Name: detection of true ige-expressing mouse b lineage cells
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00
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DRW es apoyado por subvenciones del NIH AI089972 y AI113217, y por el de la mucosa Estudios de Inmunología del equipo, y tiene una concesión de carrera para los científicos médicos del Fondo Burroughs Wellcome.

NOTA: Todos los experimentos descritos aquí estaban de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) directrices y aprobado por el Hospital de Niños de Investigación Animal (ARCH), Boston, Mass. 1. Preparación de los reactivos <ol><li> 1,000x IL-4 Stock: Diluir IL-4 de citoquinas a 20 mg / ml en H 2 O o 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Distribuir en 200 ml de alícuotas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C. </li><li> 1.000 x anti-CD40: Ob...

<ol>
	<li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism.">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li><li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE+in+allergy+and+asthma+today.">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li><li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunoglobulin E. Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li><li>Ozcan, E., Notarangelo, L. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li><li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S&#181;+to+S&#949;+recombination.">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct S&#181; to S&#949; recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li><li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination.">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li><li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk.">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li><li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades.">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).</li><li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li><li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH.">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li><li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo.">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li><li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies.">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li><li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE(+)+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition.">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li><li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgE(+)+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li><li>He, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE++B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response.">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li><li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI.">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li></ol>

La estimulación de células B de ratón esplénica en cultivo con anti-CD40 y IL-4 simulará T helper de tipo 2 (T H 2) las interacciones, el cambio de clase alentador IgG1 e IgE 5. Las células B pueden ser activados para la RSE en el contexto de esplenocitos totales 12 o células B esplénicas purificadas 11. Como se ha indicado en el protocolo (etapa 2.3), el enriquecimiento de células B es opcional, y es a discreción del experimentador para determinar si sería benefici...

Durante inmunoglobulina de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) en ratones y seres humanos, la IgH μ exones de la región constante (Cμ) se eliminan y sustituyen por uno de varios conjuntos de los exones de la región constante aguas abajo (C H s) (por ejemplo Cγ, Cε, y Cα), resultando en un cambio de la producción de IgM a la producción de otras clases de Ig (por ejemplo, IgG, IgE, o IgA). RSE se produce dentro de conmutación (S), que son regiones 1-10 kb secuencias localizadas 5 &#39;a cada conjunto de C H 1 s. La activación inducida por citidina deaminasa (AID) enzima inicia la RSE a través de la actividad de citidina deamination. La IgE es un mediador clave de la enfermedad alérgica 2 y una mayor comprensión de cómo se produce y regulada puede abrir las puertas a nuevos enfoques terapéuticos para la enfermedad atópica IgE. En los ratones y los seres humanos, IgE es el isotipo Ig más estrechamente regulado. IgE normalmente se detecta en niveles miles de times menor que otro IgH isotipos 3, pero puede ser muy elevado en estados de enfermedad 4. Sin embargo, la RSE a la IgE no se conoce bien. In vitro la activación de células B usando IL-4 en combinación con anti-CD40 o LPS, induce CSR tanto a IgG1 e IgE 5. Las células B activadas expresan el receptor de baja afinidad IgE FcεRII / CD23 2,6, que se une la IgE soluble secretada en la cultura después de la RSE. Por lo tanto, al analizar con citometría de flujo, las células B con receptor de IgE unida mancha similar a las células B que expresan endógenamente IgE 7. Aunque se sabe que el ratón B células expresan el receptor de baja afinidad IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, en nuestra experiencia, no parece interferir con la medición del cambio de clase a IgG1. Sin embargo, en la medición de conmutación IgE después de la activación de las células B en la cultura, unida a la superficie específica IgE puede oscurecer el análisis. Con los métodos de tinción comunes, las células no expresan IgE tiñen positivamente para IgE. Esbozado aquí es una estrategia que se ha utilizado para llevar a cabo ensayos de RSE y detectar verdaderas células IgE-B que expresan de ratones 9-11. El tratamiento de células B activadas con tripsina, un reactivo de laboratorio común para digerir las proteínas, elimina unido a la superficie tanto citofílicos y la membrana IgE. Permeabilización posterior y tinción citoplasmática de IgE por lo tanto revela las verdaderas células productoras de IgE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:301px;">Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:343px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Mouse IgE FITC</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553415</td>
			<td>clone R35-72</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550083</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-4052-82</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">anti-Mouse/Rat CD40</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0402-85</td>
			<td>clone HM40-3</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Lifetechnologies (Corning)</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;">MACS CD45R (B220) microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MACS purification column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">IL-4</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>214-14</td>
			<td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Trypsin-EDTA Solution (10X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4174-100mL</td>
			<td>5.0g Trypsin, 2.0g EDTA&#376;4Na per Liter of 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100mL</td>
			<td>10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">2-mercaptoethanol (99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1140-17</td>
			<td>clone 1B4B1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HyClone Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;">B cell Stimulation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:343px;">B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,&#160; 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 &#181;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &#181;L/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

B inmunoglobulina de linfocitos de cadena pesada (IgH) recombinación de cambio de clase (CSR) es un proceso en el que expresa inicialmente IgM cambia a otros isotipos de IgH, tales como IgA, IgE e IgG. Medición de la IgH CSR in vitro es un método clave para el estudio de una serie de procesos biológicos que van desde la recombinación y reparación del ADN a los aspectos de la inmunología molecular y celular. Ensayo in vitro RSE implica la superficie de medición expresión Ig de citometría de flujo en células B activadas. Si bien la medición de IgA e IgG subclases es sencillo, la medición de IgE por este método es problemático debido a la IgE soluble unión a FcεRII / CD23 expresado en la superficie de las células B activadas. Aquí se describe un procedimiento único para la medición precisa de IgE productoras de células B de ratón que han sido objeto de la RSE en la cultura. El método se basa en la escisión de tripsina-mediada de complejos IgE-CD23 en la superficie celular, lo que permite la detección de células de linaje B productoras de IgE por CYtinción toplasmic. Este procedimiento ofrece una solución conveniente para el análisis de citometría de flujo de la RSE a la IgE.

Este procedimiento se ha aplicado con éxito para estudiar la RSE a la IgE en las células B de ratón. Para demostrar la eficacia en la medición de la RSE, estimulamos las células B esplénicas de ratón con anti-CD40 y IL-4 como se describió previamente 11. Después de cinco días de estimulación, se recogieron las células y se procesaron usando el protocolo descrito anteriormente y se tiñeron con B220 (CD45R) anticuerpos IgM marcado con fluorescencia, IgG1, IgE, y. Cerrado en los linfocitos de voladu...

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Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detección de copia baja número DNA Viral integradora formada por In Vitro la infección Hepatitis B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...