Name: tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

Yazarlar Eliana Di Cairano (Post-doktora bursu) ve Stefania Moretti (doktora bursu) destek için Universita degli Studi di Milano kabul etmek istiyorum. Bu çalışma CP Üniversitesi Araştırma Programı PUR tarafından desteklenen PHluorin inşa Dr. Dotti Francesco veri analizi konusunda yardım almak için, ve teknik yardım için Silvia Marsicano için biz, Prof. Jeremy M. Henley, Biyokimya Okulu, Bristol, Birleşik Krallık Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> SH-SY5Y hücre kültürü Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15 kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin. <ol><li> Başlamadan önce, laminer akı?...

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

Bu kağıt görüntüye bir protokol sunar ve floresan cDNA-kodlanmış vektörler ve TIRFM kullanarak, salgılayan hücrelerde veziküller dinamiklerini analiz. TIRFM başarılı görüntüleme anahtar unsurları vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm genetik olarak kodlanmış optik göstergelerle hücresel modeli ve hücre transfeksiyon seçim vardır. TIRFM ideal bir cam kapak yapışık büyüyen ve membran ve füzyon etkinlikleri sabit görüntülenmesine olanak vermek üz...

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı 1 netleştirilmelidir. Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez. floresan moleküler sondalar geliştirme 4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri 2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar. İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) 7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler 9 gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz<html> aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül 9 dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner. Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu 10 bir uygulamadır. &quot;&gt; Toplam iç yansıma ışık yolu kritik açıdan daha büyük bir olay açısı ile cam kapak-kayma ulaşır cam kapak-slip ve örnek. Arasındaki arayüzde meydana, uyarma ışık numune içine iletilir ama değil Tamamen geri yansıtılır. Bu koşullar altında, ara yüzeyde genliği azalan bir ışık dalga formları altında ve kaybolan alan yoğunluğunun bir penetrasyon derinliği ile (arabiriminden mesafe ile katlanarak çürürken. daha az bir optik yoğunluk (örnek) ile ortam içinde ilerleyen daha uzakta sınırından bu GFP yapılar ile transfekte edilen hücrelerde. değil iken, yaklaşık 100 nm) kapak-slip en yakın olan sadece flüoroforlar uyarılırken, bu derinlik, plazma zarı üzerinde ifade edilen proteinlerin veya veziküler yapılarda tekabül Hücre iç flüoroforlar heyecanlı olamaz gibi, arka plan floresan minimize, ve bir görüntü çok yüksek sinyal / arka plan sıçan olduğunu. yaklaşanio 11 oluşturulur. Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt 12 sağlar. Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman 13 üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı 14 takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir. Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Sinaptik veziküller füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca kimyasal sinaps nörotransmitterlerin bırakın. Gerçek zamanlı olarak sinaptik aktivite izleme ve tek kese düzeyinde egzo-endositozun farklı adımlar diseksiyon sağlık ve hastalık sinaptik fonksiyonlar anlamak için çok önemlidir. Doğrudan sinaptik veziküllerin ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) hedeflenen pH duyarlı problar vezikül dinamiklerini takip etmek gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan genetik olarak kodlanmış. toplam iç yansıma tarafından oluşturulan kaybolan alan sadece egzo-endositoz süreçler gerçekleşecek tam olarak nerede, hücreler uygun olan cam kapak üzerinde ince bir tabaka (&lt;150 nm) yerleştirilen fluorophores heyecanlandırmak olabilir. Elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler ideal izleme veziküller ve füzyon olayları kantitatif analiz için uygundur. Bu protokolde, SH-SY5Y insan neuroblastoma hücreleri nedeniyle düz yüzeyin, TIRFM ile tek vezikül seviyesinde nörotransmitter salimim çalışmak için değerli bir model ve dağılmış veziküllerin varlığı olarak önerilmektedir. Yapışkan hücreler gibi SH-SY5Y büyüyen ve synapto-pHluorin ile transfekte edilmesine yönelik yöntemler TIRFM ve görüntüleme gerçekleştirmek için teknik olarak, hem de temin edilmiştir. Son olarak, seçmek saymak ve tam hücre ve tek kese seviyelerinde füzyon olayları analiz etmeyi amaçlayan bir strateji sunulmaktadır. Görüntüleme işlemi ve veri analizi yaklaşımı doğrulamak için, pHluorin-etiketli kesecikler dinamikleri dinlenme altında analiz edilir ve koşulları (potasyum konsantrasyonları depolarizan) uyarılır. Membran depolarizasyon füzyon olgulannın sıklığını arttırır ve bütün hücre kaydedilen net floresans sinyalinin paralel bir zam neden olur. Tek vezikül analizi füzyon olayı davranışı (yüksek tepe yükseklik ve genişlik) değişiklikleri gösterir. Bu veriler inci öneririzpotasyum depolarizasyon bir büyük nörotransmitter salınımını uyarır, aynı zamanda vezikül füzyon ve geri dönüşüm mekanizmasını değiştiren sadece. Uygun floresan prob ile, bu teknik yapıcı ve uyarımlı sekresyon mekanizmaları incelemek için farklı hücresel sistemlerde kullanılabilecektir.

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılm?...

Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Nörobilim

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...