Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei der Università degli Studi di Milano für die Unterstützung von Eliana Di Cairano (Post-Doktorandenstipendium) und Stefania Moretti (Promotionsstipendium) bestätigen. Diese Arbeit wurde von der University Research Program PUR zu CP unterstützt Wir möchten Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Großbritannien, danke ich für das pHluorin bauen und Dr. Francesco Dotti für die Unterstützung bei der Datenanalyse und Silvia Marsicano für die technische Unterstützung.

1. Zellkultur und Transfektion <ol><li> SH-SY5Y-Zellkultur HINWEIS: Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der humanen Neuroblastom-SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-Zellen zu wachsen als eine Mischung von Floating-Cluster und adhärenten Zellen. Folgen Sie den Anweisungen im Protokoll (Zelldichte, Teilungsverhältnis, etc.) Berichtet, dass Zellen, die fest mit Glasabdeckung, die entscheidend für TIRFM ist angebracht wachsen. <ol><li> Vor dem Start unter lam...

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Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für Bild und analysieren Vesikel Dynamik in sezernierenden Zellen, unter Verwendung von fluoreszierenden cDNA-kodierten Vektoren und TIRFM. Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Bildgebung durch TIRFM sind die Auswahl des Zellmodell und Zelltransfektion mit genetisch codierte optische Anzeigen von Vesikel-Freisetzung und Recycling. TIRFM ist ideal für wachsende Zellen haft auf eine Glasabdeckung und ausreichend eben, um eine stabile Darstellung von M...

Chemische synaptische Übertragung zwischen Neuronen ist ein Hauptmechanismus der Kommunikation im Nervensystem. Es beruht auf der Freisetzung von Neurotransmittern durch einen dynamischen Zyklus Vesikelfusion Auslagern in der präsynaptischen Seite. Viele der Proteine ​​in Vesikel Dynamik beteiligt identifiziert worden sind; jedoch ihre spezifischen Beitrag zum Phänomen bleibt zu klären 1. Unser Verständnis teilweise durch die Tatsache, dass die am häufigsten verwendeten Assays zur exo / Endozytose nicht immer am besten geeignet beschränkt. Mehrere Studien zu Vesikelfusion bezogenen und Dynamik setzen auf elektrophysiologischen Techniken. Diese Technik sorgt für eine optimale zeitliche Auflösung und ist ausgezeichnet für die Untersuchung der anfänglichen Fusion von Bläschen an der Plasmamembran aber nicht erkennen viele der molekularen Mechanismen, die präsynaptischen Funktion unterstützen. Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite stellt die feinste morphological Beschreibung jeder einzelnen Schritt, aber der dynamische Aspekt der Veranstaltung können nicht erfasst werden, weil Proben müssen, um fest zu analysieren werden. Das Aufkommen von neuen optischen Aufzeichnungstechniken 2,3, in Kombination mit den Fortschritten in Fluoreszenzmolekularsonden Entwicklung 4-6, ermöglicht die Visualisierung der Exozytose Prozessen in lebenden Zellen, wodurch ein neues Maß an Informationen über die synaptische Struktur und Funktion. Erste Studien genutzt aktivitätsabhängigen Styrylfarbstoffe (FM1-43 und verwandte organische Farbstoffe) 7,8. State-of-the-Art-bildgebenden Verfahren eingesetzt werden pH-sensitive Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) zu Lumen Vesikel Proteine ​​9 angebunden. Diese Sonden werden in der Regel aus, wenn in den Vesikeln aufgrund der geringen luminale pH vorliegenden geschaltet. Nach der Fusion mit der Plasmamembran, die Vesikelinnenraum zur neutralen Extrazellularraum der pH Einstrahlung<html> abrupt, entlastet den Protonenabhängige Abschrecken pHluorin und das Fluoreszenzsignal schnell angezeigt. Da die Änderung in pHluorin schneller ist als die Fusionsereignis, durch Messen der Fluoreszenz zunimmt, kann Vesikelfusion mit der Membran gemessen und analysiert werden. Da Oberflächen pHluorin-markierte Moleküle Endozytose werden, danach kehrt das Fluoreszenzsignal auf Basisniveau, also das gleiche Konstrukt kann auch Vesikel Recycling 9 Überwachung verwendet werden. Während die Vesikel-markierten pH-Sensor sorgt für die Visualisierung nur dieser Vesikel, die wirklich verschmelzen mit der Plasmamembran wird Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung benötigt, um im Detail zu beschreiben die Schritte in den exo / endozytischen Prozesse. Die optische Technik, die die notwendigen räumlichen und zeitlichen Auflösung bietet, ist Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), eine Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie 10. &quot;&gt; Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckglas und der Probe. Wenn der Lichtpfad des Glasdeckglas mit einem Einfallswinkel größer als der kritische Winkel erreicht auftritt, wird das Erregungslicht nicht in die Probe übertragen, aber ist vollständig zurückreflektiert wird. Unter diesen Bedingungen wird ein evaneszentes Licht-Wellenformen an der Grenzfläche und breitet sich in dem Medium mit geringer optischer Dichte (der Probe). Da die Intensität des abklingenden Feldes nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Schnittstelle (mit einer Eindringtiefe von etwa 100 nm) nur die Fluorophore in unmittelbarer Nähe vom Deckglas angeregt werden, während diejenigen, die weiter vom Rand entfernt liegen nicht. In Zellen, die mit GFP-Konstrukten transfiziert, entspricht diese Tiefe, um Proteine ​​auf der Plasmamembran exprimiert oder vesikuläre Strukturen nähert sie. Als Fluorophore im Zellinneren nicht erregt werden, wird die Hintergrundfluoreszenz minimiert, und ein Bild mit einem sehr hohen Signal / Hintergrund-Ratteio 11 gebildet. Mehrere Eigenschaften machen TIRFM die Technik der Wahl für die Überwachung von Vesikeln Dynamik. Die perfekten Kontrast und die hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht die Detektion von sehr niedrigen Signalen, die aus einzelnen Vesikeln. Chipbasierte Bildaufnahme in jedem Frame bietet die zeitliche Auflösung erforderlich sind, um hochdynamische Prozesse zu erkennen. Schließlich ist die minimale Exposition von Zellen gegen Licht an jedem anderen Flugzeug in der Probe reduziert stark Phototoxizität und ermöglicht langlebige Zeitrafferaufnahme 12. Datenanalyse bleibt die größte Herausforderung und entscheidender Aspekt dieser Technik. Der einfachste Weg, Vesikelfusion überwachen ist die Ansammlung von fluoreszenten Reporter-Proteine ​​auf der Zelloberfläche zu messen, über die Zeit 13. Als Fusions erhöht, Nettofluoreszenzsignal steigt auch. Allerdings kann diese Methode den Prozess zu unterschätzen, insbesondere in großen Zellen und in Ruhebedingungen,weil Endozytose und Bleichen Prozesse versetzt den Anstieg in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Bläschen Exocytose. Ein alternatives Verfahren besteht darin, jede einzelne Fusionsereignis 14 zu folgen. Dieses letztere Verfahren ist sehr empfindlich und kann wichtige Informationen über den Fusionsmechanismen offenbaren. Es erfordert jedoch die manuelle Auswahl der einzelnen Ereignisse, weil vollständig automatisierte Verfahren, um Vesikel zu verfolgen und die Fluktuation der Fluoreszenzsignale zu registrieren sind nicht immer verfügbar. Die Beobachtung der Vesikel Dynamik erfordert Sampling-Zellen mit einer hohen Frequenz. Dies erzeugt eine große Menge von Daten, die kaum manuell analysiert werden kann. Der Vorschlag der vorliegenden Arbeit ist es, die TIRFM bildgebendes Verfahren zur Überwachung der basale und stimulierte Freisetzung von Neurotransmittern in der SH-5YSY Neuroblastom-Zelllinie zu optimieren und zu beschreiben, Schritt-für-Schritt wird eine im Labor entwickelt Verfahren, um Daten zu analysieren, sowohl bei Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Synaptischen Vesikeln frei Neurotransmitter an chemischen Synapsen durch einen dynamischen Zyklus der Fusion und den Abruf. Überwachung synaptische Aktivität in Echtzeit und sezieren die verschiedenen Schritte von exo-Endozytose auf Einzel Vesikel Ebene sind entscheidend für das Verständnis der synaptischen Funktionen in Gesundheit und Krankheit. Genetisch kodierte pH-sensitive Sonden direkt an synaptischen Vesikeln und Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) gezielte bieten die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich sind, um Vesikel Dynamik zu folgen. Das abklingende Feld durch interne Totalreflexion erzeugt wird, kann nur Fluorophore in einer dünnen Schicht (&lt;150 nm) über der Glasdeckel an dem Zellen anhaften platziert erregen, genau dort, wo die Verfahren der exo-Endozytose erfolgt. Die entstandenen Bilder mit hohem Kontrast sind ideal geeignet für Vesikel Tracking und quantitative Analyse von Fusions Veranstaltungen. In diesem Protokoll, SH-SY5Y menschlichen neuroblastoma Zellen werden als ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung an der Single-Vesikel Ebene durch TIRFM aufgrund ihrer flachen Oberfläche und der Gegenwart verteilt Vesikel vorgeschlagen. Die Verfahren zum Züchten von SH-SY5Y als adhärente Zellen und zur Transfektion von ihnen synapto-pHluorin vorgesehen sind, sowie als ein Verfahren, TIRFM und Bildgebung auszuführen. Schließlich wurde eine Strategie mit dem Ziel, zu wählen, zu zählen und zu analysieren Fusion Ereignissen an Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen dargestellt. Um das Bildgebungsverfahren und Datenanalyse-Ansatz zu validieren, die Dynamik des pHluorin-markierten Vesikel unter Ruhe analysiert und stimuliert (depolarisierenden Kaliumkonzentrationen) Bedingungen. Membrandepolarisation erhöht die Frequenz der Fusionsereignisse und verursacht eine parallele Erhöhung des Nettofluoreszenzsignals im ganzen Zelle aufgezeichnet. Single-Vesikel Analyse zeigt Modifikationen Fusionsereignis Verhalten (erhöhte Spitzenhöhe und Breite). Diese Daten legen nahe thbei Kalium-Depolarisation nicht nur induziert eine massive Freisetzung von Neurotransmittern, sondern auch verändert den Mechanismus der Fusion von Vesikeln und Recycling. Mit dem geeigneten fluoreszierenden Sonde kann diese Technik in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt werden, um die Mechanismen der konstitutiven und stimulierte Sekretion sezieren.

Die beschriebenen TIRF Bildgebung und Datenanalyse-Verfahren sollen die Vesikel Dynamik in zellulären Systemen zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Signalmolekülen und Medikamente auf Fusionsereignisse und Neurotransmitter-Vesikel Dynamik 17 zu bestimmen. Mit GFP-markierten Plasmamembranproteinen hat die TIRFM Analyse eingesetzt worden, um die konstitutive Handel mit GFP-markierten Glutamattransporter in Gliazellen und Epithelzellen 18,19 charakterisieren. </...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...