Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Università degli Studi di Milano for støtte til Eliana Di Cairano (Post-ph.d.-stipendium) og Stefania Moretti (ph.d.-stipendium). Dette arbejde blev støttet af universitetet Research Program PUR til CP Vi vil gerne takke professor Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, England, for pHluorin konstruere og Dr. Dotti Francesco for assistance i dataanalyse, og Silvia Marsicano til teknisk bistand.

1. Cellekultur og transfektion <ol><li> SH-SY5Y cellekultur BEMÆRK: Forsøgene er blevet udført under anvendelse af den humane neuroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-celler vokser som en blanding af flydende klynger og adhærente celler. Følg anvisningerne rapporteret i protokollen (celletæthed, splitting forhold osv.) For at have celler, der vokser solidt fastgjort til glas dækning, som er afgørende for TIRFM. <ol><li> Før start under laminar strømning ...

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

Denne artikel præsenterer en protokol til billede og analysere vesikler dynamik i secernerende celler, ved hjælp af fluorescerende cDNA-kodet vektorer og TIRFM. Centrale elementer i en vellykket billeddannelse ved TIRFM er valget af den cellulære model og celletransfektion med genetisk kodede optiske indikatorer for vesikel frigivelse og genbrug. TIRFM er ideel til celler, der vokser klæbende til et glas cover og tilstrækkelig flad til at tillade stabil visualisering af membraner og fus...

Kemisk synaptisk transmission mellem neuroner er en vigtig mekanisme for kommunikation i nervesystemet. Den er afhængig af frigivelse af neurotransmittere gennem en dynamisk cyklus af vesikelfusion og hentning på den præsynaptiske sted. Mange af de involverede i vesikel dynamik proteiner er blevet identificeret; men deres bidrag til fænomenet uafklaret 1. Vores forståelse er delvist begrænset af, at de mest anvendte assays for exo / endocytose er ikke altid den mest hensigtsmæssige. Adskillige undersøgelser vedrørende vesikelfusion og dynamik afhængige elektrofysiologiske teknikker. Denne teknik giver en optimal tidsmæssig opløsning og er fremragende til at undersøge den indledende fusion af vesikler til plasmamembranen, men er ude af stand til at detektere mange af de underliggende molekylære begivenheder, der understøtter præsynaptiske funktion. Elektronmikroskopi, på den anden side tilvejebringer den fineste morphological beskrivelse af hver ental skridt, men det dynamiske aspekt af begivenheden kan ikke lagres, fordi prøverne skal fastsættes for at blive analyseret. Fremkomsten af nye optiske optagelse teknikker 2,3, kombineret med fremskridt inden for fluorescerende molekylære prober udvikling 4-6, muliggør visualisering af eksocytiske processer i levende celler, hvilket giver nye niveauer af information om den synaptiske struktur og funktion. Indledende undersøgelser udnyttede aktivitet-afhængige styrylfarvestoffer (FM1-43 og beslægtede organiske farvestoffer) 7,8. State-of-the-art billeddiagnostiske teknikker ansætte pH-følsomme varianter af grønt fluorescerende protein (GFP) (pHluorin) tøjret til luminale blærer proteiner 9. Disse prober normalt slukket, når til stede i vesiklerne på grund af den lave luminale pH. Efter fusion med plasmamembranen, er vesiklen indre udsat for neutral ekstracellulære rum, pH<html> brat stiger, lindrer proton-afhængige quenching af pHluorin og det fluorescerende signal hurtigt frem. Som ændringen i pHluorin er hurtigere end fusion begivenhed, ved at overvåge fluorescens stiger, kan måles og analyseres vesikelfusion med membranen. Fordi overfladen pHluorin-mærkede molekyler endocytoseres, fluorescenssignalet efterfølgende vender tilbage til basisniveauet, derfor den samme konstruktion kan også anvendes til at overvåge vesikel genanvendelse 9. Mens vesikel-mærkede pH-sensor sikrer visualisering kun af disse blærer, der virkelig fusionere med plasmamembranen, er billedbehandling ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning kræves for at beskrive i detaljer de trin, der er involveret i exo / endocytiske processer. Den optiske teknik, der giver den nødvendige spatio-temporale opløsning er total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM), en anvendelse af fluorescensmikroskopi 10. &quot;&gt; Samlet indre refleksion opstår ved grænsefladen mellem glasset cover-slip og prøven. Når lysbanen når glasdæksel-slip med en hændelse vinkel større end den kritiske vinkel, er excitationslyset ikke overføres til prøven, men er fuldstændigt reflekteret tilbage. Under disse betingelser en flygtige lys bølgeformer ved grænsefladen og udbreder i mediet med mindre optisk tæthed (prøven). Da intensiteten af ​​det flygtige felt henfalder eksponentielt med afstanden fra grænsefladen (med en indtrængningsdybde ca. 100 nm) kun fluoroforer i nærmeste nærhed til cover-slip kan exciteres mens dem længere væk fra grænsen er ikke. I celler transficeret med GFP-konstruktioner, denne dybde svarer til proteiner udtrykt på plasmamembranen eller i vesikulære strukturer nærmer det. Som fluoroforer i cellens indre ikke kan exciteres, er baggrundsfluorescens minimeres, og et billede med et meget højt signal / baggrund rotteio dannes 11. Flere egenskaber gør TIRFM teknikken med valg til overvågning vesikler dynamik. Den perfekte kontrast og høj signal-til-støj-forholdet muliggør påvisning af meget lave signaler stammer fra enkelte vesikler. Chip-baserede billedoptagelse i hver ramme giver den tidsmæssige opløsning er nødvendige for at detektere meget dynamiske processer. Endelig er minimal eksponering af celler for lys på noget andet plan i prøven kraftigt reducerer fototoksicitet og muliggør langvarig tidsforskudt optagelse 12. Dataanalyse fortsat det mest udfordrende og afgørende aspekt af denne teknik. Den enkleste måde at overvåge vesikelfusion er at måle akkumulering af reporter fluorescerende proteiner på celleoverfladen, over tid 13. Som fusionsproteiner stiger, netto fluorescenssignal stiger såvel. Imidlertid kan denne metode undervurdere processen, især i store celler og i hviletilstande,fordi endocytose og fotoblegning processer opveje stigningen i fluorescensintensitet grund vesikel exocytose. En alternativ metode er at følge hver begivenhed enkelt fusion 14. Denne sidstnævnte fremgangsmåde er meget følsom og kan afsløre vigtige oplysninger om mekanismerne fusion. Men det kræver manuel udvælgelse af enkelte begivenheder, fordi helt automatiske procedurer til at følge vesikler og registrere udsving i deres fluorescerende signaler er ikke altid tilgængelige. Observation af vesikel dynamik kræver prøveudtagning celler ved høj frekvens. Dette genererer en stor mængde data, der næppe kan analyseres manuelt. Forslaget med dette oplæg er at optimere TIRFM imaging teknik til overvågning af basal og stimuleret neurotransmitterfrigivelse i SH-5YSY neuroblastomcellelinje, og beskrive, trin-for-trin, en procedure udviklet i laboratoriet for at analysere data, både ved hel-celle og enkelt vesikel niveauer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Synaptiske vesikler frigive neurotransmittere ved kemiske synapser gennem en dynamisk cyklus af fusion og genfinding. Overvågning synaptisk aktivitet i realtid og dissekere de forskellige trin i exo-endocytose på enkelt-vesikel niveau er afgørende for forståelsen af synaptiske funktioner i sundhed og sygdom. Genetisk kodede pH-følsomme sonder direkte målrettet til synaptiske vesikler og total intern refleksion Fluorescens mikroskopi (TIRFM) giver den spatio-temporale opløsning nødvendigt at følge vesikel dynamik. Den flygtige felt genereret af total intern refleksion kan kun excitere fluorophorer anbragt i et tyndt lag (&lt;150 nm) over glasafdækning som adhærerer, præcis hvor processerne exo-endocytose finde sted. De resulterende billeder med høj kontrast er velegnet til vesikler sporing og kvantitativ analyse af fusion begivenheder. I denne protokol, SH-SY5Y human neuroblastoma celler foreslås som et værdifuldt model til at studere neurotransmitterfrigivelse på enkelt-vesikel niveau ved TIRFM grund af deres flad overflade og tilstedeværelse af dispergerede vesikler. Metoderne til dyrkning SH-SY5Y som klæbende celler og for transfektion dem med synapto-pHluorin er forudsat, samt teknikken til at udføre TIRFM og billeddannelse. Endelig er en strategi, der sigter mod at vælge, tælle, og analysere Fusion begivenheder på hel-celle og enkelt vesikel niveauer præsenteres. For at validere imaging procedure og dataanalyse tilgang, er dynamikken i pHluorin-mærkede vesikler analyseret under hvile og stimuleret (depolariserende kaliumkoncentrationer) betingelser. Membrandepolarisering øger hyppigheden af ​​fusionsbegivenheder og forårsager en parallel raise netmaskerne fluorescenssignal optaget i hele celler. Single-vesikel analyse viser modifikationer af fusion-event adfærd (øget peak højde og bredde). Disse data tyder på thpå kalium depolarisering ikke kun inducerer en massiv neurotransmitterfrigivelse men også ændrer mekanisme vesikelfusion og genanvendelse. Med passende fluorescerende probe, kan denne teknik anvendes i forskellige cellulære systemer til at dissekere de mekanismer, konstitutiv og stimuleret sekretion.

Procedurerne TIRF billedbehandling og dataanalyse beskrevne er designet til at studere vesikler dynamik i cellulære systemer. Denne teknik kan anvendes til at bestemme virkningerne af signalmolekyler og lægemidler på Fusion begivenheder og neurotransmitter vesikel dynamik 17. Brug af GFP-mærkede plasmamembranproteiner har TIRFM analyse været ansat til at karakterisere den konstitutive handel med GFP-mærkede glutamat transportører i glia og epitelceller 18,19. For...

Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM og pH-følsomme GFP-prober til Evaluer Neurotransmitter Vesikel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastomaceller: Cell Imaging og Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation af olfaktoriske Ensheathing Cells at evaluere Funktionel Recovery efter perifer nerveskade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisering af endosome Dynamics i Living nerveender med Firdimensional fluorescensimagografi

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Celle Sortering af neurale stam- og progenitorceller fra voksne mus subventrikulære Zone og Live-billeddannelse af deres cellecyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyse Synaptic Graduering af<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer efter Udsættelse for Langvarig Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

In vitro kvantitativ billeddannelse assay for phagocytose af døde neuroblastom celler ved iPSC-makrofager

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Måling af membranlipidomsætning med den pH-følsomme fluorescerende lipidanalog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Analyser af Actin Dynamics, Kobling Kobling og Traction Force for Vækst Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...