Name: glutamate and hypoxia as a stress model for the isolated perfused vertebrate retina
Uploaded: 2015-03-22T15:00:00
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This paper is dedicated to my beloved wife Maren and our little Karl.

1. Preparação de Bovinos Olhos <ol><li> Obter bovina olhos imediatamente após o abate do animal. </li><li> Transportar os olhos protegidos em &quot;Sickel-solução&quot; uma forma especial, contendo NaCl 120 mM, KCl a 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 0,15 mM de CaCl2, 1,5 mM de NaH 2 PO 4, 13,5 mM de Na 2 HPO 4 e 5 mM de glucose no RT. </li><li> Realizar a preparação da retina em condições adaptadas escuro com uma luz vermelha ofuscante. </li><li> Retire ...

<ol>
	<li>Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+central+retinal+artery+occlusion:+clinical+presentation+and+management.">A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management.</a> Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).</li><li>Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertension-related+eye+disorders).">Hypertension-related eye disorders).</a> Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).</li><li>Feltgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+of+the+European+Assessment+Group+for+Lysis+in+the+Eye+(EAGLE)+for+the+treatment+of+central+retinal+artery+occlusion:+design+issues+and+implications.+EAGLE+Study+report+no.+1+:+EAGLE+Study+report+no.+1.">Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).</li><li>Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+glutamate+levels+in+the+vitreous+body+of+humans+and+monkeys+with+glaucoma.">Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma.</a> Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).</li><li>Bertram, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+levels+in+subretinal+and+vitreous+fluid+of+patients+with+retinal+detachment.">Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment.</a> Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).</li><li>Diederen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glutamate+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+retinal+detachment).">Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment).</a> Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).</li><li>Ientile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+necrosis+occurring+in+excitotoxic+cell+death+in+isolated+chick+embryo+retina.">Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina.</a> J Neurochem. 79, 71-78 (2001).</li><li>Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activators+promote+excitotoxicity-induced+retinal+damage.">Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage.</a> FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).</li><li>Ambati, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+gamma-aminobutyric+acid,+glutamate,+and+vascular+endothelial+growth+factor+levels+in+the+vitreous+of+patients+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy.</a> Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).</li><li>Vorwerk, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depression+of+retinal+glutamate+transporter+function+leads+to+elevated+intravitreal+glutamate+levels+and+ganglion+cell+death.">Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).</li><li>Schultheiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dulbecco's+Modified+Eagle+Medium+is+neuroprotective+when+compared+to+standard+vitrectomy+irrigation+solution.">Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effects+of+two+different+irrigation+solutions+on+an+isolated+perfused+vertebrate+retina.">Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina.</a> Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).</li><li>Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+and+Electrical+Responses+to+Light+Simulation+in+the+Retina+of+the+Frog.">Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog.</a> Science. 148, 648-651 (1965).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.+Brain+research.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research.</a> Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).</li><li>Henderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+experimental+data+for+univariate+normality.">Testing experimental data for univariate normality.</a> Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).</li><li>Alt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroprotective+potential+of+Rho-kinase+inhibition+in+promoting+cell+survival+and+reducing+reactive+gliosis+in+response+to+hypoxia+in+isolated+bovine+retina.">The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina.</a> Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision research. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+standardization:+cure+or+cause+of+poor+reproducibility+in+animal+experiments.">Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments.</a> Nat Methods. 6, 257-261 (2009).</li><li>Dutescu, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifocal+ERG+recordings+under+visual+control+of+the+stimulated+fundus+in+mice.">Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54, 2582-2589 (2013).</li><li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+retinal+toxicity+of+drugs+in+animal+models+using+electrophysiological+and+morphological+techniques.">Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques.</a> Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Did+myocilin+evolve+from+two+different+primordial+proteins.">Did myocilin evolve from two different primordial proteins.</a> Mol Vis. 8, 271-279 (2002).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+retinal+toxicity+of+a+new+heavy+intraocular+dye,+using+a+model+of+perfused+and+isolated+retinal+cultures+of+bovine+and+human+origin.">Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).</li></ol>

Neste estudo, um impacto significativo na amplitude da onda b após 45 minutos de hipoxia foi encontrado. Esta redução foi ainda significativo após a fase de washout. Um efeito semelhante sobre o potencial de fotorreceptores pode ser observada. Os resultados são compatíveis com outros dados publicados 16 e nos dão a oportunidade de estudar possíveis efeitos neuroprotetores após hipóxia. Depois de 45 minutos de exposição de 250 uM de glutamat...

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas. A retina é uma rede neuronal altamente sensível que depende significativamente a oxigenação e é fortemente influenciado pelo metabolismo das suas células vizinhas. As principais patologias oculares relacionadas com a lesão das células nervosas são oclusões vasculares retinianas, glaucoma e descolamento da retina. A oclusão da artéria retinal, como um exemplo para a oclusão vascular da retina, leva a uma perda súbita de visão devido a hipoxia da retina interna 1. Ela é freqüentemente associada com patologias vasculares gerais 2 e leva a uma perda visual persistente 1, com apenas 8% dos pacientes em recuperação da acuidade visual significativamente 1. Apesar de a fibrinólise arterial tem sido sugerida como uma opção de tratamento, o benefício não poderia ser mostrado em um ensaio clínico randomizado 3. Glaucoma e descolamento de retinaambos têm um aumento na concentração de glutamato 4-6. O glutamato sob condições fisiológicas é encontrado como um transmissor excitatório ao longo de todo o sistema nervoso central e retina interna a 7,8. Elevados níveis de glutamato foram encontradas não só em glaucoma e descolamento de retina 5,6, mas também na retinopatia diabética proliferativa 9. Um aumento em glutamato conduz possivelmente a excitotoxicidade e, portanto, danos das células nervosas 10. Na maioria dos casos de descolamento da retina e em alguns casos de cirurgia de retinopatia diabética proliferativa na retina (vitrectomia via pars plana) são necessários. Durante a manipulação mecânica vitrectomia, luz brilhante da fibra óptica ou tensão de cisalhamento exercida por altas taxas de fluxo de soluções de irrigação durante as operações longas exercer uma pressão adicional sobre a retina 11,12. Todas as doenças mencionadas têm em comum que a patologia está localizada ao retinuma só e representam a comunidade oftalmológica com o desafio de encontrar formas de proteger a retina como um sistema neurossensorial. O electrorretinograma (ERG) é o método padrão para a avaliação in vivo da função de fotorreceptores (uma onda) e a função da retina interna (b-ondas). O ERG é medido por eléctrodos de prata-introduzidos na córnea e os olhos estão a ser estimulado por um aumento do nível de luz para detectar defeitos em bastonetes ou cones ou na retina interna. Diferentes defeitos na retina pode ser detectada por alterações na amplitude (a força da resposta) ou a latência (o intervalo de tempo de resposta-para) do ERG. Diferentes protocolos e métodos de medição ERG (padrão-ERG, multifocal ERG-campo ou brilhante ERG) permitem uma maior diferenciação de defeitos. A técnica da retina isolado foi introduzida recentemente, tornando-se possível avaliar os efeitos sobre a retina, sem interferências de um animal, por exemplo o estudo dereações gerais 13,14. Foi o propósito deste estudo para avaliar e introduzir um modelo de estresse definido e padronizado para hipóxia e estresse glutamato na retina superfused isolado. Assim, nós estamos esperando para lançar as bases para futuros estudos sobre efeitos neuroprotetores de determinados agentes ou soluções de irrigação intra-oculares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">120 mM NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 mM KCl,&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1,050,010,250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">0.1 mM MgCl2,&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">58,330,250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">0.15 mM CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td style="width:119px;">111 TA106282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1,065,860,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5 mM glucose</td>
			<td style="width:71px;">Merck Pharma, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40,741,000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamate and hypoxia as a stress model for the isolated perfused vertebrate retina

Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas e afeta doenças como glaucoma, oclusão vascular da retina, descolamento de retina, e retinopatia diabética. Era o objeto deste estudo a introdução de um modelo de estresse padronizado para futuro teste pré-clínico terapêutico. Retina bovina foram preparadas e perfundido com uma solução saturada de oxigénio padrão, e o ERG foi gravado. Depois de gravar b-ondas estáveis, hipoxia (N 2) puro ou estresse glutamato (250 um glutamato) foi exercida por 45 min. Para investigar os efeitos sobre sozinho função de fotorreceptores, 1 mM aspartato foi adicionada para obter a-ondas. ERG-recuperação foi monitorada por 75 min. Para hipoxia, uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada (p &lt;0,01) após um tempo de exposição de 45 min (36,5% de redução após o final da lavagem p = 0,03). Além disso, um decr inicialfacilidade de amplitudes de ondas de b-87.23% foi registada, que atingiu significado estatístico (p &lt;0,01, diminuição de 25,5% no final da lavagem, p = 0,03). Para 250 um glutamato, uma redução inicial de 7,8% de um amplitudes de ondas (p&gt; 0,05), seguidas por uma redução de 1,9% (p&gt; 0,05). Uma redução de 83,7% da amplitude da onda b (p &lt;0,01) foi observado; após uma lavagem de 75 min, a redução foi de 2,3% (p = 0,62). Neste estudo, um modelo de tensão é apresentada normalizada que pode ser útil para identificar possíveis efeitos neuroprotectores no futuro.

Após 1 hora de perfusão dos preparativos da retina com solução padrão saturado de oxigênio (Figura 1A e B) ERG-amplitudes mostrou estabilização e menor variação de amplitudes entre as medidas individuais. pH, pressão osmótica, temperatura, e pO 2 (excepto para o teste de hipóxia) foram mantidas constantes em todos os testes. Para isolar o sinal a partir do sinal de fotorreceptores da retina interna, aspartato 1 mM foi adicionado para a solução padrão ...

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Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Com este estudo, apresentamos um modelo de estresse padronizado para a retina bovina superfundido isolado para o futuro teste pré-clínico terapêutico. O efeito de qualquer hipóxia (puro N 2) ou estresse glutamato (250 mM glutamato) em função da retina representado por a- e amplitudes da onda-b foi avaliado.

Glutamato e hipóxia como um modelo de estresse para o isolado perfundido Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

Research

JoVE Journal

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