Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
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Los autores desean reconocer la Università degli Studi di Milano para el apoyo a Eliana Di Cairano (beca post-doctoral) y Stefania Moretti (beca de doctorado). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Universidad de PUR CP Nos gustaría dar las gracias al profesor Jeremy M. Henley, Facultad de Bioquímica de la Universidad de Bristol, Reino Unido, por el pHluorin construir y el Dr. Francesco Dotti para la asistencia en el análisis de datos, y Silvia Marsicano para la asistencia técnica.

1. Cultivo celular y transfección <ol><li> Cultivo de células SH-SY5Y NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y las células adherentes. Siga las instrucciones indicadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) Para tener células que crecen firmemente unidos a la cubierta de cristal, que es crucial para TIRFM. <ol><li> Antes ...

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

Este artículo presenta un protocolo para la imagen y analizar la dinámica de vesículas en las células secretoras, utilizando vectores cDNA codificada fluorescentes y TIRFM. Los elementos clave del éxito de formación de imágenes por TIRFM son la selección del modelo celular y transfección celular con indicadores ópticos genéticamente codificados de la liberación de vesículas y el reciclaje. TIRFM es ideal para las células de crecimiento adherente a una cubierta de vidrio planas ...

La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar 1. Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados. El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica de 2,3, en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes 4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic en células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica. Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) 7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales 9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH<html> aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje 9. Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia 10. &quot;&gt; La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma 11. Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero 12. Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo 13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única 14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente. La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Las vesículas sinápticas liberan neurotransmisores en las sinapsis químicas a través de un ciclo dinámico de la fusión y la recuperación. Supervisión de la actividad sináptica en tiempo real y la disección de los diferentes pasos de exo-endocitosis en el nivel de una sola vesícula son cruciales para la comprensión de las funciones sinápticas en salud y enfermedad. Genéticamente codificados sondas sensibles al pH directamente dirigidos a las vesículas sinápticas y Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) proporcionan la resolución espacio-temporal necesario seguir la dinámica de la vesícula. El campo evanescente generada por la reflexión interna total sólo puede excitar fluoróforos colocados en una capa delgada (&lt;150 nm) por encima de la cubierta de vidrio sobre el cual las células se adhieren, exactamente donde los procesos de exo-endocitosis tienen lugar. Las imágenes de alto contraste resultantes son ideales para vesículas de seguimiento y análisis cuantitativo de los eventos de fusión. En este protocolo, SH-SY5Y n humanaeuroblastoma células se proponen como un modelo valioso para el estudio de la liberación de neurotransmisores en el nivel de una sola vesícula por TIRFM, debido a su superficie plana y la presencia de vesículas dispersas. Los métodos para el cultivo de SH-SY5Y como células adherentes y para transfectar con synapto-pHluorin se proporcionan, así como la técnica para llevar a cabo TIRFM y de imagen. Por último, se presenta una estrategia con el objetivo de seleccionar, contar y analizar los eventos de fusión a nivel de células enteras y de una sola vesícula. Para validar el método de análisis de procedimiento de imágenes y datos, la dinámica de las vesículas de etiquetado pHluorin se analizan bajo reposo y estimuladas (despolarizar las concentraciones de potasio) condiciones. Despolarización de la membrana aumenta la frecuencia de eventos de fusión y causa un aumento paralelo de la señal de fluorescencia neta registrada en células enteras. Análisis de una sola vesícula revela modificaciones del comportamiento de fusión-evento (altura máxima y una mayor anchura). Estos datos sugieren ésimoen la despolarización de potasio no sólo induce una liberación masiva neurotransmisor sino también modifica el mecanismo de la fusión de vesículas y reciclaje. Con la sonda fluorescente apropiada, esta técnica se puede emplear en diferentes sistemas celulares para diseccionar los mecanismos de secreción constitutiva y estimulado.

Los procedimientos de imágenes TIRF y datos de análisis descritos están diseñados para estudiar la dinámica de vesículas en los sistemas celulares. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos de las moléculas de señalización y las drogas en los eventos de fusión y la dinámica de vesículas de neurotransmisores 17. El uso de proteínas de la membrana plasmática GFP-etiquetados, el análisis TIRFM se ha empleado para caracterizar el tráfico constitutiva de los transportadores de glu...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

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Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...