Name: laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area
Uploaded: 2015-02-06T13:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area at JoVE.com

This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

<ol>
	<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Schutze, K., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+expressed+genes+by+laser-mediated+manipulation+of+single+cells.">Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells.</a> Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).</li><li>Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+micromanipulation+systems+as+universal+tools+in+cellular+and+molecular+biology+and+in+medicine.">Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine.</a> Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).</li><li>Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+DNA+extraction+protocols+for+forensic+STR+typing+after+laser+capture+microdissection.">Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection.</a> Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).</li><li>Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+gene+expression+is+dynamically+regulated+in+the+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+and+is+related+to+expression+of+dopamine+neurotransmission+genes.">NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).</li><li>Seelan, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+analysis+of+laser+capture+microdissected+fetal+epithelia.">Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia.</a> Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-126+contributes+to+Parkinson's+disease+by+dysregulating+the+insulin-like+growth+factor/phosphoinositide+3-kinase+signaling.">miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling.</a> Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).</li><li>Bohm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antidepressant+treatment+on+gene+expression+profile+in+mouse+brain:+cell+type-specific+transcription+profiling+using+laser+microdissection+and+microarray+analysis.">Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 44-49 (2006).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Nurr1+maintains+fiber+integrity+and+nuclear-encoded+mitochondrial+gene+expression+in+dopamine+neurons.">Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).</li><li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+in+Laser+Capture+Microdissected+Sleep+Nuclei+From+Rat+Brain.">Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain.</a> Journal of Neurogenetics. , (2014).</li><li>Roberts, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+laser+capture+microdissection+and+protein+microarray+technologies+in+the+molecular+analysis+of+airway+injury+following+pollution+particle+exposure.">Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).</li><li>Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+studies+of+psychostimulant-induced+changes+in+gene+expression.">Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression.</a> Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15, 2364-2374 (2009).</li><li>Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy.">Laser capture microscopy.</a> Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

LCM הוא טכניקה רבת עוצמה לנתיחה של אוכלוסיות של תאים או אזורים של רקמה מסעיפי רקמות בדידות בשקופית מיקרוסקופ והבידוד הבא של RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA וחלבונים. השימוש בLCM בשילוב עם ניתוח תוך שימוש בטכנולוגיות תפוקה גבוהה כגון microarray, רצף RNA דור הבא, ניתוח אפיגנטיים של DNA ופרוטאומיקה הופך יותר ויותר נפוץ כמו הרגישות של טכניקות אלה משפר את כמות חומר המוצא צורך מופחתת 8-12. עם LCM, רזולוציה אנטומיים טוב יותר מושגת למדגם, וההבנה מצעדים במורד הזרם של דגימות אלה היא מאוד משופרת. אזהרה אחת עם LCM היא שהיא מספקת מדגם מרוכז של התאים של עניין, אך לא בהכרח אוכלוסייה טהורה של תאים. גבולות הדיוק אומר שיהיה כמה זיהום מרקמות סמוכות. עם זאת, טכניקה זו עושה להתרכז התאים של ענייןכדי למזער את השפעות הקשורות לרקמות ותאים ולמקסם את ההשפעות הניסיוניות בתאים של עניין. ישיר מול אימונוהיסטוכימיה העקיפה מאז LCM מנוצל כיום בעיקר לבידוד והמדידה של RNA, RNA שמירת שלמותה הוא קריטריון חשוב מאוד. שמירה על שלמות RNA היא הרציונל העיקרי מאחורי השימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה כדי להדריך את נתיחת רקמות אשר מסירה את הצורך להכתים את הרקמה ישירות שיכול לבזות את RNA (איור 10). כאשר השאלה הניסיונית, לעומת זאת, דורשת בידוד של אוכלוסייה ספציפית של תאים, כגון תאי עצב דופמין, נדרש אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה. באמצעות פרוטוקול תיוג אימונוהיסטוכימיה מהיר יכול למזער את ההשפלה של RNA במהלך ההליך. הפעמים דגירה קצרות נובעות מהשימוש בריכוזים גבוהים של אנטי ראשוניים ומשנייםגופים, ריכוזים שסביב 10-20 לקפל גבוהים יותר ממה הוא הכרחי עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית עם דגירה 2 שעות. אם לעומת זאת, פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות, בראון וסמית משמשים מאגרי מלח גבוהים לעכב השפלה RNA ולקבל RNA באיכות טובה עם זמנים ארוכים דגירה (עד 20 שעות) 13. גם גישה זו יכולה לשמש אם יש זמן ניכר הנדרש בין התיוג של הרקמה וגישה להגיע למערכת LCM. בחירה של שקופיות - קרום PEN, Silane-הכנה ושקופיות זכוכית ללא ציפוי השימוש בשקופיות זכוכית ללא ציפוי לLCM דווחו 14. במעבדה שלנו, מגלשות Silane-prep כבר מצאו להיות בחירה אופטימלית, כציפוי זה מספיק מצרף את הרקמה לשקופית אימונוהיסטוכימיה ללא אובדן של רקמה אך עדיין מאפשר לצירופה של הרקמה לכובעי LCM והסרת מהשקופית . יש לי שקופיות זכוכית ללא ציפויהראה כמה אובדן רקמה עם הליך אימונוהיסטוכימיה. אם נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה, לעומת זאת, שימור רקמה הופך פחות בעיה. עם התייבשות נכונה, תאים או רקמות לכידת הנחה של שקופיות Silane-הכנה לא הייתה בעיה. כל אחת מהגישות השונות לנוירונים בידוד או אזורים במוח המתואר במאמר זה יש יתרונות וחסרונות. לבידוד של נוירונים דופמין הבודדים, השימוש בשקופיות Silane-prep יש את היתרון של אופטיקה טובה יותר ופחות יקר מאשר שקופיות קרום PEN. החסרון הוא שתאים לפעמים לכידה יכולים להיות קשים אם יש התייבשות מספיקה (ראה להלן) וכמה רקמות ניתן להשאיר בשקופית. היתרון של שקופיות קרומי PEN הוא שהשימוש בשילוב של לייזר הלייזר וUV IR מבטיח כי נוירונים דופאמין ייאספו. אי-איסוף תאים משקופיות קרום PEN כמעט אף פעם לא מתרחש, כפי שהוא פחות תלוי בהתייבשות מאשר שקופיות הזכוכית.<html> יתרון נוסף הוא שליזר UV יכול לשמש כדי להתקרב לצורה של תאי העצב של עניין באופן הדוק יותר, בהשוואה למעגל עבור לכידת תאי עצב משל שקופיות זכוכית עם לייזר IR. לבידוד של אזורים של רקמה, שקופיות קרום PEN עדיפות בהרבה ולהצדיק את העלות הנוספת. גישה זו גורמת להסרת כל הרקמה לגזור על הקרום שלם, היא הרבה יותר מהר מאשר לכידת שטח גדול של רקמות באמצעות לייזר IR לבד ויכולים להיות שנאספו קטעי רקמה עבים יותר. רק באמצעות לייזר IR מחייב את קרום כובע LCM הוא נמס לגמרי על אזור הרקמה כולה. בנוסף, אוסף שלם של הרקמה אופייני ודורש בדרך כלל ניסיונות מרובים. למרות שזה לוקח יותר זמן מאשר בידוד רקמה משקופית קרום PEN, אם הרקמה זמינה כבר בשקופית זכוכית או לייזר UV אינו זמין, זה הוא אפשרות מעשית כמו רוב הרקמות ניתן לאסוף (איור 8J). &quot;&gt; צעדים קריטיים ove_content Incubations אתנול 100% הם אחד הצעדים החשובים ביותר. על מנת לאסוף תאים משקופיות Silane-הכנה נדרשת התייבשות של הרקמה שלמה. לכן, כל מים לא הוסרו, אשר מזוהה בעיקר עם הדגירה אתנול 100%, ישפיעו על היכולת להרים תאים מהשקופיות. כדי לטפל בבעיה זו, לעתים קרובות לשנות את פתרונות אתנול 100% כספיגה של מים מהאוויר או ההעברה משלבי כביסה קודמות יכול להשפיע על ההתייבשות. בנוסף, מסננות מולקולריות רגילות לספוג כל זיהום מים. מערכת LCM אידיאלית צריכה להיות ממוקמת בחדר קטן עם מסיר לחות כדי לשמור על תנאי לחות נמוכים. סעיפי cryostat טובים הם קריטיים לLCM הנכון. סעיפים צריכים להיות שטוח עם קפלים ברקמות ממוזערות. מקפל ברקמה יגדיל את המרחק בין כובע LCM ולמנוע ממנו ליצור קשר עם tהוא הרקמה. לאחר מכן הוא הופך להיות קשה כדי להמס את כובע הקרום מספיק על הרקמה. לשקופיות זכוכית, בדרך כלל עובי סעיף צריך להיות בין 6 ל 12 מיקרומטר. ניתן ללכוד קטעים עבים עם שקופיות קרום PEN. LCM מציע יכולת טכנית לעשות ניתוחים מאוד מדויקים של רקמות ותאים משקופיות מיקרוסקופ. זה מגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה של ניתוח נוסף בהשוואה לנתיחת ברוטו של פיסות רקמה. אמנם, LCM יכול להיות זמן ועבודה אינטנסיבית, היא אינה דורשת הכשרה או מומחיות נרחבות ו, כאשר בשילוב עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות, יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של תהליך ביולוגי כאשר תאים בדידים או אזורים אנטומיים משמשים.

<html> כל הרקמה מורכבת מאוכלוסייה הטרוזיגוטיים של תאים. זה רלוונטי במיוחד לרקמת מוח, בהיקף של נוירונים שונים מובחנים מורפולוגית ו / או neurochemically מוקף סוגים שונים של תאי גליה (oligodendrocytes, מיקרוגליה והאסטרוציטים). בנוסף, אזורים שונים במוח, כגון אזורים של גרעיני קליפה או גזע המוח, יש פונקציות ספציפיות. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות ספציפיות של תאים או באזורים שונים מבחינה אנטומית קטנים מאוד, בשילוב עם טכניקות אנליטיות (כלומר, Q-PCR, microarrays, RNA-רצף, ופרוטאומיקה), יכול לשפר במידה ניכרת ההבנה של תהליכים ביולוגיים שונים. LCM הוא טכנולוגיה המספקת את היכולת לבודד אזורים אנטומיים מאוד דיסקרטיים או תאים ספציפיים מהרקמה בשקופית מיקרוסקופ מתן הרבה יותר הומוגנית מקור לניתוח נוסף של מולקולות שונות, כגון RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA וחלבונים. t &quot;&gt; מאז LCM הוצג לראשונה, מספר גישות שונות שימשו לmicrodissect תאים מרקמות 1-3. הגישות המוקדמות כללו קובץ מצורף ישיר של רקמה בשקופית באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) וסרט תרמופלסטיים ואי שיטת קשר באמצעות אולטרא-סגול (UV) חיתוך לייזר לנתק תא או רקמה וגבייה לתוך צינור. בהמשך לכך, LCM שמש בהצלחה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאים והוצג להיות תואמת עם בידוד של מולקולות שונות לניתוח במורד הזרם כולל RNA, מייקרו-רנ&quot;א, DNA, חלבונים ו, הכולל את הפעילות האנזימטית 1,4-7. הנה LCM מודגם באמצעות מערכת LCM שנעשה שימוש בליזר UV חיתוך וליזר IR לכידה לחיתוך סביב תאים או רקמות וההצמדה ל כובע LCM, בהתאמה. מערכת זו משתמשת בשני LCM הלייזר ללכוד IR כדי להמס סרט פלסטיק על כובע מעל לתא או הרקמה של עניין שמתחבר לתאים סרט הפלסטיק ומסיר אותו מtהוא רקמה עם הסרת הכובע (איור 1). בנוסף, בשילוב עם לייזר IR, לייזר UV נגיש לחתוך מן רקמה או תאים של ריבית מהרקמה רכובה על שקופיות עם קרום מבודד אז על ידי הצמדת הרקמה לכובע LCM באמצעות לייזר IR (איור 2). סקירה קצרה של טכניקות אלה נמצאת באיורים 1 ו -2. כמה וריאציות על טכניקה זו מתוארות לכל אחד בודד תאים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה וטכניקה מודרכת אימונוהיסטוכימיה עקיפה המשמשת לבידוד של אזור של רקמה המבוסס על הביטוי של חלבון מסוים. באופן ספציפי, הבידוד של נוירונים דופמין מnigra substantia והבידוד של אזור tegmental הגחון והבידוד הבא של RNA מרקמת המוח טרי, קפואה מוצג. כRNA הוא יציב ביותר של מולקולות נמדדות (בהשוואה ל- DNA או חלבון), רח &#39;eps כדי לעזור לשמור על שלמות RNA כלולים והנתונים המוצגים על הכמות והאיכות של RNA שהושגה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:159px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Numer&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Veritas Laser Capture Microdissection System</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:121px;">Newer model is now sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">CapSure HS LCM Caps</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>LCM0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">PEN Membrane slides</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>s4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Silane prep-slides</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">95% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">100% Ethanol-RNase Free</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Rnase Free Triton</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MX1583D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Anti-Tyrosine hydroxyase antibody</td>
			<td style="width:191px;">EDM Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>Ab152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Stratagene MX 3005P</td>
			<td style="width:191px;">Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>401513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Nanodrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Quant-iT RiboGreen</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:191px;">Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection - a demonstration of the isolation of individual dopamine neurons and the entire ventral tegmental area

microdissection ללכוד לייזר (LCM) משמש כדי לבודד אוכלוסייה מרוכזת של תאים בודדים או אזורים אנטומיים מדויקים של רקמה מסעיפי רקמות על שקופיות מיקרוסקופ. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, LCM יכול לשמש כדי לבודד סוגי תאים בודדים המבוססים על סמן חלבון ספציפי. כאן, טכניקת LCM מתוארת לאיסוף אוכלוסייה ספציפית של נוירונים דופמין שכותרתו ישירות עם אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין ובידוד של נוירון דופמין המכיל אזור של אזור tegmental הגחון באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין העקיפה על סעיף סמוך לאלה המשמשים לLCM. לייזר ללכוד אינפרא אדום (IR) משמש לשניהם לנתח נוירונים בודדים, כמו גם את אזור tegmental הגחון את שקופיות זכוכית ועל כובע LCM לניתוח. התייבשות מוחלטת של הרקמה עם 100% אתנול וקסילן היא קריטית. השילוב של הלייזר ללכוד IR ואולטרה הסגול cutti (UV)לייזר ng משמש לבודד תאי עצב בודד או דופמין אזור tegmental הגחון בעת ​​שימוש בשקופיות קרום PEN. יש שקופית קרום PEN יתרונות משמעותיים על פני שקופיות זכוכית כפי שהוא מציע עקביות טובה יותר בלכידת ואיסוף תאים, הוא מהיר יותר איסוף חתיכות גדולות של רקמה, היא פחות סומך על התייבשות ותוצאות בהסרת הרקמה מהשקופית מלאה. למרות הסרת האזורים הגדולים של רקמה משקופיות זכוכית אינה ריאלי, זה הרבה יותר זמן רב ולעתים קרובות משאיר כמה רקמות שיורית מאחור. הנתונים שמוצגים כאן להוכיח כי ניתן להשיג RNA בכמות ובאיכות מספקות באמצעות נהלים אלה למדידות PCR כמותי. למרות RNA ו- DNA הם המולקולות הנפוצות ביותר המבודדים מרקמות ותאים שנאספו עם LCM, בידוד ומדידה של microRNA, חלבון ושינויים אפיגנטיים בDNA יכול גם ליהנות מהרזולוציה אנטומיים וסלולרית המשופרות שהושג באמצעות LCM.

<html> מיקרוסקופ איורים 6 ו 7 להדגים את יכולות בידוד של תאי עצב בודדים דופמין. הרזולוציה אנטומיים הנוכחית היא סביב 5-10 מיקרומטר כגודל הנקודה הקטן ביותר שניתן לייצר באופן עקבי על LCM כובעים לבודד תאים. המגבלה היחידה לבידודה של סוגי תאים מסוימים היא היכולת לדמיין את התאים. למרות LCM הוא מסוגל לבודד נוירונים בודדים דופמין, זיהום של חלקים של תאים ללא תווית צמודים ככל הנראה מתרחש. לכן, המדגם הסופי הוא אוסף מרוכז של נוירונים דופמין, לא אוכלוסייה טהורה של נוירונים דופמין. טכנולוגיה זו היא גם מסוגלת לבודד אזורים קטנים של רקמה כגון גרעינים או אזורים נפרדים במוח, כפי שמוצג בבידוד של אזור tegmental הגחון. פרסומים קודמים הוכיחו שימוש ברקמת המוח, כמו גם לבודד רקמה פתולוגית מהרקמה נורמלית 5,11. <html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; מכיוון שהשימוש הנפוץ ביותר של תאים ורקמות המבודדים באמצעות LCM הוא ניתוח RNA, הנהלים שהוצגו היו מוטבים כדי לשמור על שלמות RNA. על מנת לקבוע את האיכות של RNA שנשארה הבא LCM, RNA היה מבודד, באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות, מרקמות בשקופיות הבאות LCM, או לאחר הליך טירוזין המהיר hydroxylase ניאון אימונוהיסטוכימיה או הקיבעון באצטון. איכות RNA נמדדה ובהשוואה לערכים לRNA RNA מהמוח כולו זמין באופן מסחרי (איור 9). איכות RNA הופחתה בדגימות RNA מרקמות המשמשות לLCM עם יושרה נמוכה לאחר אימונוהיסטוכימיה (רין לא זמין) ואחריו קיבעון אצטון (רין 2.6) בהשוואה לRNA המוח כולו (רין 8.2) כפי שניתן לראות בירידה היחסית ב גובה שיא rRNA S28 לעומת שיא S18. עם זאת, RNA נשמר להקות 18S ו -28 וביטוי גנים יכול להימדד באמצעות Q-PCR. = &quot;Jove_content&quot;&gt; כדי למדוד את הכמות של RNA המתקבל מתאי העצב שנרכשו באמצעות LCM, נוירונים דופאמין (50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין) היו מבודד מאזור tegmental הגחון מעל שקופיות Silane-הכנה. RNA היה מבודד באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות והכמות של RNA נמדדה. בהתבסס על עקומת הסטנדרט שנוצרה, כולל של 17.3, 24.8 pg ו50.9 pg / μl היו מבודד מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 א). כדי למדוד כמות RNA עם Q-PCR, טווח ריכוזים של RNA המוח כולו וRNA מנוירונים דופאמין תומללו הפוכים וגן β-אקטין נמדד באמצעות Q-PCR כפי שתואר בעבר 5. בהתבסס על מדידות אלה, ריכוז של 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl חושבו מ -50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 ב). כדי להמחיש עד כמה בידוד של נוירונים דופמין משווה לבידודה של כל vאזור entral tegmental עם LCM, גנים ספציפיים נוירון דופמין (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) נמדדו עם Q-PCR בשני אלה סוגים שונים של דגימות והשוואה לביטוי של β-אקטין (איור 11). מאחר וערכי t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין. זו ממחישה כיצד הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין מרכז את הביטוי של גנים ספציפיים נוירון דופמין. בדגימות הגחון אזור tegmental, גנים ספציפיים נוירון דופמין הם בדילול החוצה כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) יהיה גם אספו המבטאים β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strong&gt; איור 1. לכידת לייזר באמצעות לייזר אינפרא אדום הלכידה (IR). יש כובע LCM הפלסטיק הקטן קרום בתחתית הממוקמת על גבי רקמה רכובה על גבי זכוכית (שלב 1). כאשר הרקמה או התא של עניין מזוהה, לייזר ללכוד IR הוא ירה דרך כובע LCM כדי להמס גומה קטנה בקרום על גבי רקמה / תא הבסיסי (שלב 2). כאשר כובע LCM מוסר, הרקמה היא להסיר את שקופיות מיקרוסקופ ונשארה מחובר לכובע LCM. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> איור 2. לכידת לייזר באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) לכידה ואולטרה הסגול (UV) חיתוך לייזר. על מנת לרכוש שטחים גדולים של רקמה או להקל על ההתאוששות של תאים באמצעות לייזר UV, רקמות הוא רכוב על שקופית עם קרום מחובר לשקופית לאורך הפינה מחוץ (שקופיות קרום PEN). כובע LCM מושם על tהוא רקמה והליזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום הכובע ולצרף את הרקמה לכובע LCM (שלב 1 ו -2). חיתוך לייזר UV משמש אז כדי לחתוך דרך הממברנה השקופיות ורקמות (שלב 3 ו -4), כך שכאשר הכובע מוסר הרקמה היא להסיר את השקופית ונשארת על כובע LCM (שלב 5). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> איור 3. לכידת הלייזר Microdissection מערכת מפת דרכים. יש מערכת Microdissection זה לייזר לכידת חלל במשך 3 שקופיות בכל פעם. כאשר שקופיות נטענות לתוך מיקרוסקופ, תמונות בהגדלה נמוכה מפת דרכים עבור כל שקופית נוצרות. בחירת אזור בתמונת מפת הדרכים מעבירה את חלון תמונת חיה לאזור זה. למטרות הדגמה, mesencephalon העכבר נותח לסעיף 10 מיקרומטר על 3 שקופיות. השקופית הראשונה שכותרתו עבור immunoreactivi hydroxylase טירוזיןty באמצעות diaminobenzidine ככרומגן (). סעיפים היו רכובים על שני שקופיות Silane-prep (B) או שקופיות קרום PEN (C). שתי שקופיות אלה תויגו באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין הניאון המהירה. חיצים ב( C) מצביעים על הזיקה של קרום PEN לשקופית הזכוכית. אין רקמה מחוץ גבול זה יכול להיות שנאסף עם LCM. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> איור 4. שימוש בלייזר ללכוד IR. הלייזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום כובע LCM לצרף את הרקמה לכובע LCM ולהסיר אותו משאר הרקמות. הלייזר ללכוד IR חייב להיות בכוח מספיק כדי להמס את קרום כובע LCM מספיק ליצור קשר עם שקופיות רקמות וזכוכית הבסיסיות. התמונה למעלה ממחישה כאשר הלייזר לא היה מספיק כדי להמס את הקרוםלשקופית (השאיר שתי נקודות). כאשר הקרום נמס נוגע שקופיות הזכוכית, קווי המתאר שחורים עבים ניתן לצפייה (מקום נכון). עוצמת הלייזר יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי המתח (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 μsec) ו# להיטים של הלייזר. בנוסף, חזר ירי של לייזר IR באותו המקום גם יכול להמס את הקרום נוסף. המטרה של לייזר IR צריכה להיות מותאמת בכל עת כובע LCM מועבר או כאשר המטרה היא שונה. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> איור 5. שימוש בUV חיתוך לייזר. חיתוך לייזר UV משמש לחיתוך דרך הממברנה PEN והרקמות. לפני השימוש בעוצמה המינימלית הדרושה כדי לחתוך את הקרום ורקמות צריכה להיות לקבוע מאז לייזר UV יכול לגרום נזק לרקמות. מעל, שלוש הנקודות (חצים) של עוצמות לייזר UV שונות מוצגות ב<html> גודל נקודה השמאלית מספיק לסעיפי 10 מיקרומטר, נקודת האמצע לחלקים עבים והמקום הנכון הוכחת עוצמת לייזר UV כי הוא גבוה מדי. סרגל = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> איור 6. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין באמצעות לייזר IR. נוירונים דופמין מוצגים לאחר תיוג ניאון מהיר עבור hydroxylase טירוזין (). כאשר לייזר IR הוא ירה המסת קרום כובע LCM על הנוירונים האלה (D), הסרת הכובע מרימה תאים אלה הנחה של השקופיות (B, E). אז יכולים להיות דמיינו נוירונים אלה כפי שצורפו לכובע LCM (C, F). בר סולם = 250 מיקרומטר.= יעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> איור 7. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין משקופיות קרום PEN באמצעות לייזרי IR ו- UV. Hydroxylase טירוזין נוירונים שכותרתו מוצגים לעיל (א &#39;). יכולים להיות מחוברים נוירונים אלה לכובע LCM באמצעות לייזר IR ולחתוך משקופית קרום PEN באמצעות לייזר UV (B). סרגל = 250 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> איור 8. עקיף<html> בידוד של אזור tegmental הגחון באמצעות immunoreactivity hydroxylase טירוזין. המיקום של נוירונים דופמין באזור tegmental הגחון היה דמיין בסעיף שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית (A ו- E). סעיף זה אימונוהיסטוכימיה שכותרתו שימש כתבנית לאתר את אזור tegmental הגחון בסעיפים בלא כתם סמוך (B ו- F). השימוש בליזר UV, אזור tegmental הגחון היה מחובר לכובע LCM עם לייזר IR ולחתוך מהשקופית עם לייזר UV (C ו- D) ומוצג מצורף לכובע HS LCM (D). אזור tegmental הגחון מבודד משקופיות Silane-prep רק באמצעות לייזר IR מוצג גם מחובר לכובע מאקרו (FK). שים לב שיש צורך יותר מניסיון אחד כדי לאסוף ביותר של הרקמה מאזור זה (השווה G ו- J). בר סולם = 500 מיקרומטר.טען / 52,336 52336fig8large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> איכות איור 9. RNA. electropherograms נציג ותמונות ג&#39;ל הקשורים של RNA זמין מסחרי המוח כולו () ו- RNA מבודד מסעיפים לאחר קיבוע אצטון וLCM (B) או אימונוהיסטוכימיה המהירה ניאון hydroxylase טירוזין וLCM (C). למרות איכות RNA הופחתה בסעיפי מעובד אימונוהיסטוכימיה, בהשוואה לRNA המוח כולו, electropherograms להפגין RNA בעיקר שלם המבוסס על הנוכחות של פסגות rRNA S18 וS28. ריכוז RNA המוח כולו היה 6.487 pg / μl עם רין של 8.2. ריכוז RNA רקמה הקבוע אצטון היה 5.036 pg / μl עם רין של 2.6. הושג RNA לאחר שעות אימונוהיסטוכימיה<html> מודעת ריכוז של 4.474 pg / μl ורין לא היה זמין. <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> כמות RNA איור 10.. כדי לקבוע את הכמות של RNA בתאי עצב שהושגו עם LCM, עקומת תקן של ריכוזי RNA הופקה באמצעות fluorospectrometer וQ-PCR. למדידות fluorospectrometer (), הגרף הגדול מציג את הטווח גבוה יותר של כמויות RNA והגרף הקטן מציג את הרגישות של assay זה עד 10 pg / μl. ריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היו 17.3, 24.8 ו50.9 pg / μl, בהתאמה. שימוש Q-PCR למדוד כמויות RNA (B), הריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היה 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl, בהתאמה. es / ftp_upload / 52,336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; ריכוז איור 11. של גנים ספציפיים נוירון דופמין עם הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין. ההבדל בt C (t ΔC) בין גני נוירון דופמין ספציפיים (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) וβ-אקטין בדגימות של תאי עצב דופמין באזור tegmental הגחון מבודד עם LCM בהשוואה לביטוי בניתוחים של אזור tegmental הגחון כל מוצגים. מאחר וערכי t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) תהיה ייאסף בדגימות אזור tegmental הגחון המבטאות β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area at JoVE.com

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

שיטה להרוויח Craniotomy על גולגולת הגחון של מכרסמים ילוד

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...