Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at

Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

OPMERKING: Alle procedures werden goedgekeurd door The Royal Victorian oog en oor Animal Research &amp; Ethische Commissie Ziekenhuis (RVEEH AEC; # 10-199AB). De proefpersonen werden behandeld volgens de National Health en &quot;Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden&quot; Medical Research Council (2013) en de &quot;Preventie van Wreedheid tegen Dieren Act&quot; (1986; en amendementen). Alle chirurgische, klinische procedures beoordeling en elektrofysiologische werden uitgevoerd onder verdoving uitgevoerd en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. 1. Enucleatie en Fixatie LET OP: Volg de in detail beschreven in de metgezel manuscript 16 enucleatie en fixatie procedure, waarbij extra zorg rond apparaat kabels of vitrectomie poorten, indien aanwezig. Kort gezegd houdt dit in: <ol><li> Transcardiaal perfuse het onderwerp met warme zoutoplossing, gevolgd door koude neutrale bufferode formaline. </li><li> Bind hechtingen aan de oogbol te dienen als oriëntatiepunten. </li><li> Ophelderen het oog 16, het handhaven van het apparaat kabels en eventuele bevestiging van patches / tabbladen. </li><li> Post-fix het oog in Davidson&#39;s oplossing voor 18-36 uur. </li><li> Transfer naar 50% ethanol gedurende 6-8 uur. </li><li> Transfer naar 70% ethanol en in de koelkast (4 ° C) tot dissectie. </li></ol> 2. Elektrode verwijderen en Dissection. Opmerking: Niet alle epiretinale implantaten hetzelfde formaat hebben, maar in het algemeen zal er een elektrode-array en een vorm van flexibele en vervormbare dragermateriaal. Apparaten die zijn geplakt op de retina hebben een tack opening van het metalen tack dringt de matrix en de achterkant van het oog, waarbij deze samen. <ol><li> Visualiseer het implantaat en het punt waar het is bevestigd aan het netvlies. <ol><li> Met behulp van een 15 graden mes maken een rondlopende trans-hoornvlies incisie en verwijder het hoornvlies dop om expose de onderliggende iris en de lens. </li><li> Met 15 graden mes disinsert de zonulavezels van de lens en verwijder de lens in toto, waardoor de achterste kamer met epiretinale implantaat en de metalen tack in situ. </li></ol></li><li> Afhankelijk van het implantaat en de studie wordt uitgevoerd, verwijder vreemde componenten voordat verdere dissectie. Opmerking: In dit voorbeeld, de epiretinale matrix geëvalueerd bestond uit een prototype hermetische diamant elektrode en electronica gehuisvest in een conforme silicone drager (geproduceerd huis, zie 20). <ol><li> Hier, zorgvuldig uit de diamant elektrode pakket door fijne dissectie met een scalpel. Laat de siliconen lichaam van het implantaat met de retinale tack en de restanten van de platinum bedrading (figuur 2). Als een embedded-array / behuizing is geen onderdeel van het ontwerp apparaat in onderzoek, dan slaat u deze stap (2.2). </li></ol></li><li> Voorzichtigontleden een monster dat de tack en het omliggende weefsel in de gewenste richting omvat. Gebruik fijne dissectie scharen volledige dikte stroken gesneden uit de achterkant van het oog, zoals sclera, choroidea en retina. Neem een monster dat een longitudinale dwarsdoorsnede van de tack geeft, waarin alle retinale lagen naast de tack (figuur 2) OPMERKING: De gewenste oriëntatie voor de steekproef kan verschillen, afhankelijk van de gewenste bepaald resultaat. Bijvoorbeeld, wil men de nabijheid van de tack beschadiging van de optische schijf dan de optische schijf moet worden opgenomen in het monster onderzocht. </li></ol> 3. Uitdroging, Embedding, Montage, Slijpen, kleuring, en Imaging <ol><li> Dehydrateer de steekproef over drie dagen in progressieve ethanol fasen: <ol><li> Tweemaal Dehydrateer het monster in 70% ethanol gedurende 2 uur. </li><li> Tweemaal uitdrogen het monster in 80% ethanol gedurende 2 uur en vervolgens O / N. </li><li> Uitdrogen van de steekproef in 90% ethanol gedurende 2 uur twice. </li><li> Tweemaal uitdrogen het monster in 100% ethanol gedurende 2 uur en vervolgens O / N. </li></ol></li><li> Tweemaal Dehydrateer het monster in 100% aceton gedurende 2 uur. <ol><li> Verwijder het monster uit de aceton en observeren onder een lichtmicroscoop als het lucht-droogt bij kamertemperatuur. Breng het monster tot epoxy (zie stap 3.4), net voordat het begint te krullen / instorten. LET OP: Het verwijderen van vloeistof uit de zachte weefsels resultaten in ingestort cellen en krimp. Een appreciatie van wanneer het weefsel curling / instorting optreedt is ontwikkeld met de ervaring. </li></ol></li><li> Bereid medische kwaliteit epoxyhars volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Om het harden Gebruik een 55 ° C gedurende 1 uur of 24 uur bij KT. Plaats in een vacuümkamer gedurende ~ 5 min bij -50 mbar voor het verwijderen van luchtbellen. Reguleren van het vacuüm handmatig als een buitensporige vacuüm wordt het epoxy mengsel veroorzaken aan de kook en ontgassen zal niet effectief optreden OPMERKING: Voer stap 3.3 gelijktijdig met stap 3.2. </li><li> De samp insluitenle in heldere epoxyhars. Dompel het oogweefsel in ontgast epoxy in een geschikte afsluitbare container en laat O / N bij RT te genezen. </li><li> Zorg ervoor dat het monster in de gewenste richting (figuur 2) insluiten door het formaat en de re-embedding de uitgeharde epoxy blok. Opnieuw insluiten de aangepaste regel met het oogweefsel zodanig dat de lange as van de tack is evenwijdig aan de bodem van de vorm (gele cup - Figuur 3A). </li><li> Monteer de hars in een knarsend monsterhouder en maal het monster (230-250 rpm met water op, handmatig slijpen) met behulp van siliciumcarbide papier (beginnend met 800 net; Figuren 3C en 3E). </li><li> Voor het kleuren, dip de ondergrond in toluïdineblauw vlek voor 3-5 minuten, of totdat vlek ontwikkelt (figuur 3F). </li><li> Spoel met leidingwater (Figuur 3G). </li><li> Afbeelding van de grondoppervlakte van het monster met een hoog vermogen dissectie ruimte om de cellulaire lagen van het visualiserenretina (Figuur 3H). Breng een druppel gedestilleerd water op het bovenoppervlak van de epoxy boven het monster tot de diffractie op de air-epoxy-interface glad. Gebruik een optische vezel &#39;zwanenhals&#39; lichtbron om het monster te verlichten. </li><li> Herhaal stap 3,6-3,9 telkens slijpen afstand een vooraf bepaalde dikte van het monster (minimaal nauwkeurige en reproduceerbare malen toename van preparaathouder 20 pm). </li></ol>

<ol>
	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Standaard histologische technieken zijn niet moeilijk metalen implantaten in situ verwerken vanwege beperkingen in deze scherpe voorwerpen van metaal, glas of zelfs diamantbladen. In onze metgezel papier 16 hebben we aangetoond dat het gebruik van een gemodificeerde proef met hele-eye kunstmatig netvlies delaminatie kunnen verminderen. In de huidige manuscript, een gevestigde slijpen en polijsten techniek voor het visualiseren van cochleaire implantaten 21-23 in situ werd aangepast voor retinale prothesen. Een titanium tack, die een elektrode array om de retina te beveiligen, epiretinally werd ingebed in epoxy met de omringende oogweefsel. Deze hars blok werd vervolgens passend georiënteerd en geleidelijk grond / gepolijst om de weefselmorfologie direct naast het metaal tack onthullen. Beelden van het gepolijste oppervlak van het blok op verschillende diepten zijn gemaakt met een krachtige dissectie microscoop. Deze techniek is nuttig voor: visualiseren en evaluating de weefselreactie naast de epiretinale implantatie; het chirurgisch trauma geassocieerd met implantatie van het implantaat te evalueren; de biologische reactie op de vaste metaalcomponenten bepalen; en de afstand tussen het implantaat en het oppervlak van het netvlies te meten. Deze techniek zal nuttig voortaan veiligheidsstudies voor in situ visualisatie van het gebied grenzend aan een retinale tack of een ander hard (bijvoorbeeld metalen) voorwerpen in het oog. Dit heeft directe toepassing in de beoordeling van de preklinische veiligheid van prothesen geplakt op het netvlies epiretinally. Het kan ook nuttig zijn voor het evalueren van weefselschade in retinale gebieden in contact met implantaten in de sub-retinale locatie. Er zijn verschillende manieren om te controleren of de techniek correct is uitgevoerd. In elke fase moet het netvlies blijven zitten aan de buitenste lagen van het oog. Indien sprake is van grove artefactuele netvliesloslating, kan dit indicaten een probleem met de fixatie. Wanneer het monster is ingebed en opnieuw georiënteerd in de uiteindelijke hars blokkeren de retina nabij orthogonaal het slijpen vlak van het blok moet worden; dit zal schuin snijden minimaliseren. Het is nuttig om te controleren of het aantal incrementele slijpen stappen (bekende stapgrootte) nodig om een ​​voorwerp doorlopen (bijvoorbeeld een retinale tack) dienovereenkomstig correleren met de afmetingen van het object. De techniek kan worden geoptimaliseerd op verschillende manieren. Krassen op het oppervlak van de epoxy blok geassocieerd met het maalproces kan worden gereduceerd met steeds fijnere polijsten. Voor de onderhavige studie, gebruikten we 800, 1000, 1200, 2400, 4000 en silicium carbide papier. Diamant pasta kan ook worden gebruikt om het oppervlak te verbeteren. Een hogere beeldkwaliteit Een fijnere afwerking geeft, maar ten koste van extra polijsten tijd. Een andere belangrijke overweging voor het verbeteren van de uitkomst van deze techniek is de keuze en kwaliteit van de optics en verlichting gebruikt voor het maken van foto&#39;s. Andere basis histologische kleuringen - bijzonder Nissl vlekken, kan worden gebruikt in plaats van toluïdineblauw, maar kan verdere optimalisatie vereisen. Sommige vlekken de hars en het weefsel (bijvoorbeeld eosine), dus een ondiepe polish kunnen na kleuring met achtergrond verkleuring te verwijderen vlek. Gespecialiseerde vlekken, fluorescerende kleurstoffen en immunohistochemische kleuring werd niet geprobeerd, maar tenzij een specifiek resultaat gewenst is, de tijd die nodig is om deze vlekken te voeren op elk maalgraad waarschijnlijk onbetaalbaar zijn. Echter, kan het mogelijk zijn om het weefsel als geheel vlek voor de inbedding stap (stap 3.4) 24. De belangrijkste beperking van deze techniek is dat zodra het gebied van belang is weg gemalen, kan niet worden teruggehaald, dus is het verstandig om veel (eventueel redundant) beelden op verschillende vergrotingen in elke fase van slijpen en polijsten vangen. Het isook belangrijk om kleine stappen gebruiken voor elke slijpen diepte. Een andere beperking van deze techniek is dat de optische vergroting en resolutie vergeleken met weefsel aangebracht op een glasplaatje en bekeken met een standaard (transmissie) lichtmicroscoop. Voor de toepassing van prototyping en het beoordelen van de veiligheid van een nieuw implantaat, de bruto pathologische evaluatie is van primair belang. Deze techniek biedt een efficiënte methode voor het observeren van klinisch relevante schade in verband met een retinale tack. Met de praktijk, de totale tijd die nodig is om te slijpen, polijsten te verzamelen en te fotograferen een gegeven monster (een keer embedded) is vergelijkbaar met de tijd zou nemen om deel een paraffineblok of bevroren sectie. Er is ook het potentieel voor de huidige technieken te worden uitgebreid tot toepassingen buiten het bereik van retinale implantaten. Deze techniek is geschikt voor het beoordelen van het weefsel grenzend aan een vaste implantaat, waarbij het implantaat extractie is niet feasible of zou de interface beschadigen. Bijvoorbeeld kan deze techniek worden uitgebreid met implantaten gemaakt van metaal (bijvoorbeeld platina, nitinol, enz.) Die niet met gebruikelijke histologische technieken worden gesneden, evalueren, zoals een diepe hersenen of perifere zenuwen elektroden, canules voor geneesmiddelafgifte, vasculaire stents of orthopedische prothesen.

Retinitis pigmentosa (RP) is een erfelijke aandoening die wijdverspreide verlies van fotoreceptoren, die de cellen in de buitenste laag van het netvlies verantwoordelijk voor het transduceren licht worden veroorzaakt, in de vorm van fotonen in neurale activiteit. Belangrijk patiënten met RP hebben typisch residuele neuronen in de andere lagen van de retina die nog functioneel. Retinale prothesen zijn in staat om het herstel van een aantal beperkte visie om deze patiënten door zich te richten deze overlevende neuronen met elektrische stimulatie om hun visuele pad 1,2 activeren. Perceptuele uitkomsten van klinische studies hebben aangetoond veelbelovende eerste resultaten en recent sommige apparaten zijn goedgekeurd voor commercieel gebruik. Momenteel zijn er drie belangrijke anatomische locaties waar klinische retinale prothesen zijn geplaatst: epiretinally 3,4, 5,6 en subretinally suprachoroidally 7,8. Verschillende apparaten maken gebruik van verschillende materialen en hun vorm is aangepastde plaats waar zij worden geïmplanteerd. Echter, ze maken visuele waarnemingen door activering van de overblijvende neuronen van de retina met elektrische pulsen. Er is de mogelijkheid van een medische prothese beschadigen omringende weefsel door mechanische effecten van de initiële plaatsing of latere lopende krachten. Voor implanteerbare stimulatoren zoals retinale prothesen, is er het extra overweging dat de elektrische parameters moeten binnen veilige grenzen. Veiligheid van de patiënt staat voorop, dus apparaten moeten grondig worden getest in preklinische studies alvorens naar een klinische setting 9-15. In onze metgezel artikel beschreven we een methode voor de beoordeling van de gelokaliseerde histopathologie van het oog rond een implantaat geplaatst in de suprachoroïdale ruimte 16. In dit manuscript beschrijven we een techniek voor het visualiseren oogweefsel rond een elektrode-array geplakt op het netvlies epiretinally, in een preklinische (felijn) model (figuur 1). De epiretinale locatie is het meest gebruikte positie voor het lokaliseren van een visuele prothese. Elektrodenstelsels hier ligt typisch aangebracht op het netvlies met een metalen tack dat alle lagen van het oog 17-20 doordringt. Voorafgaand aan de in de onderhavige manuscript beschreven technieken, was het moeilijk om de retinale en andere weefsels onmiddellijk rondom een ​​tack nauwkeurig te beoordelen. Standaard oogfixatie met neutrale gebufferde formaline gevolg kunstmatig netvlies schade door differentiële beweging van de retina en sclera tegen het vaste punt van de boeg. Daarom geen werkelijke schade veroorzaakt door de tack en epiretinale scala kon niet nauwkeurig worden nageleefd. Bovendien kan snijden oogweefsel niet worden uitgevoerd met de retinale tack in situ metalen voorwerpen niet gemakkelijk kan worden gesneden met traditionele histologische inrichting; het verwijderen van de tack voordat histologische bewerking was ookongewenst aangezien hieruit bovendien artefactuele retinale schade. Het doel van dit onderzoek was tweeledig: 1) tot netvliesloslating artefact te verminderen, zodat eventuele schade veroorzaakt door de tack en de epiretinale implantaat reeks betrouwbare wijze kan worden beoordeeld; en 2) de retinale architectuur naast de tack visualiseren zonder het te verwijderen. Om doelstelling 1 te bereiken, werd een nieuwe proef met gebruikt (zoals beschreven in het begeleidend artikel 16), die kunstmatig netvlies delaminatie vermindert. Om doelstelling 2 te bereiken, hebben we aangepast een inbedding, slijpen en polijsten techniek, oorspronkelijk ontwikkeld voor in situ observatie van een cochleair implantaat elektroden 21-23. De in dit manuscript beschreven methoden is het mogelijk de visualisatie van het netvlies omgeving en grenst aan een tack in situ, terwijl het minimaliseren artefactuele schade aan het netvlies en het daardoor mogelijk een nauwkeurige evaluatie van de mogelijke schade veroorzaakt door de tack en epiretinale array.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

De fixatie protocol artefactuele onthechting en delaminatie van het netvlies 16 aanzienlijk verminderd. Stand van het monster in de epoxy blok werd constant bereikt met behulp van de beschreven twee-staps inbedding proces. De incrementele slijpen procedure vereist een beperkte mate van handvaardigheid om optimale resultaten te bereiken, maar werd geholpen door de instelbare monsterhouder die prima controle over de increment resolutie verstrekt. In alle gevallen (n = 5) de tack stond en gemalen / gepolijst met wenselijk en consistente resultaten. De retinae grenzend aan de spijkers waren oplosbare en adequaat gekleurd. Polijsten van het oppervlak van de epoxyhars blok met een rang P # 800 siliciumcarbide papier was voldoende om het de cellulaire macrostructuur van het ingebedde weefsel. Hogere kwaliteit papier of diamond slurry kan worden gebruikt voor het verder polijsten op een gegeven diepte indien gewenst. Een dissectie microscoop en glasvezel &#39;zwanenhals&#39; light bron bleek geschikt voor beeldvorming van het grondoppervlak blok en de ingebedde weefselmonster zijn. De positie van de lichtbron werd gevarieerd proefondervindelijk naar een locatie en hoek die de beste verlichting en contrast door de microscoop gaf vinden. Een druppel gedestilleerd water aan het oppervlak van het blok toevoegen, boven het monster was nuttig lichtpad diffractie en / of gladde verstoringen op epoxy luchtinterface verminderen. Figuur 4 toont bijvoorbeeld afbeeldingen netvliesweefsel gevisualiseerd direct naast een titanium retinale overstag met deze techniek. Niet-artefact netvliesloslating en vouwen te zien aan weerszijden van de silicone (Figuur 4A). De tack as is zichtbaar ingebed in siliconen; het hoofd van de tack heeft het netvlies en de sclera doorgedrongen. Er is niet kunstmatig netvlies in de ongekleurde retina weerszijden van het silicone (figuur 4C). De techniek heeft aangetoond dat, in dit geval There is netvlies desorganisatie naast de kleverigheid en compressie van het netvlies aan één zijde door een schuine insteekhoek. Merk op dat de beelden weergegeven zijn slechts illustraties van het succes van de techniek niet representatief tack-schade histopathologie algemeen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Plaatsing van een epiretinale elektrodenarray. (A) Schematische weergave van het oog toont een vergrote dwarsdoorsnede van het achterste sclera, choroid en gedegenereerde retina (ontbreekt fotoreceptoren). Een elektrode array wordt afgebeeld in blauw, epiretinally aangebracht. (B) computerondersteund tekening van een epiretinale elektrode-array. een geïntegreerd circuit (&#39;chip&#39;) en de elektrode-pakket; b, titanium retinale overstag; c, medische siliconen behuizing; d, lood uitgang. Paneel A gewijzigd ten opzichte van een originele illustratiop verstrekte hoffelijkheid van Bionic Vision Australia, copyright Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Elektrode verwijderen en ontleding van het oog. Hoge dynamische bereik macro foto van een ontkernde katachtige oog met epiretinale tack in situ. (A) Voeg fixatie Davidson&#39;s fixatief om retinale architectuur 16 behouden, werd de ontkernde ogen ontleed. De elektrode-array pakket werd verwijderd uit de silicone drager (gestippelde vierkant outline bepaalt oorspronkelijke locatie van elektrode-reeks) de tack (pijl) en siliconen lichaam van het implantaat overgebleven. (B) Het oog werd ontleed met de langsdoorsnede naast de kleverigheid(Stippellijn). Het tuig blijft ingebed in de achterste wand van de oogschelp (pijl), gestabiliseerd voornamelijk door de sclera. Het gedeelte weefsel dat de tack werd voorbereid hars inbedding en malen (rechts segment), terwijl het deel het netvlies onder de verwijderde elektrode-reeks werd bereid voor standaard histologische verwerking 16 (linker segment). Een liniaal met stappen van 0,5 mm wordt getoond aan de onderkant van elk paneel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Epoxy inbedding en malen van de tack en netvliesweefsel. Foto&#39;s van de epoxy ingebedde en uitgelijnd weefselmonster, slijpen, vlekken en beeldvorming van de tack en netvliesweefsel. (A) De tac<html> k monster werd ingebed in een epoxyhars blok. De mal werd het monster georiënteerd zodat het langsvlak parallel aan de bodem van de vorm. (B) De uitgeharde epoxy blok met de tack monster. (C) De epoxy blok is in een malende monsterhouder geplaatst, klaar voor slijpen . (D) Het monster werd zodanig georiënteerd belichte gedeelten van de bodem weefsel bevatten de retinale cellagen en langsas van de tack. (E) Het monster werd gemalen met siliciumcarbide papier op een roterende molen. (F) De grondoppervlakte het blok werd gekleurd met toluïdine blauw aan de retinale lagen te identificeren. (G) Het blok werd gespoeld in leidingwater om overtollige vlek te verwijderen. (H) De toluïdineblauw gebrandschilderde retinale lagen en tack werden afgebeeld met behulp van een hoog aangedreven dissectie scope. ad / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Hoge en lage macht beelden van de tack en het netvlies. Op verschillende punten tijdens het maalproces beelden zijn gemaakt met een dissectie scope, die in de lengte secties van de tack (sterretje) penetreren door het oog en het verlaten van de sclera (&#39;S&#39; ), grenzend aan siliconen (hekje) en toluïdineblauw gekleurd en ongekleurd netvlies (&#39;R&#39;). Let ook hier bijvoorbeeld afbeeldingen alleen deze visualisatie techniek tonen en zijn niet representatief voor alle epiretinale implantaat of tack insertie histologie resultaten. Ground overblijfselen van de platina bedrading zijn zichtbaar in panelen AD (&#39;W&#39;). (A) Laag stroomverbruik, onbesmet beeld van de tack het penetreren van de retina en de sclera. (B) Zeer krachtige beeld van de netvliesloslating en vouwen in unstained netvlies aangrenzende om de siliconen drager A. (C) image Lage macht afbeelding in het midden van de tack as. <strong&gt; (D) High power beeld van het centrum van de tack in afbeelding C (E) In een afzonderlijk monster, zonder siliconen vervoerder een krachtige beeld van toluïdineblauw gebrandschilderde netvlies onder de tab gevest getoond, onmiddellijk voorafgaand aan slijpen van de tack as (F) Normale toluïdineblauw gebrandschilderde retinale architectuur (GCL: retinale ganglion cellaag; INL: binnenste nucleaire laag; ONL: buitenste nucleaire laag; PR: fotoreceptoren; T: katachtige tapetum lucidum). gevisualiseerd met behulp van dezelfde slijptechniek . Schaalbalken in elk paneel zijn: A en C = 2 mm; B en D = 500 urn; E = 200 pm; F = 100 urn.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at 

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor gelokaliseerde Histopathologisch Analyse: Part 2 Epiretinal Implantaten met Retina Kopspijkers

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kwantitatieve fundus autofluorescentie voor de beoordeling van Netvliesaandoeningen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Een acute retinale model voor het evalueren van Blood Retina Barrier Breach en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Bestuderen van Diabetes door de ogen van een vis: Microdissection, visualisatie en analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal therapieën

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Biotribologische testen en analyse van gewrichtskraakbeen glijden tegen metaal voor implantaten

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...