sequência IRE foi originalmente introduzido na orientação com sentido a jusante do local da polimerase de ARN de T7 pela clonagem de oligonucleótidos sintéticos 22 recozidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="430">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:195px;">Name of the Materials&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">leupeptin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2884</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PMSF</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td align="right">78830</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BioRad Protein Assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15518-012</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UTP [alpha-32P]</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>NEG507H</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation liquid</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">141349</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">heparin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0777</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase T1</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Equipments&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue Ruptor</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">9001271</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean II xi Cell&#160;&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1834</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">20 wells combs 1.5mm thick</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1868</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mm spacers</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1849</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerPac</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>164-5070</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

Interações RNA / proteínas são fundamentais para vias de regulação pós-transcricional. Entre as proteínas de ligação a ARN citosólicos melhor caracterizados são proteínas reguladoras de ferro, e IRP1 IRP2. Eles ligam-se a elementos responsivos de ferro (IRES) dentro das regiões não traduzidas (UTRs) de vários mRNAs alvo, controlando assim a tradução de mRNAs ou estabilidade. Interações IRE / PIA têm sido amplamente estudados pela EMSA. Aqui, nós descrevemos o protocolo de EMSA para analisar a actividade de ligação de IRE-IRP1 e IRP2, que pode ser generalizado para avaliar a actividade de outras proteínas de ligação a ARN, bem. Um lisato de proteína bruto contendo uma proteína de ligação de ARN, ou uma preparação purificada desta proteína, é incubado com um excesso de 32 sonda de ARN marcada com P, para permitir a formação do complexo. A heparina é adicionado para impedir a proteína não específica para sondar ligação. Subsequentemente, a mistura é analisada por electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida. A sonda livremigra rapidamente, enquanto que o ARN / proteína apresenta complexos de mobilidade retardada; daí, o procedimento também é chamado de &quot;retardamento em gel&quot; ou ensaio &quot;bandshift&quot;. Depois de completada a electroforese, o gel é seco e complexos de ARN / proteína, bem como sonda livre, são detectados por auto-radiografia. O objetivo geral do protocolo é para detectar e quantificar IRE / IRP e outras interações RNA / proteína. Além disso, a EMSA também pode ser utilizado para determinar a especificidade, a afinidade de ligação, e a estequiometria da interacção de ARN / proteína sob investigação.

A radiolabeled IRE probe was prepared, as described in sections 3 and 4 of the protocol. The sequence of the probe was 5&#39;-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3&#39;; the bolded nucleotides represent an unpaired C residue and the loop, which are critical IRE features. The specific radioactivity of the probe was 4.5 x 109 cpm/&#956;g of RNA.
To assess the effects of iron perturbations on IRE-binding activity, murine RAW...

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Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Research

JoVE Journal

Biology

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