Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

저자는 엘리 아나 디 카이 라노 (박사후)과 스테파니 모레티 (박사 교제)에 지원 Università 글리 스투 디 밀라노을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 CP에 대학 연​​구 프로그램 PUR에 의해 지원되었다 pHluorin가 구성 박사 ​​Dotti 프란체스코 데이터 분석 지원 및 기술 지원에 대한 실비아 Marsicano에 대해 우리는 교수 제레미 M. 헨리, 생화학 학교, 브리스톨, 영국의 대학에 감사의 말씀을 전합니다.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> SH-SY5Y 세포 배양 주 : 실험 SY5Y 인간 신경 아세포종 SH- (ATCC # CRL-2266) (15)를 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포는 부동 클러스터 및 부착 세포의 혼합물로서 성장한다. 단단히 TIRFM 위해 매우 중요 유리 커버에 부착 성장 세포를 가지고 프로토콜 (셀 밀도, 분할 비율, 등.)에보고 된 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 시작하기 전에, 층류 생물 ...

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. 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S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

이 논문은 이미지에 프로토콜을 제시하고, 형광 cDNA를 인코딩 벡터와 TIRFM를 사용하여, 분비 세포에서 소포 역학을 분석 할 수 있습니다. TIRFM에 의해 성공적으로 영상의 핵심 요소 소포 자료 및 재활용의 유전자 인코딩 광학 지표와 셀룰러 모델과 세포 형질의 선택입니다. TIRFM는 이상적으로 유리 커버에 부착 성장과 세포막과 융합 이벤트의 안정적인 시각화를 허용하기에 충...

신경 세포 사이의 화학 시냅스 전달은 신경 시스템의 통신의 주요 메커니즘이다. 이 시냅스 사이트에서 소포 융합 및 검색의 동적 사이클을 통해 신경 전달 물질의 방출에 의존한다. 소포 역학에 관여하는 단백질의 대부분은 확인되었다; 그러나, 현상에 특정 공헌 1 명확히 남아있다. 이해 부분적 엑소 / 엔도 사이토 시스에 가장 널리 사용되는 분석은 항상 가장 적합하지 않은 사실에 의해 제한된다. 여러 소포 융합 관련 연구와 역학 전기 생리 기술에 의존하고있다. 이 기술은 최적의 시간 해상도를 제공하며 세포막에 소포 초기 융합을 조사하는 우수하지만 연접 기능을 지원하는 기본 분자 많은 이벤트를 감지 할 수있다. 전자 현미경은, 다른 측면에서, 최고의 morphologica을 제공합니다시료를 분석하기 위해 고정되어야하기 때문에 각 스텝 단수이지만 이벤트의 동적 양태의 설명은 L, 포착 할 수 없다. 형광 분자 프로브 개발 4-6의 발전과 함께 새로운 광 기록 기술 2,3의 출현, 따라서 시냅스 구조 및 기능에 대한 정보를 제공하는 새로운 수준, 생균의 exocytic 프로세스 시각화 할 수있다. 초기 연구 악용 활동에 의존 스티 릴 염료 (FM1 - 43 및 관련 유기 염료) 7,8. 최첨단 영상 기술은 내강 소포 단백질 9 닿는 녹색 형광 단백질 (GFP) (pHluorin)의 pH 민감성 변종을 사용합니다. 이 프로브는 일반적으로 낮기 때문에 내강의 pH의 소포에 존재하는 경우 꺼져 있습니다. 세포막과 융합 후, 소포 내부는 중성 세포 외 공간에 노출된다 산도<html> 갑자기, 증가 pHluorin의 양성자에 의존 담금질을 완화하고, 형광 신호가 빠르게 나타납니다. pHluorin 변화 형광 증가를 모니터링함으로써, 융합 이벤트보다 빠르기 때문, 막과 소포 융합 측정하고 분석 할 수있다. 표면 pHluorin 태깅 분자 endocytosed되므로 형광 신호는 이후, 따라서 동일한 구조가 소포 9 재활용을 모니터링하도록 또한 사용될 수있다, 기저 레벨로 되돌아 간다. 베지 태그 pH의 센서 만 실제로 세포막과 융합 그 소포 시각화을 보장하면서, 높은 시공간 해상도 이미징은 상세 엑소 / 이입 과정에 관련된 단계를 설명하는 데 필요하다. 필요한 시공간 해상도를 제공하는 광학 기술은 전반사 형광 현미경 (TIRFM), 형광 현미경 (10)의 애플리케이션이다. &quot;&gt; 내부 전반사가 광 통로가 임계각보다 큰 입사각으로 유리 커버 슬립에 도달 유리 커버 슬립 샘플. 사이의 계면에서 발생 된 여기 광은 샘플에 송신되지만되지 않는다 완전히 다시 반영. 이러한 조건, 계면에서의 에바 네 센트 광 웨이브 형태 및 아래 산장의 강도의 침투 깊이 (계면으로부터의 거리와 함께 지수 함수 적으로 감소있다. 이하의 광학 밀도 (샘플)과 매질에서 전파 멀리 경계로부터 사람들은 GFP-제물로 형질 세포에서.없는 동안 약 100㎚) 커버 슬립에 가장 가까운 근방에만 형광체가 여기 될 수 있으며, 이러한 깊이는 세포막에 발현 된 단백질 또는 소포 성 구조에 대응 셀 내부에 형광 물질이 여기 될 수 없기 때문에, 배경 형광을 최소화하고, 화상이 매우 높은 신호 / 배경 쥐된다. 그것에 접근IO (11)을 형성한다. 몇 가지 특성은 소포 역학 모니터링을위한 선택의 TIRFM 기술을합니다. 완벽한 콘트라스트 및 높은 신호 대 잡음비는 단일 소체로부터 도출 매우 낮은 신호들의 검출을 허용한다. 각 프레임에 칩 기반 이미지 획득은 매우 동적 인 프로세스를 검출 할 필요 시간 해상도를 제공한다. 마지막으로, 샘플의 다른면에서 빛 세포의 최소한의 노출은 강하게 광독성을 줄이고 오래 지속 시간 경과 기록 (12)을 수 있습니다. 데이터 분석이 기술의 가장 도전적이고 중요한 측면 남아있다. 소포 융합을 모니터링하는 간단한 방법은 13 시간 동안, 세포 표면에 형광 리포터 단백질의 축적을 측정하는 것이다. 물론 융합 증가 순 형광 신호가 증가함에. 그러나,이 방법은 특히 큰 셀에서 및 휴식 조건에서, 공정을 과소 수도엔도 시토 시스와 광표백 프로세스 인해 엑소 사이토 시스 소포로 형광 강도의 증가를 상쇄하기 때문이다. 다른 방법은 각각의 단일 융합 이벤트 (14)을 따르는 것입니다. 이 후자의 방법은 매우 민감하고 융합 메커니즘에 대한 중요한 세부 사항을 공개 할 수 있습니다. 완전히 자동화 된 절차는 소포를 따라 자신의 형광 신호의 변동을 등록 항상 사용할 수 없기 때문에 그러나, 하나의 이벤트의 수동 선택이 필요합니다. 소포 역학 관측은 높은 주파수에서 샘플링 세포가 필요합니다. 이것은 거의 직접 분석 할 수없는 대량의 데이터를 생성한다. 이 논문의 제안은 모두, 실험실에서 개발 된 절차는 데이터를 분석하기 위해 SH-5YSY 신경 아세포종 세포주에서 기저 및 자극을 신경 전달 물질 방출을 모니터링 TIRFM 영상 법을 최적화하고 설명하는 단계별이고 전체 셀 및 단일 소포 수준.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

시냅스 소포가 융합 및 검색의 동적 사이클을 화학적 시냅스에서 신경 전달 물질을 방출. 실시간 시냅스 활성을 모니터링하고 단일 소포 수준에서 엑소 엔도 시토 시스의 여러 단계를 해부하면 건강과 질환에서 시냅스 기능을 이해하는데 중요하다. 직접 시냅스 소포 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 대상으로 pH 민감성 프로브 소포 역학을 수행하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도를 제공을 유전자 인코딩. 내부 전반사에 의해 생성 산장은 엑소 엔도 시토 시스의 과정이 일어나는 정확한 위치, 세포가 접착 된 커버 유리 위에 박층 (&lt;150 ㎚)에 배치 된 형광체를 여기 할 수있다. 얻어진 높은 콘트라스트 이미지는 이상적으로 추적 소포 융합 이벤트의 정량 분석​​에 적합하다. 이 프로토콜에서는, SH-SY5Y 인간의 Neuroblastoma 세포 때문에 평평한 표면, TIRFM에 의해 단일 ​​소포 수준에서 신경 전달 물질 방출을 연구하기위한 귀중한 모델과 분산 된 소포의 존재로 제안된다. 부착 세포로 SH-SY5Y 성장과 synapto-pHluorin로 형질 감염에 대한 방법은 TIRFM 및 이미징을 수행 할 수있는 기술뿐만 아니라, 제공됩니다. 마지막으로, 개수를 선택하고, 전체 셀 및 단일 소포 수준에서 융합 이벤트를 분석하는 것을 목표로 전략을 제시한다. 이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 방법의 유효성을 검사하기 위해, pHluorin 태그가 소포의 역학은 휴식에서 분석하고 조건 (칼륨 농도 탈분극) 자극. 막 탈분극 융합 이벤트의 빈도를 증가시키고, 전체 셀 내에 기록 순 형광 신호의 병렬 인상을 야기한다. 단일 소포 분석 융합 이벤트 동작 (증가 피크의 높이와 폭)의 수정을 보여준다. 이 자료는 제 제안칼륨 탈분극에 엄청난 신경 전달 물질 방출을 유도뿐만 아니라 소포 융합 및 재활용의 메커니즘을 수정 아닙니다. 적절한 형광 프로브,이 기술은 항시 분비 자극 메커니즘을 해부 다른 셀룰러 시스템들에서 사용될 수있다.

설명 TIRF 이미징 및 데이터 분석 절차는 셀룰러 시스템에서 소포 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 융합 이벤트 및 신경 전달 물질 소포 (17) 상에 분자 역학 및 약물 시그널링의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. GFP 표지 된 세포막 단백질 사용 TIRFM 분석 교세포에서 GFP 표지 된 글루타메이트 수송 상피 세포 (18,19)의 구성 적 특징을 거래하기 위해 사용되어왔다....

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

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셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

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Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

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의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

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Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

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