Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at

Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

MERK: Alle prosedyrer ble godkjent av The Royal Victorian øye og øre Hospital Animal Research &amp; Ethics Committee (RVEEH AEC; # 10-199AB). Fagene ble behandlet i henhold til National Health and Medical Research Council er &quot;Australian Code of Practice for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål&quot; (2013) og &quot;Prevention of Cruelty å Animals Act&quot; (1986, og endringer). Alle kirurgiske, klinisk vurdering og elektrofysiologiske prosedyrer ble utført under narkose og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. 1. enucleation og Fixation MERK: Følg enucleation og fiksering prosedyre som er beskrevet i detalj i følges manuskript 16 ekstra godt tatt vare rundt enhets kabler eller vitrektomi porter, hvis det finnes. I korthet innebærer dette: <ol><li> Transcardially perfuse emnet med varmt saltvann etterfulgt av kald nøytral bufferød formalin. </li><li> Knytte suturer til øyeeplet for å tjene som landemerker. </li><li> Enucleate øyet 16, opprettholde enhets kabler og eventuelle feste patcher / faner. </li><li> Post-fikse øyet i Davidson løsning for 18 - 36 timer. </li><li> Overføre til 50% etanol for 6 - 8 timer. </li><li> Overføre til 70% etanol og avkjøl (4 ° C) til disseksjon. </li></ol> 2. Elektrode Fjerning og Dissection. MERK: Ikke alle epiretinal implantater vil ha samme formfaktor, men generelt vil det være et elektrodesystem og noen form for fleksibel og formbar bærematerialet. Enheter som er stiftet til netthinnen har en tack hull der metallet tack penetrerer matrise og baksiden av øyet, holde disse sammen. <ol><li> Visualiser implantatet og punktet der det er festet til netthinnen. <ol><li> Ved hjelp av en 15 graders blad lage en omkrets trans-hornhinne snitt og fjerne hornhinnen cap til expose de underliggende iris og linse. </li><li> Ved hjelp av en 15 graders blad, disinsert de zonular fibrene i linsen og fjerne linsen i toto, utsette bakre kammer med epiretinal implantat og metall tack in situ. </li></ol></li><li> Avhengig av implantatet, og undersøkelsen blir utført, å fjerne overflødige komponenter før ytterligere disseksjon. NB: I det foreliggende eksempel, epiretinal matrisen under evaluering besto av en prototype hermetisk diamant elektrode og elektronikkpakke plassert innenfor et konformt silikonbærer (produsert i huset, refererer til 20). <ol><li> Her, forsiktig trekke diamant elektrode pakken ved fint disseksjon med en skalpell. Forlate silikon kroppen av implantatet sammen med retinal halser og restene av platina ledningsnett (figur 2). Hvis en innebygd matrise / bolig er ikke en del av enhet utforming under etterforskning, så utelate dette trinnet (2.2). </li></ol></li><li> Nøyedissekere en prøve som inneholder halser og omkringliggende vev i ønsket retning. Bruk tynne disseksjon saks for å klippe full tykkelse strimler fra baksiden av øyet, inkludert sclera, årehinnen og netthinnen. Ta en prøve, noe som gir et lengdesnitt av et slag som viser alle de netthinnens lag ved siden av tack (figur 2) NB: Den ønskede orientering for prøven kan variere avhengig av den bestemte ønskede resultatet. For eksempel, hvis en ønsker å undersøke nærhet av klebe skade på den optiske disken og deretter den optiske disken skal bli inkludert i prøven. </li></ol> 3. Dehydrering, Inkludering, Montering, Sliping, Farging, og bildebehandling <ol><li> Dehydrere prøven over tre dager i progressive etanol stadier: <ol><li> Dehydrere prøven i 70% etanol i 2 timer to ganger. </li><li> Dehydrere prøven i 80% etanol i 2 timer to ganger og deretter O / N. </li><li> Dehydrere prøven i 90% etanol for 2 timer twice. </li><li> Dehydrere prøven i 100% etanol i 2 timer to ganger og deretter O / N. </li></ol></li><li> Dehydrere prøven i 100% aceton i 2 timer to ganger. <ol><li> Fjern prøven fra aceton og observere den under et lysmikroskop som det Lufttørker på RT. Overfør prøven til epoxy (se trinn 3.4) like før det begynner å krølle / kollaps. MERK: Hvis du fjerner væske fra de myke vev resulterer i sammenraste celler og krymping. En styrking av når vevet curling / kollaps inntreffer er utviklet med erfaring. </li></ol></li><li> Forberede medisinsk karakter epoxy i henhold til produsentens anvisninger. For å herde harpiksen, bruke enten 55 ° C i 1 time eller 24 timer ved romtemperatur. Plasser i et vakuumkammer for ~ 5 minutter ved ~ 50 mbar for å fjerne luftbobler. Regulering av vakuumet manuelt som en overdreven vakuum vil bevirke at epoksy blandingen til å koke, og avgassing vil forekomme effektivt MERK: Utfør trinn 3.3 samtidig med trinn 3.2. </li><li> Bygge inn SAMPle i klar epoxy. Fordype øyevevet i avgasset epoxy på en hensiktsmessig lukket beholder, og la O / N ved RT for å kurere. </li><li> Vær nøye med å legge prøven i ønsket retning (figur 2) ved å endre størrelse og re-embedding den herdet epoksy blokken. Gjen legge inn ny størrelse av blokken som inneholder den øyevevet, slik at den lange akse av klebrighet er orientert parallelt med bunnen av formen (gul kopp - Figur 3A). </li><li> Montere harpiksen i en sliping prøveholder og male prøven (230-250 rpm med vann på, manuell sliping) med silisiumkarbid papir (starter med 800 rutenett, figurene 3C og 3E). </li><li> Til farging, dypp bakken i toluidinblått flekk i 3 - 5 min, eller til flekken utvikler (Figur 3F). </li><li> Skyll med vann fra springen (figur 3G). </li><li> Bilde første overflaten av prøven med en høy effekt disseksjon omfang å visualisere de cellulære lag avhinnen (figur 3 H). Påføre en dråpe destillert vann på den øvre overflate av epoksy over prøven for å glatte diffraksjon ved luft-epoksy-grensesnitt. Bruk en optisk fiber &#39;svanehals&#39; lyskilde for å belyse prøven. </li><li> Gjenta trinn 03.06 til 03.09, hver gang slipe bort en pre-set tykkelse av prøven (minimum nøyaktig og reproduserbar sliping tilveksten av prøveholder er 20 mikrometer). </li></ol>

<ol>
	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Standard histologiske teknikker kan ikke behandle harde metallimplantater i situ på grunn av begrensninger i å kutte disse objektene med metall, glass eller til og med diamantblader. I vår ledsager papir 16, viste at bruken av et modifisert hel-øyefiksjon teknikk kan redusere kunstig retina delaminering. I dagens manuskript, etablert en sliping og polering teknikk for å visualisere cochlea implantat 21-23 in situ ble modifisert for retinal proteser. En titan klebrighet, som brukes for å feste en elektrode array til retina, epiretinally, ble innleiret i epoksy med det omgivende øyevevet. Denne harpiksblokk ble deretter orientert på passende måte og progressivt bakken / polert for å avdekke vevet morfologi umiddelbart tilstøtende til metall klebrighet. Bilder av den polerte overflate av blokken ved forskjellige dybder ble tatt med en kraftig disseksjon mikroskop. Denne teknikken kan brukes til: visualisering og evaluating vevsrespons tilstøtende til epiretinal implantat; for å vurdere det kirurgiske traumer forbundet med implantering av implantatet; å bestemme den biologiske reaksjonen til den harde metallkomponentene; og å måle avstanden mellom implantatet og overflaten av netthinnen. Denne teknikken vil være nyttig i fremtidige sikkerhetsstudier for in situ visualisering av området ved en retinal klebrighet eller andre harde (f.eks metalliske gjenstander) i øyet. Dette har direkte anvendelse i vurderingen av prekliniske sikkerhets av proteser tacked til netthinnen epiretinally. Det kan også være nyttig for å evaluere vevsskade i retinale regioner i kontakt med implantater som ligger i under retinal sted. Det er flere måter å bekrefte at teknikken er utført korrekt. På hvert trinn, må netthinnen forbli festet til de ytre lag av øyet. Hvis det er brutto kunstig netthinneavløsning, kan dette indiskespiste et problem med fiksering. Når prøven er innleiret og re-orientert i den endelige harpiks blokkere hinnen bør være nær vinkelrett med slipe-flate av blokken; Dette vil minimere skrå skjæring. Det er nyttig å kontrollere at antall enkeltoppmalingstrinn (med kjent trinnstørrelse) som kreves for å traversere et objekt (så som en retinal tack) korrelerer derfor med dimensjoner av objektet. Teknikken kan optimaliseres på flere måter. Riper på overflaten av epoxyblokk forbundet med maleprosessen kan reduseres med progressivt finere polering. For denne studien, brukte vi 800, 1000, 1200, 2400, og 4000 siliciumcarbidprodukt papir. Diamantpasta kan også brukes til å forbedre overflatefinishen. En finere overflatefinish gir et bilde med høyere kvalitet, men på bekostning av ekstra polering tid. En annen kritisk faktor for å forbedre utfallet av denne teknikken er valget og kvaliteten på optics og belysning brukes for bildeopptak. Andre grunnleggende histologiske flekker - spesielt Nissl flekker, kan brukes i stedet for toluidinblått, men kan kreve ytterligere optimalisering. Enkelte flekker vil farge harpiksen samt vev (f.eks eosin), og derfor et grunt polish kan være nødvendig etter farging for å fjerne bakgrunns misfarging. Spesialiserte flekker, fluorescerende fargestoffer og immunhistokjemisk farging ble ikke forsøkt, men med mindre et meget bestemt resultat er ønsket, er sannsynligvis å være prohibitive den tid som kreves for å utføre disse flekker på hver sliping nivå. Imidlertid kan det være mulig å sette flekker på vevet som et hele før innstøping trinn (trinn 3.4) 24. Den største begrensningen med denne teknikken er at når den regionen av interesse er blitt slipt bort, det kan ikke bli hentet frem, derfor er det klokt å fange opp mange (muligens overflødige) bilder på en rekke forstørrelser på hvert trinn i sliping og polering. Det erogså viktig å bruke små trinn for hver sliping dybdejustering. En annen begrensning ved denne teknikk er at den optiske forstørrelse og oppløsningen sammenlignet med vev som er montert på et objektglass og betraktet med en standard (transmisjon) lysmikroskop. Ved anvendelsen av prototyping og vurdere sikkerheten av en roman implanteringsanordning, er brutto patologisk evaluering av primær interesse. Denne teknikken gir en effektiv metode for å observere klinisk relevant skader forbundet med en retinal tack. Med praksis, den totale tiden det tar å samle grind, polsk og fotografere et gitt eksemplar (en gang innebygd) kan sammenlignes med den tiden det ville ta å seksjonen en parafinblokk eller frosne delen. Det er også potensialet for de foreliggende teknikker til å bli utvidet til anvendelse utenfor omfanget av retinale implantater. Denne teknikken er egnet for evaluering av vev naboliggende til en hard implantat, hvor implantatet ekstraksjon ikke er feasible, eller ville skade grensesnittet. For eksempel, kan denne teknikken bli utvidet til å evaluere implantater laget av metall (f.eks, platina, nitinol, etc.) som ikke kan bli spaltet med konvensjonelle histologiske teknikker, slik som noen dype hjernen eller perifere nerve elektroder, kanyler for medikamentlevering, vaskulære stenter eller ortopediske proteser.

Retinitis pigmentosa (RP) er en arvelig sykdom som forårsaker utbredt tap av fotoreseptorer, som er cellene i det ytterste laget av retina ansvarlig for å overføre lys, i form av fotoner, inn nevral aktivitet. Viktigere, pasienter med RP har vanligvis rest nevroner i de andre lagene i sin netthinnen som fortsatt er funksjonell. Retinal proteser er i stand til å gjenopprette noe begrenset syn til disse pasientene ved å målrette disse overlevende nevroner med elektrisk stimulering for å aktivere sin visuelle pathway 1,2. Perseptuelle resultater fra kliniske studier har vist lovende tidlige resultater og nylig noen enheter har blitt godkjent for kommersiell bruk. For tiden er det tre hoved anatomiske steder der kliniske retinal proteser har blitt plassert: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 og suprachoroidally 7,8. Forskjellige enheter utnytte ulike materialer og deres form er tilpassettil det sted hvor de er implantert. Men de alle skape visuelle persepter ved å aktivere restnerveceller i netthinnen med elektriske pulser. Det er potensial for enhver medisinsk protese å skade omgivende vev på grunn av mekanisk virkning av den første plassering eller etterfølgende kontinuerlige krefter. I tilfelle av implanterbare stimulatorer, slik som retinale proteser, er det ytterligere betraktning at de elektriske parametre bør være innenfor trygge grenser. Pasientsikkerhet er viktig, så enheter må nøye testet i prekliniske studier før det skifter til en klinisk innstilling 9-15. I vår ledsagende artikkelen, har vi beskrevet en fremgangsmåte for vurdering av den lokaliserte histopatologi av øyet som omgir et implantat plassert i det suprakoroidale rommet 16. I den nåværende manuskriptet, beskriver vi en teknikk for å visualisere øye vevet rundt en elektrodesystem tacked til netthinnen epiretinally, i en preklinisk (felinje) modellen (figur 1). Den epiretinal plassering er den mest vanlig anvendt posisjon for lokalisering av en visuell protese. Elektrodegrupper som ligger her er vanligvis festet til netthinnen med en metall stift som trenger inn i alle lagene av øyet 17-20. Før teknikkene beskrevet i den nåværende manuskriptet, var det vanskelig å vurdere nøyaktig retinal og andre vev umiddelbart rundt slaget. Standard øyefiksjon hjelp nøytral bufret formalin resulterte i kunstig retinal skade på grunn av differensial bevegelse av netthinnen og sclera mot den faste punktet i tack. Derfor noen faktiske skader forårsaket av halser og epiretinal utvalg ikke kunne være nøyaktig observert. I tillegg seksjonering øyevevet kunne ikke utføres med retinal klebrighet in situ som metallgjenstander ikke lett kan skjæres med tradisjonell histologisk apparat; fjerne tack før histologisk behandling var ogsåuønsket, da dette også ført til kunstig retinal skade. Målet med denne studien var todelt: 1) å redusere netthinneavløsning artefakt slik at eventuelle skader forårsaket av tack og epiretinal implantat matrisen kan bli pålitelig vurderes; og 2) for å visualisere retinal arkitektur tilstøtende til klebrighet uten å fjerne den. For å oppnå målet 1, ble en ny fikseringsteknikk anvendes (som beskrevet i den tilhørende artikkelen 16), som reduserer kunstig retina delaminering. For å oppnå målet 2, endret vi en forankring, sliping og polering teknikk, opprinnelig utviklet for in situ observasjon av cochleaimplantat- elektroder 21-23. Metodene beskrevet i dette manuskriptet tillater visualisering av netthinnen rundt og ved siden av en tack in situ samtidig minimere kunstig retinal skade og derfor tillater nøyaktig vurdering av eventuelle skader forårsaket av halser og epiretinal array.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Fiksering protokollen vesentlig redusert kunstig avløsning og delaminering av netthinnen 16. Orientering av prøven innenfor epoxyblokk ble oppnådd konsekvent ved hjelp av den beskrevne to-trinns prosess innstøping. Inkrementell sliping prosedyre krevde en moderat grad av fingerferdighet for å oppnå optimale resultater, men ble hjulpet av den justerbare prøveholder som ga god kontroll over tilveksten oppløsning. I alle tilfeller (n = 5) tack lå og malt / polert med ønskelige og konsistente resultater. Den retinae ved siden av stifter var løses og farget riktig. Polering av overflaten av epoksyharpiksen blokk med en karakter P # 800 silisiumkarbidpapir var tilstrekkelig til å avbilde den cellulære makrostruktur av den innebygde vev. Høyere grad av papir eller diamant slurry kan anvendes for ytterligere å polere overflaten på en hvilken som helst gitt dybde hvis ønskelig. En disseksjon mikroskop og optisk fiber &#39;svanehals&#39; light kilden ble funnet å være egnet for avbilding av overflaten av grunnblokken og den innebygde vevsprøve. Posisjonen til lyskilden ble variert ved prøving og feiling for å finne en posisjon og vinkel som ga den beste belysning og kontrast gjennom mikroskopet. Tilsetning av en dråpe destillert vann på overflaten av blokken, over prøven, var nyttig for å redusere lysbanen diffraksjon og / eller glatte forvrengninger på epoxy luftgrensesnittet. Figur 4 viser eksempel bilder av netthinnevev visualisert i umiddelbar nærhet av en titan retinal tack hjelp av denne teknikken. Ikke-kunstig netthinneavløsning og folding kan sees på begge sider av silikon (figur 4A). Tack skaftet er synlig innebygd i silikon; leder av tack har trengt netthinnen og sclera. Det er ikke-kunstig netthinneavløsning i de ufargede retina hver side av silikon (figur 4C). Teknikken har vist at, i dette eksempel, there er retinal uorden i tilknytning til klebrighet og komprimering av netthinnen på den ene side på grunn av en skrå innføringsvinkel. Legg merke til at bildene som presenteres er bare illustrasjoner av suksessen av teknikken, ikke er representative for tack-skade histopatologi generelt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figur 1. Plassering av et epiretinal elektrodesystem. (A) Skjematisk diagram av øyet som viser et forstørret tverrsnitt av den bakre sklera, årehinnen og netthinnen degenerert (mangler fotoreseptorer). Et elektrodesystem er avbildet i blått, festet epiretinally. (B) dataassistert-tegning av en epiretinal elektrodesystem. en integrert krets (&#39;chip&#39;) og elektrode pakken; b, titan retinal tack; c, medisinsk silikon bolig; d, bly avkjørselen punktet. Panel En modifisert fra en original illustrerpå gitt courtesy of Bionic Vision Australia, opphavsrett Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figur 2. Elektrode fjerning og disseksjon av øyet. High Dynamic Range makro fotografier av en enucleated feline øye med epiretinal tack in situ. (A) Post fiksering med Davidsons fiksativ for å bevare retinal arkitektur 16, ble den enucleated øye dissekert. Det elektrodesystem pakken ble fjernet fra silikonbærer (stiplet firkant omriss indikerer opprinnelige plassering av elektrodegruppen) med halser (pil) og silikondelen av implantatet værende. (B) Øyet ble dissekert med den langsgående tverrsnitt ved siden av tack(Stiplet linje). Tack forblir innebygd i bakre veggen av øyemusling (pil), stabilisert hovedsakelig av sclera. Vevet delen inneholder tack var forberedt på harpiks embedding og sliping (høyre segment), mens den delen som inneholder netthinnen under den fjernede elektrodesystem ble forberedt for standard histologisk behandling 16 (venstre segment). En linjal med intervaller på 0,5 mm er vist nederst på hvert panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figur 3. Epoxy embedment og sliping av halser og retinal vev. Fotografier av epoxy innebygd og justert vevsprøve, sliping, beising og bildebehandling av halser og retinal vev. (A) tac<html> k prøve ble innleiret i en epoksyharpiks blokk. Ved hjelp av støpeformen, ble prøven orientert slik at den langsgående plan er parallell med bunnen av formen. (B) Den herdede epoksy-blokk som inneholder klebeprøven. (C) Epoksy-blokken ble montert i en prøveholder slipe, klar for sliping . (D) Prøven ble orientert slik avbildes deler av bakken vev inneholder de retinale cellulære lag og lengdeaksen til klebrighet. (E) Prøven ble malt ved hjelp av silisiumkarbid i papir på en roterende kvern. (F) Bakken overflaten blokken ble farget med toluidinblått å identifisere de retinale lag. (G) Blokken ble skylt i ledningsvann for å fjerne overskudd av flekken. (H) Den toluidin blå farget retinale lag og klebe ble fotografert ved anvendelse av en høy drevet disseksjon omfang. annonse / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figur 4. Høye og lave kraft bilder av halser og netthinnen. På ulike tidspunkt i maleprosessen bildene ble tatt med en dissekere omfang, viser lengdesnitt av tack (stjerne) trengende gjennom øyet og spennende sclera (&#39;S&#39; ), tilstøtende silikon (hasj) og toluidinblått farget og unstained netthinnen (&quot;R&quot;). Oppmerksom på disse er eksempel bilder bare for å demonstrere den nåværende visualisering teknikk, og er ikke representative for alle epiretinal implantat eller tack innsetting histologiske resultater. Bakke restene av platina ledninger er synlige i paneler AD (&quot;W&quot;). (A) Lavt strømforbruk, unstained bilde av tack trengende netthinnen og sclera. (B) Høy drevet bilde av netthinneavløsning og folding i unstained retina tilstøtende til silikon bærer i bilde A. (C) Lavt strømforbruk bildet i midten av tack aksel. <strong&gt; (D) Høy effekt bilde av midten av tack i bilde C. (E) I en separat prøve, uten silikon bærer, er en høy drevet bilde av toluidinblått farget netthinnen under tack Hilt vist, umiddelbart før sliping tack aksel (F) Normal toluidinblått farget retinal arkitektur (GCL: Gangliecelle lag, INL: indre kjernefysisk lag, onl: ytre kjernefysisk lag, PR: fotoreseptorer, T: feline tapetum lucidum). visualisert ved hjelp av samme sliping teknikk . Skala barer i hvert panel er: A og C = 2 mm; B og D = 500 um; E = 200 um; F = 100 mikrometer.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at 

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Teknikker for Processing Eyes implantert med en retinal protese for Lokalisert Histopatologisk analyse: Del 2 Epiretinal Implantater med retina Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Kirurgiske Prøver Bruke Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Teknikker for Processing Eyes implantert med en retinal protese for Lokalisert Histopatologisk analyse

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

En trinnvis protokoll for subretinal Surgery i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akutt retinal modell for evaluering Blood Netthinne Barrier på brudd og mulige narkotika for behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

Bruk av Retinal Imaging demens

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Studere Diabetes gjennom øynene til en fisk: Microdissection, visualisering og analyse av den voksne tg(fli:EGFP) sebrafisk Retinal blodkar

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Biotribologisk testing og analyse av leddbrusk glidende mot metall for implantater

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...