Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

著者は、Elianaのディカイラーノ（ポスドクフェローシップ）とステファニアモレッティ（博士フェローシップ）への援助をUniversitàデッリ大学地区ミラノを承認したいと思います。この作品は、CPに大学の研究プログラムPURによってサポートされていました私たちは、技術支援のためにpHluorinための教授ジェレミーM.ヘンリー、生化学、ブリストル大学の大学院、イギリス、構築し、博士Dottiフランチ​​ェスコデータ分析をアシストするために、そしてシルビアMarsicanoに感謝したいと思います。

1.細胞培養およびトランスフェクション<ol><li> SH-SY5Y細胞培養 注：実験は、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y（ATCC＃CRL-2266）15を用いて行われてきた。 SH-SY5Y細胞は、浮遊クラスタおよび接着細胞の混合物として成長する。しっかりとTIRFMのために重要であるガラスカバーに付着して増殖する細胞を持っているプロトコル（細胞密度、分割比など ）で報告された指示に従...

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. 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Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

本論文では、画像へのプロトコルを提示し、蛍光cDNAコードベクトルとTIRFMを使用して、分泌する細胞内小胞のダイナミクスを分析する。 TIRFMによる成功したイメージングの重要な要素は、小胞のリリースとリサイクルの遺伝的に符号化された光の指標と細胞モデルと細胞トランスフェクションの選択である。 TIRFMは、膜融合事象の安定した可視化を可能にするために、?...

ニューロン間の化学シナプス伝達は、神経系におけるコミュニケーションの主要なメカニズムである。それは、シナプス前サイトでの小胞融合と検索の動的なサイクルを通して神経伝達物質の放出に依存している。小胞動態に関与するタンパク質の多くが同定されている。しかし、現象への具体的な貢献は、1を明確にされていない。 我々の理解は、部分的に、エキソ/エンドサイトーシスのために最も広く使用されるアッセイは、常に最も適切ではないという事実によって制限される。小胞融合とダイナミクスに関連したいくつかの研究では、電気生理学的手法に依存している。この技術は、最適な時間分解能を提供し、原形質膜への小胞の初期の融合を調査するための優れているが、シナプス前機能をサポートする基礎となる分子事象の多くを検出できない。電子顕微鏡は、他の側に、最高級のmorphologicaを提供していますサンプルが分析されるために修正される必要があるため、Lの各特異ステップの説明が、イベントの動的な側面は、捕獲することができない。 新たな光記録技術の出現2,3は 、蛍光分子プローブの開発4-6の進歩と組み合わせて、このようにシナプスの構造と機能についての情報の新しいレベルを提供する、 生きた細胞内のエキソサイトーシスのプロセスの可視化を可能にします。 初期の研究に活用活動依存スチリル染料（FM1-43および関連有機染料）7,8。最先端のイメージング技術は、管腔小胞タンパク質9につなが緑色蛍光タンパク質（GFP）（pHluorin）のpH感受性変異体を使用する。これらのプローブは、通常は低いため管腔のpHをベシクル中に存在する場合にオフになります。原形質膜との融合の後、小胞の内部は中性細胞外空間のpHに曝露される<html>突然、増加pHluorinのプロトン依存消光を軽減し、蛍光シグナルが急速に表示されます。 pHluorinの変化は、蛍光の増加を監視することにより、融合事象よりも高速であるように、膜との小胞の融合を測定し、分析することができる。表面pHluorinタグ化分子はエンドサイトーシスされているので、蛍光シグナルは、その後、基礎レベルに戻るので、同一の構築物は、9のリサイクル小胞を監視するためにも使用することができる。 小胞 - タグ付きのpHセンサーはだけは本当に細胞膜と融合するもの胞の可視化を保証しながら、高い空間と時間分解能でのイメージングは​​細部にエキソ/エンドサイトーシスプロセスに関与する手順を記述するために必要とされる。必要な時空間分解能を提供する光学技術は、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）、蛍光顕微鏡10の適用である。 &quot;&gt;内部全反射は、光路が臨界角よりも大きな入射角でガラスカバースリップに達するとガラスカバースリップと試料との間の界面で発生する励起光を試料に伝達されないが完全界面におけるエバネッセント光の波形は、これらの条件下ではバックの反射が少ない光学濃度（サンプル）を含む培地中で伝播する。エバネッセント場の強度の侵入深さで（界面からの距離とともに指数関数的に減衰するようにさらに、境界から離れたものがGFP構築物でトランスフェクトした細胞ではなくなってから約100nm）をカバースリップに最も近接のみフルオロフォアを励起することができ、この深さは、原形質膜上に発現されるタンパク質、または小胞構造に対応細胞内部でフルオロフォアを励起することができないように、バックグラウンド蛍光が最小化される。それに接近し、非常に高いシグナル/バックグラウンドラットの画像ioが11が形成されている。 いくつかの特徴は、小胞の動態を監視するための選択肢のTIRFM技術を作る。完璧なコントラスト及び高い信号対雑音比は、単一の小胞に由来する非常に低い信号の検出を可能にする。各フレーム内のチップベースの画像取得が非常に動的なプロセスを検出するのに必要な時間分解能を提供する。最後に、サンプル内の他の面での光への細胞の最小限の露出が強く光毒性を軽減し、長期的なタイムラプス記録12を可能にします。 データ分析は、この技術の最も挑戦的で重要な側面のまま。小胞の融合をモニターするための最も簡単な方法は、時間13にわたって、細胞表面でのレポーター蛍光タンパク質の蓄積を測定することである。融合が増大すると、正味の蛍光シグナルも同様に増加する。しかし、この方法は、特に大細胞および休止状態で、プロセスを過小評価することが、エンドサイトーシスおよび光退色プロセスにより小胞のエキソサイトーシスに対する蛍光強度の増加を相殺するためである。別の方法は、各単一の融合事象14に従うことである。この後者の方法は非常に敏感であり、融合のメカニズムに関する重要な詳細を明らかにすることができます。完全に自動化された手順は、小胞を追跡し、それらの蛍光シグナルの変動を登録するために常に利用可能ではないので、それは、単一のイベントを手動で選択する必要がある。小胞の動態を観察したところ、高い周波数でサンプリングセルが必要です。これは、ほとんど手動で分析することができない大量のデータを生成する。 この論文の提案は両方、基礎を監視するためのTIRFMイメージング技術を最適化し、SH-5YSY神経芽細胞腫細胞株における神経伝達物質の放出を刺激し、そしてデータを分析するために、ステップバイステップで、実験室で開発された手順を記述することである全細胞および単一小胞レベルで。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

シナプス小胞が融合し、検索の動的なサイクルを通じて化学シナプスでの神経伝達物質を放出し。 リアルタイムでシナプス活性を監視し、単一小胞レベルでのエキソサイトーシスの異なるステップを解剖することは、健康および疾患におけるシナプスの機能を理解するために重要である。 遺伝的にコードpH感受性直接シナプス小胞をターゲットとプローブと全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は小胞のダイナミクスに従うことが必要な時空間的分解能を提供。全反射によって生成されたエバネッセントフィールドは、エキソサイトーシスのプロセスが行われる正確な場所は、細胞が付着したガラスのカバーの上の薄層（&lt;150 nm）の中に入れ、フルオロフォアを励起することができる。得られる高コントラスト画像は、理想的には、追跡小胞融合事​​象の定量分析に適している。 このプロトコルでは、SH-SY5Yヒトnはeuroblastoma細胞は、それらの平らな表面と分散小胞の存在のため、TIRFMによって単一小胞レベルでの神経伝達物質の放出を研究するための貴重なモデルとして提案されている。接着細胞としてSH-SY5Yを成長させるためとsynapto-pHluorinでそれらをトランスフェクトするための方法はTIRFMおよびイメージングを実行するための技術と同様に、提供される。最後に、選択してカウントし、全細胞および単一小胞レベルでの融合事象を分析することを目的と戦略が提示されている。 撮像手順及びデータ分析アプローチを検証するために、pHluorinタグ付きの小胞のダイナミクスは、静止条件下で分析し、（カリウム濃度の脱分極）の条件を刺激する。膜の脱分極は、融合事象の頻度を増加させ、全体のセルに記録正味の蛍光シグナルの並列上昇を引き起こす。単一小胞の分析は、融合事象の挙動の改変（増加したピーク高さと幅）を明らかにする。これらのデータは、目を提案カリウム脱分極で大規模な神経伝達物質の放出を誘導するだけでなく、小胞融合やリサイクルの仕組みを変更するだけではなく。 適切な蛍光プローブで、この技術は、構成的分泌刺激のメカニズムを分析するために、異なるセルラーシステムで使用することができる。

記載されTIRFイメージングとデータ分析手順は、セルラーシステムにおける小胞のダイナミクスを研究するために設計されています。この技術は、融合事象と神経伝達物質小胞ダイナミクス17シグナル伝達分子と薬剤の効果を決定するために用いることができる。 GFPタグ付き原形質膜タンパク質を用いて、TIRFM分析はグリア細胞および上皮細胞18,19にGFPタグ付きグルタミン酸輸?...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...