Name: functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health National Institute of Allergy and Infectious Diseases (IAA nummer AOD12058-0001-0000) en het Defense Threat Reduction Agency - Joint Science and Technology Office, Medical S &amp; T Division (subsidie ​​nummers CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 en CBM.THRTOX.01.RC.014). Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl PB hield een Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associate Award en KH hield een National Research Council Research Associate Award. Wij danken Angela Adkins en Kaylie Tuznik (USAMRICD) voor technische bijstand; en Cindy Kronman (USAMRICD) voor redactionele ondersteuning. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en komen niet overeen met het officiële beleid van het Ministerie van het Leger, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering.

1. Aanpassing van de SER om Celvrije Suspension Cultuur Feeder <ol><li> Ontdooi SER bij 37 ° C totdat een plakje ijs blijft. </li><li> Met een pipet P1000, zacht overdracht 1-2,5 x 10 6 gedissocieerd SER een niet-weefselkweek behandelde schotel met 10 ml voorverwarmde ESC medium. Incubeer in een bevochtigde weefselcultuur incubator gedurende 20 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na 20 uur, wassen cellen door voorzichtig overdracht van de suspensiekweek een 15 ml conische buis met 10 ml serologische pipet. Pellet SER gedurende 3 min bij 200 x g. Tijdens het centrifugeren, voeg 10 ml vers ESC medium terug naar lage wrijvingscoëfficiënt gerecht. </li><li> Zuig supernatant, zorg om te voorkomen dat loskomen van de cel pellet, en voeg 1 ml vers ESC medium tot pellet cel. Overdracht cellen om de bacteriële schotel met een P1000 pipet en terug naar de incubator. </li><li> Let cellen dagelijks tot aggregaten met het blote oog (meestal 4 worden - 8 dagen (d) aggregaten 0,2- 0.5 mm). Als aggregaten zijn niet zichtbaar na 4 d Herhaal stap 1.3. Zodra aggregaten zijn zichtbaar, distantiëren en onderhouden van de SER, zoals beschreven in hoofdstuk 2. </li></ol> 2. ESC Passage en Onderhoud <ol><li> Transfer ESC aggregaten aan een 15 ml conische buis met een steriele 10 ml pipet en laat aggregaten om zich te vestigen op een compact pellet (meestal 3-5 min). Zuig het supernatant en voorzichtig om te voorkomen dat het verstoren van de cel pellet, en was aggregaten met 5 ml PBS. Hoewel zwaartekrachtbezinking aanbevolen alternatief pellet cellen bij 100 xg gedurende 2,5 minuten plaats om tijd te besparen. </li><li> Aspireren PBS en voeg 500 ul trypsine. Incubeer aggregaten trypsine gedurende 3 minuten in een waterbad bij 37 ° C. Voeg 500 ul ESC medium om de trypsine te verdunnen en zachtjes vermaal 10 keer met een P1000 pipet te breken aggregaten. Tellen cellen met een hemocytometer. </li><li> Pellet gedissocieerde cellen gedurende 3 min bij 200 xg en resuspendeer cellen om een ​​eindconcentratie van 1,0x 10 7 cellen / ml in medium ESC. Transfer 150 ul (1,5 x 10 6 cellen) tot 10 ml vers ESC medium in een 10 cm schaal bacteriële en terugkeren naar weefselkweek incubator gedurende 48 uur. Excess SER te onderscheiden, gecryopreserveerd bij 1-5 x 10 6 cellen / ml in 90% ESC medium aangevuld met 10% DMSO, of weggegooid. </li><li> Passage aggregaten elke 48 uur. Aggregaten klaar voor doorgang zal zijn duidelijk zichtbaar, met een diameter van meer dan 0,5 mm. OPMERKING: Ontdooien en cultuur van gecryopreserveerde, geveerde aangepaste cellen worden bereikt per stappen 1,2-1,4. 72 uur - aggregaten zal klaar zijn voor passage binnen de 48 zijn. </li></ol> 3. neuronale differentiatie OPMERKING: Conduct stappen 3,1-3,5 voorafgaand aan de middag en stap 3.7 na de middag. Een overzicht van de differentiatie procedures is weergegeven in figuur 1A. <ol><li> Distantiëren SER als in de stappen 2,1-2,5. Transfer 350 ul (3,5 x 10 6) van dissociaatd SER om een ​​10 cm lage-attachment schotel met 25 ml differentiatie medium. Plaats op een schudapparaat ingesteld op 30-45 rpm in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Dit is de eerste dag van differentiatie, aangeduid dagen in vitro (DIV) -8. OPMERKING: Het gebruik van een ultra-laag bevestiging schotel verhoogt de kosten van de werkwijze, maar geeft iets betere opbrengsten dan bacteriële petrischalen omdat aggregaten af ​​kan hechten petrischalen. Als ander gerecht maten hebben de voorkeur, kunnen middelgrote volumes en mobiele nummers dienovereenkomstig worden aangepast. </li><li> Na 48 uur (DIV -6), gebruikt een 25 ml pipet om de differentiërende celaggregaten overgebracht in een 50 ml conische buis. Voeg onmiddellijk een nieuwe 25 ml differentiatiemedium de petrischaal. </li><li> Laat aggregaten tot meer dan 2 vestigen - 5 min, het produceren van een zichtbare pellet dat is 1-2 mm diep. Negeer enkele cellen of kleine aggregaten die nog in suspensie. Zuig het medium zorgvuldig en breng de cell pellet terug naar de petrischaal met een P1000. Leg ze op rotatieschudinrichting in een weefselkweek incubator. </li><li> Bij DIV -4 herhaal stap 3.2. De pellet wordt 2-4 mm diep. Breng 30 ml differentiatie medium aangevuld met 6 uM all-trans retinoïnezuur (RA) naar de petrischaal. Keer terug naar rotatieschudinrichting in de weefselkweek incubator voor een extra 48 uur. </li><li> Bij DIV -2 herhaal stap 3.3. De pellet wordt 4-8 mm diep op dit punt. </li><li> Bij DIV -1, bereiden plating oppervlakken zoals in deel 4. </li><li> Bij DIV 0 ontdooien 5 ml pre-hoeveelheden verdeeld en bevroren NPC trypsine medium bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten en in een weefselkweek kap. Met behulp van een 25 ml pipet, overdracht onderscheiden aggregaten in een 50 ml conische buis. Laat aggregaten om zich te vestigen en zorgvuldig aspireren medium. Was pellet tweemaal met 10 ml PBS, waardoor de aggregaten te vestigen tussen de wasbeurten. </li><li> Na de tweede PBS-wassing, voeg 5 ml NPC trypsinisatie medium om de pellet en incubeer bij 376; C gedurende 5 min. Tik zachtjes tegen de buis na 2,5 min. </li><li> Voeg 5 ml 0,1% sojaboontrypsineremmer (STI) trypsine te inactiveren en meng door. Vermaal voorzichtig 10-15 maal met 10 ml serologische pipet tot een betrekkelijk homogene celsuspensie wordt geproduceerd. </li><li> Langzaam breng de celsuspensie tot 40 urn of 70 urn cel zeef in de top van een 50 ml conische buis. Zodra alle schorsing is gefilterd, voeg 1 ml N2 medium tot overige cellen te wassen door het filter en pellet de gedissocieerde celsuspensie gedurende 6 min bij 200 x g. </li><li> Zuig medium zonder de pellet te verstoren. Was de cellen tweemaal met 10 ml N2 medium, pelletiseren cellen gedurende 5 min bij 200 xg en tritureren tussen wassingen met een P1000. Voorafgaand aan de tweede wassen, tellen cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Resuspendeer cellen in N2 medium bij 1 x 10 7 cellen per ml en plaat ESNs bij een celdichtheid van 150.000 - 200.000 cellen / cm2. </li><li> Transfer nieuw plated ESNs een bevochtigde weefselcultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2 en zoals in sectie 5 handhaven. </li></ol> 4. Voorbereiding Cultuur Oppervlakken voor Plating Neural Voorlopers bij DIV 0 <ol><li> Bereid weefselkweek behandeld gerechten ten minste 1 dag voor plating. Voeg voldoende polyethyleenimine (PEI; 25 ug / ml in steriel H2O) of poly-D-lysine (PDL, 100 ug / ml in steriel H2O) dekking weefselkweek behandelde plastic schaaltjes en geïncubeerd O / N bij 37 ° C. </li><li> De ochtend van plating, afwassen tweemaal met tweemaal gedestilleerd H 2 O en een keer met PBS. Na de laatste wasbeurt, vul dan voldoende N2 medium om de schotel te dekken (bijvoorbeeld 1 ml per putje van een 12-putjes of 4 ml per 6 cm schotel). </li><li> Bereid 18 mm dekglaasjes minstens één dag voorafgaand aan neuron plating. Clean dekglaasjes door plasma reiniging gedurende 4 min. </li><li> Onmiddellijk overdracht gereinigd dekglaasjes een ethanol gewassen parafilm op de bodem van eensteriel grote schaal en voeg 400 ul van PEI of PDL oplossing, bereid zoals in stap 4.1. Incubeer O / N bij 37 ° C in een weefselkweek incubator. </li><li> In de ochtend was dekglaasjes driemaal met water en voeg 5 ug / ml laminine in PBS gedurende 1-3 uur bij 37 ° C. Vóór dissociatie neuronen, zuigen de laminine en onmiddellijk over het dekglaasje op een putje van een 12 putjes bevattende 1 ml NPC medium, waarbij u de behandelde zijde omhoog houden. </li><li> Store gerechten en dekglaasjes bij 37 ° C tot NPC&#39;s zijn klaar om de plaat. </li></ol> 5. Onderhoud van Neuronen <ol><li> Bij DIV 1, aspireren middelgrote en te vervangen door N2 kweekmedium. </li><li> Bij DIV 2 en 4, aspireren middelgrote en te vervangen door B27 kweekmedium. </li><li> Bij DIV 8, aspireren middelgrote en te vervangen door B27 kweekmedium met mitotische remmers te elimineren besmetten niet-neuronale cellen. </li><li> Bij DIV 12, te vervangen door B27 kweekmedium. </li><li> Verwijder niet DIV12 + ESNs van 5% CO 2 tot gebruik. </li></ol> 6. Gemeten Remming van synaptische transmissie (MIST) Assay voor het kwantificeren van Miniatuur prikkelende Post-synaptische Stromingen LET OP: De Clostridium neurotoxinen zijn de meest giftige stoffen waarvan bekend is, met een geschatte menselijke LD 50 waarden zo laag als 0,1-1 ng / kg. Verkrijgen noodzakelijke goedkeuringen voorafgaand aan het gebruik van deze toxines en gebruik de juiste voorzorgsmaatregelen. <ol><li> Verdunnen zorgvuldig BoNT / A om de gewenste uiteindelijke concentratie in ESN kweekmedium en warm tot 37 ºC 100x. Voeg het juiste volume van de toxine naar DIV 21 + ESN culturen, zwenk de cultuur schotel, en terug te keren naar incubator. </li><li> Als cellen worden geanalyseerd meer dan 4 uur na intoxicatie, voeg toxine aan de schaal en swirl zonder het verwijderen van 5% CO2, zoals direct in de incubator of in een constante CO 2 kamer. </li><li> Op gepaste tijdstip, aspirate ESN kweekmedium en twee keer wassen met extracellulaire buffer (ERB). Voeg 4 ml van ERB, aangevuld met 5,0 uM tetrodotoxin en 10 uM bicuculline, het blokkeren van actiepotentialen en tegenwerken van GABA A receptor activiteit, respectievelijk. </li><li> Transfer schotel naar elektrofysiologie rig. Noch perfusie noch temperatuurbeheersing vereist voor de MIST assay. </li><li> Trek borosilicaatglas met behulp van een micropipet trekker naar een opname pipet met 5-10 mQ van weerstand te produceren en te vullen met de intracellulaire opname buffer. Dip voorzichtig gevuld opname pipet in siliconiseerproces reagens voorafgaand aan de opname. </li><li> Met behulp van een met lucht gevulde spuit, bieden positieve druk als de opname pipet wordt neergelaten in de ERB. Na voorzichtig de landing van de opname pipet op de soma van het neuron op te nemen, te verwijderen positieve druk en vormen een gigaseal. Verlaag het bedrijf spanning tot -70 mV. Toepassing negatieve druk in te breken in whole-cell configuratie zorgvuldig. </li><li> Schakelen naar de huidige-klem te controleren en vast te leggen rust membraanpotentiaal. Zonder correctie voor vloeibare junction potentials, zal de rust membraanpotentiaal tussen -67 tot -82 mV. </li><li> Voer een continue -70 mV voltage-clamp-opname voor 4-5 min tot miniatuur prikkelende postsynaptische stromingen (mEPSCs) op te sporen. </li><li> Analyseer 4 min van de geregistreerde gegevens voor mEPSC detectie met behulp van spike detectie software met de volgende instellingen: Threshold, 5; Periode om een ​​lokaal maximum te zoeken, 10.000 gsec; Tijd voordat een piek voor baseline, 5000 gsec; Tijd om te zoeken een vervaltijd, 20.000 gsec; Fractie van piek tot een verval tijd te vinden, 0,37; Periode om een ​​baseline gemiddeld 1.000 gsec; Ruimte drempel, 20; Het aantal punten dat de gemiddelde piek, 1; Richting van de piek, negatief. </li><li> Verzamelen informatie over gedetecteerde gebeurtenissen op te slaan. Verdeel het aantal gedetecteerde gebeurtenissen in 4 min met 240 aan de mEPSC frequentie in Hz te bepalen. </li><li> Verzamel mEPSC frequenties voor 8-12 controls en 8-12 BoNT-behandelde monsters voor elke opname staat. Analyseer frequentie tegen leeftijd en veel gematchte controles. Bepaal de statistische significantie van% remming van synaptische activiteit met een ANOVA test en Dunnett&#39;s post-hoc test. </li></ol>

<ol>
	<li>Simpson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+steps+in+botulinum+toxin+action.">Identification of the major steps in botulinum toxin action.</a> Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).</li><li>Singh, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+neurotoxin+structure,+engineering,+and+novel+cellular+trafficking+and+targeting.">Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting.</a> Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).</li><li>Larsen, J. C. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Army+botulinum+neurotoxin+(BoNT)+medical+therapeutics+research+program:+past+accomplishments+and+future+directions.">Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions.</a> Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).</li><li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists.">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+quantitative+detection+of+botulinum+neurotoxin+in+neurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).</li><li>Mesngon, M., McNutt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Latrotoxin+Rescues+SNAP-25+from+BoNT/A-Mediated+Proteolysis+in+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons.</a> Toxins. 3, 489-503 (2011).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Whitemarsh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+human+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+highly+sensitive+botulinum+neurotoxin+detection.">Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection.</a> Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).</li><li>Hubbard, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+derivation+of+enriched+glutamatergic+neurons+from+suspension-cultured+mouse+ESCs+for+neurotoxicology+research.">High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research.</a> BMC Neurosci. 13, 127 (2012).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).</li><li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines:+formation+of+visceral+yolk+sac,+blood+islands+and+myocardium.">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+RNA+sequencing+of+the+deep+transcriptome+during+neurogenesis+of+cortical+glutamatergic+neurons+from+murine+ESCs.">Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs.</a> F1000Research. 2 (35), (2013).</li><li>Gut, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+stem+cell-derived+neurons+to+evaluate+the+time-+and+dose-dependent+progression+of+excitotoxic+injury.">Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury.</a> PLoS One. 8, e64423 (2013).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Capek, P., Dickerson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+the+deadliest+toxin:+technologies+for+botulinum+neurotoxin+detection.">Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection.</a> Toxins. 2, 24-53 (2010).</li><li>Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+interactions+in+vivo:+evidence+from+botulinum+A,+C,+D+and+E+action+at+frog+neuromuscular+junction.">Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction.</a> The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).</li><li>Baskaran, P., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+effects+of+botulinum+neurotoxin+a+on+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction.</a> Muscle &amp; Nerve. 50, 206-215 (2014).</li></ol>

The U.S. Government has filed two international patent applications that incorporate methods described in this article: PCT/US2014/22042, titled &#8220;Methods of detecting neurotoxin using synaptic activity&#8221;; and PCT/US13/40641, titled &#8220;Toxin detection using stem cell-derived neurons.&#8221;

De huidige gouden standaard voor CNT detectie, serotype bepaling en kwantificering is de MLA. De MLA ondervraagt ​​het hele scala van gastheer: toxine interacties nodig intoxicatie optreden in vivo (bijvoorbeeld toxine binden aan een celoppervlak receptor internalisatie van het toxine-receptor complex, LC translocatie naar het cytoplasma, LC-gemedieerde klieving van substraat en remming van synaptische neurotransmissie) 18. Hoewel de MLA biedt een fysiologisch relevant model van intoxicatie, is arbeidsintensief, kan worden verstoord door verontreinigingen en omvat grote aantallen muizen met de dood als eindpunt. Alternatief hebben celgebaseerde proeven voor BoNT detectie en kwantificering beperkt tot primaire neuron culturen, en moeten er gebruik dier of neuroblastoma cellijnen die niet aan synapsen vormen en typisch vertonen slechte gevoeligheid voor neurotoxinen 8. Tot op heden zijn de meeste metingen van intoxicatie in these-cel-gebaseerde platforms hebben vertrouwd op detectie van de proteolytische splitsing van SNAP-25, VAMP1 / 2 of syntaxine-1 11. Dit is problematisch omdat SNARE eiwitten splitsing is aangetoond dat niet-lineair verband met synaptische remming in vivo en kan derhalve niet nauwkeurig intoxicatie of nuttige leden tegen intoxicatie 19,20. Een ideale basis van cellen modelsysteem voor CNT detectie zou (i) be-neuron gebaseerd; (Ii) synaptically worden gekoppeld aan neurotypic elektrische reacties; (Iii) zeer gevoelig voor alle CNT serotypes of subtypen; en (iv) bieden schaalbaarheid, doorvoer en testtijden die gelijk aan of beter dan de MLA, tegen lagere kosten en zonder gebruik dier. Om aan deze eisen te voldoen, ontwikkelden we een methode om grote hoeveelheden sterk verrijkt, genetwerkte culturen in de door glutamaat en GABA-erge neuronen produceren uit de handel verkrijgbare muis ESC lijnen. We ontwikkelde vervolgens de MIST-test te kwantificerensynaptische inhibitie in reactie op intoxicatie met tent en BoNT / A- / G. Terwijl de MIST test kan worden uitgevoerd op elke synaptically actieve neuron bevolking (bv, primaire neuronen of plakjes hersenen), momenteel ESNs zijn de enige in vitro verkregen neuron model dat reproduceerbaar ontwikkelt emergent netwerk gedrag en is daarom geschikt voor de MIST-test. Het produceren van voldoende hoeveelheden van neuronen van de gedefinieerde lijn voor CNT studies die nodig zijn verschillende innovaties op ESC cultuur en differentiatie. Ten eerste, door het selecteren van en kweken SER dat suspensie aanpassing kunnen overleven, verwijderen we de mogelijke verontreiniging van voedingscellen en de noodzaak voedingscellen zuiveren van SER begin differentiatie. Hoewel de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen schorsing aanpassing onbekend zijn, vering aangepast SER blijven mitotically actief, behouden Oct3 / 4 expressie en blijven neurogene te zijn. Met deze methode ~ 1,5 x 10 7 ESC&#39;s zijn meestal hersteld elke passage. Ten tweede, de productie van NPC verhoogd -300% door het opnemen mechanisch roeren agglomeratie tijdens differentiatie voorkomen, ogenschijnlijk toenemende voedingsstoffen toegang tot het interieur van aggregaten. Tijdens het proces, we vonden dat de serum voor ESC cultuur en neuronale differentiatie is de meest kritische component behoud neurogene SER. Voor de beste succes, raden wij ophanging aanpassen ES cellen om elke partij van het serum en de aanleg van voorraden serum bij -20 ° C tot ESC cultuur en neuronale differentiatie ondersteunen door middel van de vervaldatum. Zoals bij de meeste synaptisch actieve culturen, DIV 14 + ESNs zeer gevoelig zijn abrupte pH en zelfs korte blootstelling aan de atmosferische CO2 concentraties leiden tot neurotoxiciteit binnen 24 uur. Voor experimenten die behandeling van culturen, gevolgd door incubatie blijvende O / N of langer, neuronen moeten direct worden behandeld in de incubator of overgedragen aan een constante CO 2 ruimte voor experimenten. Verschillende technieken bevestigde neurogenese en neuronale rijping, zoals ICC, transcriptionele profilering en whole-cell patch-clamp elektrofysiologie. Tijdelijke veranderingen in genexpressie en neuron morfologie waren consistent met een snelle doorloop door de ontwikkelingsstadia van neurogenese en door DIV 16 ESNs vertoonden prikkelende en remmende miniatuur postsynaptische stroom met opkomende netwerk gedragingen 16. Bewijs van synaptische activiteit gesuggereerd dat ESNs de pathofysiologie verantwoordelijk voor de klinische verschijnselen van botulisme en tetanus kunnen repliceren. Dit werd bevestigd door nevel die intoxicatie met BoNT / A / G of TeNT verminderde mEPSC frequenties&gt; 95% vergeleken met met drager behandelde of onbehandelde neuronen vertonen. Metingen van de gevoeligheid van MIST voor BoNT / A aangeduid een mediane remmendeconcentratie (IC50) van 0.013 pM (equivalent aan 0,5 muis dodelijke eenheden / ml) en een maximum-van-detectie onder 0.005 pM, gemeten 20 uur na bad toevoeging. Op basis van deze waarden, MIST ongeveer tweemaal zo gevoelig als en 2-4 maal sneller dan de MLA en 30-voudig gevoeliger dan immunoblot gebaseerde detectie van gesplitst SNAP-25. Tezamen zijn deze gegevens suggereren dat genetwerkte populaties van stamcellen afgeleide neuronen bieden een fysiologisch relevante, cel-gebaseerde model van intoxicatie. In combinatie met verbeterde methoden om genetwerkte ESN culturen ontlenen-ophanging aangepast SER, moet het gebruik van MIST de noodzaak van dierproeven en de daaraan verbonden nadelen, kosten en ethische bezwaren van de MLA te verminderen terwijl het verstrekken van een snelle, gevoelige en specifieke maatregel van intoxicatie. Hoewel whole-cell patch-clamp elektrofysiologie is een low-throughput-methode voor het identificeren van de aanwezigheid van actieve neurotoxinen, het biedt een resolutie en speed dat niet haalbaar is met behulp van moleculaire methoden. Deze bevindingen laten ook zien dat de toepassing van de activiteit-afhankelijke methoden synaptische activiteit beoordelen en netwerk gedrag snelle en specifieke detectie van neurotoxinen mogelijk. Dergelijke hogere throughput benaderingen zou mechanistische studies, therapeutische screening of diagnostische assays haalbaar is voor een breed scala aan neuromodulatory middelen, waaronder de CNT te maken.

Het algemene doel van deze methode is om synaptische activiteit functioneel evalueren in genetwerkte culturen van stamcellen afgeleide neuronen blootgesteld aan clostridium neurotoxinen. Dit is de eerste demonstratie van een in vitro model dat functioneel afgeleide replica van de pathofysiologie belast klinische manifestaties van botulisme en valideert ESNs als een geschikt model voor detectie van CNTs therapeutische screening en mechanistische studies. Bonts zijn zeer dodelijke bacteriële neurotoxins geproduceerd door leden van de Clostridium species. Inbegrip van de onlangs voorgestelde BoNT / H, hebben acht antigenetisch verschillende BoNT serotypes beschreven (/ A- / H) 1,2. Alle serotypes worden uitgedrukt als 150 kDa peptiden die zijn post-translationeel gejat om een dichain samengesteld uit een 100 kDa zware keten (HC) en een 50 kDa lichte keten (LC), verbonden door een disulfidebinding 3 te produceren. De HC bemiddelt binding aan presynaptische receptoren en entry van het toxine in het neuron via synaptische endocytose. Tijdens endosomale verwerking, de HC ondergaat structurele reorganisatie van een porie in de vesicle membraan, de translocatie van de LC vergemakkelijken in de presynaptische cytosol. De LC dan specifiek gericht en splitst oplosbaar N ethylmaleïmide-gevoelige fusie gehechtheid eiwit receptor (kleine) eiwitten in de presynaptische compartiment: SNAP-25 (BoNT / A / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) of syntaxine (BoNT / C) 1. Splitsing van een van deze SNARE eiwitten voorkomt dat de assemblage van de synaptische exocytose machines tot afgifte van neurotransmitters te blokkeren. Deze combinatie van efficiënte neuronale targeting en presynaptische lokalisatie maakt Bonts de meest krachtige vergiften bekend, met een geschatte mens dodelijke doses zo laag als 0,1-1 ng / kg 1. Biochemische assays kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van deze CNT LC met een hoge gevoeligheid te detecteren. Echter, deze methoden niet interrogate het vermogen van het toxine te binden, voeren activeren en functie binnen neuronen en daarom indirect en mogelijk misleidend maatregelen van de aanwezigheid van actieve toxine. Daarentegen functionele testen van intoxicatie zoals muis letaliteit assay (MLA) uitgebreid kunnen evalueren van het vermogen van CNTs alle fasen van de opname- en activatie succesvol onderhandelen met meer relevant en specifieke beoordelingen van toxine activiteit. Terwijl de MLA is de gouden standaard van BoNT detectie is een in vivo methode die dood gebruik als eindpunt en is dus beperkt nut als research platform. Pogingen om cel-gebaseerde modellen van CNT intoxicatie geschikt voor mechanistische studies en therapeutische screening ontwikkelen hebben ook te lijden belangrijke beperkingen. Terwijl primaire neuron culturen bieden een hoge mate van fysiologische relevantie is het gebruik gecompliceerd door een aantal factoren, zoals hoge grondstofkosten, relatief lage opbrengst, de aanwezigheid van meerdere neuronale subsoorten en uitgebreide regelgeving en administratieve toezicht betrokken zijn bij het gebruik van dieren. Als alternatief voor primaire neuronen hebben neurogene cellijnen (die kunnen worden geïnduceerd om neuron-achtige eigenschappen door chemische stimulatie vast) zoals neuroblastomen en adrenale chromaffine cellen gebruikt als in vitro modellen van intoxicatie. Omdat deze cellen continu gekweekt voorafgaand aan inductie, ze zijn zeer schaalbaar en daardoor zeer geschikt voor matige verwerkingscapaciteit. Echter, de relevantie twijfelachtig aangezien geïnduceerde fenotypen zijn doorgaans heterogeen, slecht gevoelig CNTs en niet vertonen kritische neuronale gedrag, zoals het onvermogen om pre- en postsynaptische compartimenten die assembleren in werking synapsen 4 vormen. Bij het ​​ontbreken van fysiologisch intact presynaptische compartimenten, het volledige gamma van toxine: kan neuron interacties niet worden gerepliceerd en dus functionele metingen van intoxicatie zijn niet mogelijk 5. Geent verrassend, probeert mechanistische studies of drug screening voor Bonts behulp geïnduceerde neurogene cellijnen hebben geleid tot bevindingen die in strijd zijn met in vivo en primaire neuron studies 6 zijn uit te voeren. Er is voorgesteld dat stamcellen afgeleide centraal zenuwstelsel (CNS) neuronen volgende generatie mobiele platform voor BoNT onderzoek dat de relevantie van primaire neuronen met de flexibiliteit van gekweekte cellijnen 7-10 maaidorsers voor. In het bijzonder zijn muizen stamcellen afgeleide neuronen (ESNs) gebleken zeer gevoelig fysiologische doses van BoNT / A / G zijn en velen in vivo reacties op intoxicatie, waaronder differentiële persistences, activiteit versterkte intoxicatie en serotype repliceren -specifieke potenties 5,8,11. Deze gedragingen suggereren dat in vivo mechanismen van BoNT opname, verwerking, handel en bedrijvigheid zijn geconserveerd in ESNs. Remming van synaptische Activiteity is de handtekening manifestatie van botulisme, en dus blijk van een verlies van synaptische activiteit na intoxicatie door CNT is essentieel alvorens te concluderen dat ESNs zijn een geschikte in vitro verkregen cellen gebaseerde model voor de CNT studies. Om de effecten van intoxicatie met CNT op synaptische activiteit te meten, werd whole-cell patch-clamp elektrofysiologie gebruikt om monosynaptic stromingen in het voertuig behandeld of CNT-behandelde DIV 21 + ESNs kwantificeren. We vonden dat roes van ESNs met BoNT / A- / G of tent veroorzaakt&gt; 95% verlies van synaptische activiteit binnen 20 uur in alle gevallen. Verdere karakterisering uitgevoerd 20 uur na intoxicatie met BoNT / A onthulde een dosisafhankelijk effect van synaptische activiteit, met een detectiegrens beneden 0.005 pM en een IC50 waarde van 0.013 pM. Deze bevindingen geven aan dat de gevoeligheid en tijdsbestek van elektrofysiologische detectie van vergiftiging aanzienlijk worden verbeterd vergelijkbare immunoblot-gebaseerde analyses van SNAP-25 splitsing en in vivo muis letaliteit assays aangetoond dat functionele metingen van intoxicatie in synaptisch actieve neuron culturen gevoeliger specifieke en snelle methoden kunnen vergemakkelijken de cellulaire respons op BoNT karakteriseren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. ESC and ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC culture medium 
			Formulation and notes: 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES qualified FBS</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>90 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>1.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>107 Units/mL LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>60 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC differentiation medium 
			Formulation and notes: 436.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC-qualified serum</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Media: NPC trypsinization medium 
			Formulation and notes: 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (18.3%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>Media: freeze in 5 mL aliquote 
			Formulation and notes: 0.266 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Media: Surface coating solutions 
			Formulation and notes: 2.5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Media: use within 1 wk 
			Formulation and notes: 100 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>Media: NPC culture medium 
			Formulation and notes: 492.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N2 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888-022</td>
			<td>Media: ESN culture medium 
			Formulation and notes: 482.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up 1 month 
			Formulation and notes: 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 &#176;C 
			Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Formulation and notes: store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 &#176;C. Stable for 6 mos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. MIST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: Extracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60135</td>
			<td>Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) 
			Final Concentration (mM): 74.56 
			MW: 3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 119.98 
			MW: 1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td>Final Concentration (mM): 180.16 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td>Media: Intracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 234.5 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 507.18 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Final Concentration (mM): 523.18 
			MW: 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>380.35</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 380.35 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicuculline</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>131</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 417.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 276.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8001</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.005 
			MW: 645.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BoNT/A-/G</td>
			<td>Metabiologics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Media: 
			Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetanus toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3194</td>
			<td>Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL-2</td>
			<td>Final Concentration (mM): N/A 
			MW: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAnalysis (version 6.0.7)</td>
			<td>Synaptosoft, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Event detection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro (version 6.22A)</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for visualization of recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Heka</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>patch-clamp amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>ECB10USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Corning 7740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm glass coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stovall Belly Dancer Shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adhesion dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-101</td>
			<td>Corning 3262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons

Therapeutische en mechanistische studies van de presynaptisch gerichte clostridium neurotoxines (CNTs) zijn beperkt door de behoefte aan een schaalbare, celgebaseerde model functionerende synapsen produceert en ondergaat fysiologische reacties op intoxicatie. Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste methode om efficiënt te differentiëren van muis embryonale stamcellen (SER) in gedefinieerde lijnen van synaptically actieve, genetwerkte neuronen. Na een 8-daagse differentiatie protocol, snel muis embryonale stamcellen afgeleide neuronen (ESNs) uiten en in hokjes neurotypic eiwitten, vormen neuronale morfologie en intrinsieke elektrische reacties te ontwikkelen. Met 18 dagen na differentiatie (DIV 18), ESNs vertonen actieve Glu en γ-aminoboterzuur (GABA) erge synapsen en opkomende netwerk gedrag gekenmerkt door een prikkelende: remmende balans. Om te bepalen of intoxicatie met CNT functioneel antagonizes synaptische neurotransmissie, waardoor het repliceren van the in vivo pathofysiologie die verantwoordelijk is voor de klinische manifestaties van botulisme en tetanus, whole-cell patch clamp elektrofysiologie werd gebruikt om spontane miniatuur prikkelende postsynaptische stroom (mEPSCs) in ESNs blootgesteld aan tetanus neurotoxine (tent) of botulinum neurotoxine (BoNT) kwantificeren serotypen / A- / G. In alle gevallen ESNs vertoonde vrijwel volledige verlies van synaptische activiteit in 20 uur. Dronken neuronen in stand bleef, zoals blijkt uit ongewijzigd rusten membraanpotentialen en intrinsieke elektrische reacties. Om verder te karakteriseren de gevoeligheid van deze benadering werden dosisafhankelijke effecten van vergiftiging synaptische activiteit gemeten 20 uur na toevoeging van BoNT / A. Intoxicatie met 0,005 pM BoNT / A resulteerde in een significante afname in mEPSCs, met een mediane remmende concentratie (IC50) van 0.013 pM. Vergelijkingen van het mediane doses geven aan dat functionele metingen van synaptische inhibitie zijn sneller, meer specifieke en gevoeliger dan SNAREsplitsing testen of de muis dodelijkheid test. Deze gegevens bevestigen het gebruik van synaptisch gekoppeld stamcellen afgeleide neuronen voor de zeer specifieke en gevoelige detectie van CNTs.

We hebben een differentiatie protocol dat de economische productie van grote hoeveelheden zeer zuiver stamcellen afgeleide neuronen van de muis SER (beschreven in figuur 1A) 8,11 maakt ontwikkeld. Deze methode is gebruikt gedurende een periode van jaar tot reproduceerbaar differentiëren particulier gegenereerd en commercieel beschikbare ESC lijnen in neuronen van gedefinieerde lijnen 12-14. Kritische elementen van dit protocol zijn onder andere (1) aanpassing van de SER tot cel-vrije suspensiecultuur voeder; (2) een goed onderhoud van schorsing culturen; en (3) differentiatie onder roterende omstandigheden. Overgang naar suspensiekweek reduceert de tijd en kosten van ESC onderhoud en ondervangt de noodzaak voedingscellen verwijderen voorafgaand aan differentiatie. Na de opschorting adaptatie, Oct3 / 4 expressie is consistent in ten minste 30 passages, wat aangeeft dat de schorsing aanpassing doet uitdrukking van pluripotentie markers niet wijzigen (Figuur 1B-D </strong&gt;). SER&#39;s zijn geschikt voor neuronale differentiatie eens celopbrengst consequent hoger is dan 1 x 10 7 cellen per passage. Dit gebeurt meestal binnen tien passages na schorsing aanpassing of vijf passages na het ontdooien van de SER die voorheen-ophanging aangepast. Mechanische rotatie differentiëren aggregaten bleek ook kritisch verhoogde neuronale opbrengst oplevert. De toevoeging van een rondschudapparaat geëlimineerd super-aggregaatvorming, toenemende totale levensvatbaarheid en produceren een toename ~ 300% in de opbrengst van neurale progenitorcellen (NPC) en DIV 0 (figuur 1E). Een typische differentiatie begint met 3,5 x 10 6 SER bij DIV -8 en produceert 115 x 10 6 NPCs bij DIV 0, ongeveer 60% van die zal overleven en worden neuronen. De resterende 40% omvatten niet-neuronale cellen en grotendeels geëlimineerd door serumdeprivatie tussen DIV 0 - 1. Het kleine aantal persisterende glia kan worden verwijderd door toevoeging van mitotische inhibitors van DIV 2-4 of DIV 8 - 12. Plating dichtheid is van cruciaal belang bij DIV 0; neuronen plated te dun zal niet overleven dan 2 weken. Binnen enkele dagen na plating, gedifferentieerde neuronen vertonen neuronale morfologie en in hokjes neurotypic eiwitten, zoals de somatodendritisch marker MAP2 en de axonale marker Tau (Figuur 2A). Door DIV 14 synapsin-1 + puncta kan worden geïdentificeerd op axodendritic interfaces, suggestief vorming van synapsen. Dit is consistent met de expressie van synaptische merkereiwitten voor DIV 7 8,11. Neuronale morfologie voortdurend verder door DIV 21, waarna culturen vertonen uitgebreide axodendritic priëeltjes grote synaptische puncta (Figuur 2A). Bij goed onderhouden, ESNs levensvatbaar blijven en actief minstens 4 weken na plating. Longitudinale expressie profilering met behulp van RNA-sequencing bevestigd morfologische en proteomics bewijs van neuronale specificatie eend rijping 11,15. Vertegenwoordiger markers van ontwikkelings progressie vertoonden podium-specifieke expressie profielen, waaronder Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN en KCC2 (figuur 2B). Door DIV 0, ESNs uitgedrukt overvloedige kopieën van neuron-specifieke structurele eiwitten, waaronder MAP2 en Tau. In overeenstemming met eerdere bevindingen, markers voor slechts twee neuronale subtypes werden waargenomen:-vGluT2 uiten middenhersenen / achterhersenen glutamatergische neuronen en GABA-erge interneuronen 8. Dienovereenkomstig, een breed scala van Glu en GABA-erge markers tentoongesteld scherpe stijgingen in expressie tussen DIV 0 en DIV 7, inclusief pre-synaptische SNARE eiwitten die nodig zijn voor de afgifte van neurotransmitters; neurotransmitter receptoren die nodig zijn voor de post-synaptische responsen; en steigers eiwitten die nodig zijn om deze receptoren tether het postsynaptische membraan. Neuronen vertonen volwassen intrinsieke elektrische kenmerken door DIV 14 en spontane miniatuur prikkelende postsynaptische stromingen door DIV16 16. De gemeten Remming van synaptische transmissie (MIST) test werd gebruikt om het effect van intoxicatie synaptische activiteit te bepalen. Door het vergelijken mEPSC frequenties tussen bedwelmd en met hulpmiddel behandelde DIV 24 + ESNs, MIST een getalsmatige specifieke meting van intoxicatie basis van de functionele remming van synaptische activiteit (figuur 3A). MIST werd gebruikt om de effecten van BoNT / A / G of tent synaptische activiteit ESNs 20 uur na bad toevoeging van elk toxine meten. Toxinen werden bij een concentratie die gelijkwaardig is toegevoegd aan 10 maal de EC50 waarde, zoals eerder bepaald door immunoblot-analyse van SNARE eiwitten splitsing 11. Alle toxinen gereduceerd mEPSC frequenties tot minder dan 5% van de met drager behandelde controles. Verlagingen van synaptische tarieven waren niet te wijten aan de dood of veranderd intrinsieke reacties cel, omdat dronken ESNs kunnen worden gepatched waren, ontslagen herhaalde actiepotentialenin reactie op stroominjectie en vertoonden geen significante wijziging in rustende membraanpotentiaal (Figuur 3B, C). Om de gevoeligheid van MIST vergelijken met bestaande methoden voor het detecteren CNTs, de detectiegrens en mediane remmende concentratie (IC50) werd bepaald 20 uur na toevoeging van BoNT / A ESNs. Intoxicatie door slechts 0,005 pM BoNT / A produceerde een statistisch significante vermindering mEPSC frequentie, met een IC50 waarde van 0,013 pM en complete inactivatie van synaptische activiteit boven 12:05 (Figuur 4A). Deze IC50 waarde komt overeen met ongeveer 0,5 muis letale eenheden / ml, wat suggereert dat MIST tweemaal zo gevoelig en 2 tot 4 maal sneller dan de MLA in de aanwezigheid van BoNT / A. Immunoblot metingen van SNAP-25 splitsing produceerde een EC50 waarde van 12:38 en een minimum detecteerbare dosis van 12:05, wat aangeeft dat MIST is ongeveer 30 keer gevoeligerdan immunoblot gebaseerde detectie van gesplitst SNARE eiwitten (figuur 4B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" /> Figuur 1.-Suspension aangepaste ESNs blijven mitotisch stabiel en express markers van pluripotency. (A) Schematische voorstelling van ESC onderhoud en differentiatie. De aanwezigheid of afwezigheid van retinoïnezuur (RA) of leukemie remmende factor (LIF) wordt gekenmerkt door een + of -. Een vergelijking tussen de dagen in vitro (DIV) en de klassieke ontwikkelingsstadia (DS) voor primaire neuron culturen wordt verstrekt 17. (B) Proliferatie tarieven voor R1, D3 en C57BL / 6J ES cellijnen te stabiliseren door vijf passages na de overgang naar suspensiecultuur. (C) Stroomcytometrie gegevens tonen geen enkele inhoudelijke wijziging in Oct3 / 4 uitdrukking in de R1, D3 en C57BL / 6J ES cellijnen gemeten over 25 passages in suspensiecultuur (n = 6 voor elk). (D) Werkelijke cel opbrengsten tijdens routinematige passage voor een-ophanging aangepast R1 ESC lijn gemeten tussen passages 5 en 30 (zwarte lijn). Theoretische cumulatieve rendementen als er geen cellen tijdens passage worden weggegooid worden ook gepresenteerd (rode lijn). (E) Helder-veld beelden van DIV 0 aggregaten geproduceerd onder statische (links) of roterende omstandigheden (rechts). Rotary milieu geproduceerde bolvormige aggregaten zonder agglomeratie en verhoogde NPC levert 3-voud (p &lt;0.001, bepaald met t-toets) 11. * Geeft P &lt;0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Hubbard et al. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" /> Figuur 2. Morfologische, proteomic en transcriptoom bewijs van neuronale specificatie en rijping (A) Immunocytochemie van DIV 7 -. DIV 49 toont neuronale arborization en het verschijnen van synaptische puncta in axodendritic interfaces. Axonen zijn gelabeld met Tau (groen), worden dendrieten gelabeld met MAP2 (rood), zijn pre-synaptische compartimenten gelabeld met synapsin (wit), en kernen worden gekleurd met DAPI (blauw). (B) Longitudinale expressie profilering van representatieve genen demonstreren ontwikkelingsstadium-specifieke expressie en het opgeven van neuronale subtypes. Alle gentranscripten worden uitgedrukt als geschatte aantal transcripten per cel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" /> Figuur 3. ESNs onder. gaan remming van synaptische activiteit bij blootstelling aan BoNT / AG en tent (A) Vertegenwoordiger sporen van ESNs verzameld 20 uur na bad toevoeging van ~ 10 x EC50 waarden van BoNT / A - / G, tent of voertuig. Elke neurotoxine verminderde synaptische activiteit met meer dan 95% in vergelijking met controles. (B) Bedwelmde neuronen gebleven kunnen herhaalde AP vuur in reactie op stroominjectie depolariserende (zoals aangetoond voor BoNT / A, maar waargenomen in alle dronken culturen) en (C) vertoonden geen veranderingen ontkennend rust membraanpotentiaal (C; n&gt; 18 voor elke behandeling). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" /> Figuur 4. Bepaling van de gevoeligheid van MIST in BoNT / A behandeldESNs. (A) MIST metingen van synaptische activiteit 20 uur na bad toevoeging van BoNT / A. Representatieve voltage-clamp trace segmenten vertoonden een afname mEPSC frequentie volgende BoNT / A belichting (links). Kwantificering van mEPSC frequentie (staafdiagram, rechts, n = 20 voor de controles; n = 11-22 per dosis) bevestigt een dosisafhankelijke afname mEPSC frequentie. De mediane remmende concentratie werd bepaald met een kleinste kwadraten fit van een niet-lineaire regressie met een variabele helling vier parameters (R2&gt; 0,91). Let op de detectielimiet door mist in ESNs minstens 0.005 uur. (B) BoNT / A intoxicatie van ESNs resulteert in splitsing van SNAP-25 zoals gevisualiseerd door gel mobiliteit verschuivingen (vertegenwoordiger western blot aan de linkerkant met een staafdiagram kwantificering van SNAP-25 splitsing rechts; n = 4) . Let op de verminderde gevoeligheid met behulp van SNARE eiwit splitsing (SNAP-25) als een eindpunt (EG 50 van 12:36) vs. </em&gt; MIST (IC 50 van 0.013 uur). * Geeft P &lt;0,05; *** Duidt op een P &lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Intrathecale afgifte van antisense oligonucleotiden in het centrale zenuwstelsel van de rat

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...