Name: electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Экспериментальные процедуры с мышами были утверждены Care комитета животных Университета МакГилл (протокол 4966) мимо. 1. Получение белковых экстрактов из культивируемых клеток <ol><li> Промыть культивируемые клетки дважды 10 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом фи...

<ol>
	<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome.">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, 1078-1081 (2012).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-mediated+degradation+of+IRP2:+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity.">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li><li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements.">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li><li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+iron+regulatory+protein-1+(IRP1)+by+oxidative+stress.">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li><li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+iron+metabolism.">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li><li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA.">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li><li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-responsive+elements:+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation.">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li><li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA.">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li><li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements.">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li><li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1,+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation.">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li><li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter.">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li><li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency.">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li><li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+and+the+cell+cycle:+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3'-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy.">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li><li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA.">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron.">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li><li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein,+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch.">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein(s)+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages.">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li><li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction.">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li><li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis.">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li><li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis.">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li><li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload:+from+pathophysiology+to+clinical+practice.">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li><li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+(IRP)-1+and+-2+genes.">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li><li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-/-+mice:+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels.">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530 (2014).</li><li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy.">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li><li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+RNA-protein+interactions.">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li></ol>

Здесь мы опишем протокол, который был разработан для изучения IRE-связывающих деятельности IRP1 и IRP2, и мы показываем репрезентативные данные. С помощью различных зондов, этот протокол также может быть скорректирована для изучения других РНК-связывающих белков. Важным шагом является разм...

EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени 1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия 3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, возможно, конформации. Используя меченой РНК в качестве зонда позволяет легко мониторинг &quot;задержки в геле&quot; или &quot;bandshift&quot;. Использование 32 P-меченой РНК зондов является очень распространенным явлением и обладает высокой чувствительностью. Миграция РНК / белковые комплексы и свободной РНК обнаруженыавторадиографией. Недостатки являются короткий период полувыведения из 32 P (14,29 дней), постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза, требование лицензии радиоактивности и инфраструктуры на предмет радиоактивности работы, и потенциальных проблем биобезопасности. Таким образом, альтернативные-изотопные методы мечения РНК-зонда были разработаны, например, с флуорофорами или биотин, которые позволяют обнаружение флуоресцентной или хемилюминесцентной изображений 4,5. Ограничения этих методов более высокую стоимость и часто пониженная чувствительность по сравнению с изотопной метки, и потенциал неизотопных этикеток вмешиваться взаимодействия РНК / белок. Неденатурирующем гели полиакриламида подходят для большинства применений EMSA и обычно используются. В отдельных случаях, гели агарозы могут представлять собой альтернативу для анализа больших комплексов. Основным преимуществом EMSA является то, что он сочетает в себе простоту, чувствительность и надежность 4 &lt;/ SUP&gt;. Анализ может быть завершена в течение нескольких часов и не требует сложного инструментария. РНК / белковые взаимодействия могут быть обнаружены с помощью EMSA в таких низких концентрациях, как 0,1 нМ или менее, и в широком диапазоне условий связывания (рН 4,0 - 9,5, концентрация соли одновалентного 1 - 300 мм, а температура 0 - 60 ° С). РНК / белок образование комплекса также может быть изучена с фильтром анализа связывания. Это просто, быстро и недорого процедура, основанная на сохранении РНК / белковых комплексов в нитроцеллюлозный фильтр, в то время как свободной РНК зонд проходит через 6. По сравнению с EMSA, оно ограничено в случаях, когда РНК-зонда содержит несколько сайтов связывания, или неочищенный экстракт содержит более одного РНК-связывающие белки, которые связываются с зондом в том же месте. В то время как несколько РНК / белковые взаимодействия будет избежать обнаружения фильтра-анализе связывания, они могут быть легко визуализированы с помощью EMSA. В некоторых случаях, визуализация наканунеп возможно, когда два РНК / белковые комплексы со мигрируют (например, человек IRP1 / IRE и IRP2 / IRE комплексы), добавляя антитела против одного из РНК-связывающих белков в реакции EMSA, уступая дальнейшее замедление на геле ( &quot;supershift&quot;) 7. EMSA широко используется для изучения IRP1 и IRP2, которые являются пост-транскрипционные регуляторы метаболизма железа 8-10. Они работают путем связывания с ИРЭС филогенетически консервативных шпилька структур в UTRs нескольких мРНК 11. Ires были впервые обнаружены в мРНК, кодирующих ферритина 12 и рецептора трансферрина 1 (TfR1) 13, белки хранения железа и поглощения, соответственно. Позже, Ires были найдены в эритроидных конкретных аминолевулинат синтазы (ALAS2) 14, митохондриальная аконитазы 15, Ferroportin 16, двухвалентный металл транспортера 1 (DMT1) 17, индуцируемого гипоксией фактора 2 <eм&gt; α (HIF2α) 18, и других генов 19-21. Н прототип и L-ферритина мРНК содержат один IRE в их 5 &#39;UTR, а TfR1 мРНК содержит несколько Ires в своей 3&#39; UTR. IRE / ПИВТ взаимодействия специфически ингибируют ферритина перевод мРНК пространственно блокируя его ассоциацию 43S субъединицы рибосомы; Кроме того, они стабилизируют TfR1 мРНК против эндонуклеолитическим расщепления. IRP1 и IRP2 доля сходство обширная последовательности и обладают высокой ИРЭ-связывающей активности железосодержащих голодали клеток. В железо-изобилует клеток, IRP1 собирает кубан Fe-S кластер, который преобразует его в цитозоле аконитазы за счет его ИРЭ-связывающей активности, в то время как IRP2 деградирует протеасомной. Таким образом, IRE / ПИВТ взаимодействия зависит от состояния клеточного железа, но также регулируются другими сигналами, такими как H 2 O 2, окись азота (NO) или гипоксии. Здесь мы опишем протокол для оценки ИРЭ-связывающей активности от неочищенных клеточных и тканевых экстрактов EMSA. Мы использовали 32 P-меченого Н-ферритина IRE зонд, который был создан путем транскрипции в пробирке из шаблона плазмидной ДНК (I-12.CAT), где последовательность ИРЭ был первоначально введенного в смысле ориентации ниже по потоку от полимеразы Т7 РНК-сайта путем Клонирование отожженных синтетических олигонуклеотидов 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="430">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:195px;">Name of the Materials&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">leupeptin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2884</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PMSF</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td align="right">78830</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BioRad Protein Assay</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>500-0006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EPO111</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase Inhibitor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15518-012</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UTP [alpha-32P]</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>NEG507H</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation liquid</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">141349</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">heparin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0777</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rnase T1</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>EN0541</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Equipments&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tissue Ruptor</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">9001271</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>LS6500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean II xi Cell&#160;&#160;</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1834</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">20 wells combs 1.5mm thick</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1868</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mm spacers</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>165-1849</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerPac</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>164-5070</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophoretic mobility shift assay (emsa) for the study of rna-protein interactions: the ire/irp example

РНК / белковые взаимодействия являются критическими для посттранскрипционных регуляторных путей. Среди наиболее изученных цитозольными РНК-связывающих белков железные регуляторные белки, IRP1 и IRP2. Они связывают гладить реактивные элементы (IRES) в нетранслируемых регионов (НТО) нескольких целевых мРНК, тем самым управляя перевод или стабильность мРНК. IRE / ПИВТ взаимодействия были широко изучены EMSA. Здесь мы опишем протокол EMSA для анализа ИРЭ-связывающую активность в IRP1 и IRP2, которые могут быть обобщены для оценки активности других РНК-связывающих белков, а также. Неочищенный лизат белков, содержащих РНК-связывающий белок, или очищенный препарат этого белка, инкубируют с избытком 32 P-меченного зонда РНК, что позволило для образования комплекса. Гепарин добавляется исключает неспецифическое белок, чтобы исследовать связывание. Затем смесь анализируют без денатурации электрофорезом на полиакриламидном геле. Бесплатно зондмигрирует быстро, в то время как РНК / белковый комплекс экспонатов отсталых мобильности; Таким образом, процедура также называется &quot;гель задержка&quot; или &quot;bandshift&quot; анализа. После завершения электрофореза гель сушат и РНК / белковые комплексы, а также свободный зонда, обнаруживаются с помощью авторадиографии. Общая цель протокола заключается в выявлении и количественной IRE / IRP и другие РНК / белковые взаимодействия. Кроме того, EMSA также может быть использован для определения специфичности, аффинности связывания и стехиометрию взаимодействия РНК / белок изучаемого.

Радиоактивно IRE проба была приготовлена, как описано в разделах 3 и 4 протокола. Последовательность зонда 5&#39;-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC СГГ C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 &#39;; в выделенные жирным шрифтом нуклеотиды представляют собой непарный C остаток и цикл, которые являются критическими...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example at JoVE.com

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера

Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Компьютерные Стимулы животной модели

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Do-It-Yourself Устройство для восстановления криоконсервированных образцов случайно уронил в криогенных резервуаров

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК<em&gt; В Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...