Name: functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (IAA nummer AOD12058-0001-0000) og Forsvars Threat Reduction Agency - Joint Science and Technology Office Medical S &amp; T Division (stipend tall CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 og CBM.THRTOX.01.RC.014). Denne forskningen ble utført mens PB holdt en Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Forskning Associateship Award og KH holdt en National Research Council Forskning Associateship Award. Vi takker Angela Adkins og Kaylie Tuznik (USAMRICD) for teknisk assistanse; og Cindy Kronman (USAMRICD) for redaksjonell bistand. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke den offisielle politikk ved Institutt for Hæren, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen.

1. Tilpasning av ESCs å mater Cell-free Suspension Kultur <ol><li> Tine ESCs ved 37 ° C til en snev av is gjenstår. </li><li> Ved hjelp av en pipette P1000, forsiktig overføre 1 til 2,5 x 10 6 dissosiert ESCs til en ikke-vevskultur-behandlede skål inneholdende 10 ml forvarmet medium ESC. Inkuber i en fuktet vevskultur-inkubator i 20 timer ved 37 ° C og 5% CO2. </li><li> Etter 20 timer, vaske cellene ved å forsiktig overføre suspensjon kultur til en 15 ml konisk rør ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Pellet ESCs i 3 minutter ved 200 x g. Under spinn, tilsett 10 ml frisk ESC medium tilbake til lav adhesjon parabolen. </li><li> Aspirer supernatant, for å ta vare unngå å flytte cellepellet, og tilsett 1 ml frisk ESC medium til celle pellet. Overfør cellene til det bakterielle fatet ved hjelp av en pipette P1000 og gå tilbake til inkubatoren. </li><li> Observere celler daglig inntil aggregater bli synlig for det blotte øye (vanligvis 4-8 dager (d), aggregater vil være 0,2- 0,5 mm). Hvis aggregater er ikke åpenbar etter 4 d, gjenta trinn 1.3. Når aggregater er synlige, distansere og vedlikeholde ESCs som beskrevet i kapittel 2. </li></ol> 2. ESC aging og vedlikehold <ol><li> Overføre ESC summerer seg til en 15 ml konisk rør ved hjelp av en steril 10 ml pipette og la tilslag til å bosette seg til en kompakt pellet (typisk 3-5 min). Aspirer supernatanten, er forsiktig med å unngå å forstyrre cellen pellet, og vaske aggregater med 5 ml PBS. Selv om gravitasjon settling anbefales, alternativt pellets celler ved 100 xg for 2,5 min i stedet for å spare tid. </li><li> Aspirer PBS og tilsett 500 mL trypsin. Inkuber aggregater i trypsin i 3 minutter i et vannbad ved 37 ° C. Legg 500 mL ESC medium for å fortynne trypsin og forsiktig finfordel 10 ganger med en P1000 pipette for å bryte opp aggregater. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. </li><li> Pelleten dissosierte celler i 3 minutter ved 200 xg og resuspender cellene til en sluttkonsentrasjon på 1.0x 10 7 celler / ml i ESC medium. Overføring 150 ul (1,5 x 10 6 celler) til 10 ml friskt medium ESC i en 10 cm bakteriell fatet og tilbake til vevskultur-inkubator i 48 timer. Overflødige ESCs kan differensieres, kryopreserveres på 1-5 x 10 6 celler / ml i 90% ESC medium supplert med 10% DMSO eller forkastet. </li><li> Passasje aggregater hver 48 time. Aggregater klar for passasje vil være godt synlig, med diameter på over 0,5 mm. MERK: Tining og kultur av cryopreserved, fjæring tilpassede celler er oppnådd per trinn 01.02 til 01.04. Aggregater vil være klar for passering innen 48-72 timer. </li></ol> 3. Neuronal Differensiering MERK: Conduct trinn 03.01 til 03.05 før middag og steg 3,7 etter middag. En oversikt over differensiering prosedyrer er presentert i figur 1A. <ol><li> Distansere ESCs som i trinn 2.1 til 2.5. Overføring 350 ul (3,5 x 10 6) av dissociated ESCs til en 10 cm lav-vedlegg tallerken som inneholder 25 ml differensiering medium. Legg på en orbital ryste innstilt på 30 - 45 opm i en vevskulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Dette er den første dagen av differensiering, kalt dag in vitro (DIV) -8. MERK: Bruk av en ultra-lav vedlegg fatet øker kostnadene for metoden, men gir litt større avlinger enn bakterielle petriskåler siden aggregater tidvis kan følge petriskåler. Hvis forskjellige parabolen størrelser er foretrukket, kan middels volumer og celle tall skaleres tilsvarende. </li><li> Etter 48 timer (DIV -6), bruker en 25 ml pipette til å overføre de unike celleaggregater til en 50 ml konisk tube. Umiddelbart legge en frisk 25 ml differensiering medium til petriskål. </li><li> Tillate tilslag å bosette vel 2 - 5 min, som produserer en synlig pellet som er 1 - 2 mm dyp. Ignorere enkeltceller eller små aggregater som er igjen i suspensjonen. Aspirer medium nøye og overføre cell pellet tilbake til petriskålen ved hjelp av en P1000. Plasser på roterende shaker i en vevsdyrkningsinkubator. </li><li> På DIV -4 gjenta trinn 3.2. Pelleten vil være 2 - 4 mm dyp. Erstatt 30 ml differensieringsmedium supplert med 6 pM all-trans retinsyre (RA) til petriskålen. Returnere til rotasjonsrister i vevskultur-inkubator i ytterligere 48 timer. </li><li> På DIV -2 gjenta trinn 3.3. Pelleten vil være 4 - 8 mm dype på dette punktet. </li><li> På DIV -1, forberede plating flater som i punkt 4. </li><li> Ved DIV 0, tine 5 ml av pre-alikvotert og frosset NPC trypsinisering medium ved 37 ° C i 5 - 10 min, og plasser i en vevskultur hette. Ved hjelp av en 25 ml pipette, overføring differensierende tilslag til et 50 ml konisk rør. Tillate tilslag å bosette og nøye aspirer medium. Vask pellet to ganger med 10 ml PBS, slik at aggregatene å bosette mellom hver vask. </li><li> Etter den andre PBS vaske, tilsett 5 ml NPC trypsinisering medium til pelleten og inkubert ved 376, C i 5 min. Knips forsiktig på røret etter 2,5 min. </li><li> Tilsett 5 ml av 0,1% soyabønne-trypsin-inhibitor (STI) for å inaktivere trypsin og bland ved å snu. Forsiktig triturer 10 - 15 ganger med en 10 ml serologisk pipette til en relativt homogen cellesuspensjon produsert. </li><li> Sakte overføre cellesuspensjonen til en 40 pm eller 70 pm cellefilter plassert i toppen av et 50 ml konisk rør. Når all suspensjon er blitt filtrert, tilsett 1 ml av N2-medium for å vaske gjenværende celler gjennom filteret og pelletere det dissosierte cellesuspensjonen i 6 minutter ved 200 x g. </li><li> Aspirer medium uten å forstyrre pelleten. Vask cellene to ganger med 10 ml N2 medium, pelletere cellene i 5 min ved 200 x g og triturering mellom vaskinger med en P1000. Før den andre vask, telle celler ved hjelp av en hemocytometer. </li><li> Resuspender celler i N2-medium ved 1 x 10 7 celler pr ml og plate ESNs ved en celletetthet på 150 000 - 200 000 celler / cm2. </li><li> Overføre nylig plated ESNs til en fuktet vevskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 og vedlikeholde som i avsnitt 5. </li></ol> 4. Forberede Kultur Overflater for plating Neural Forstadier på DIV 0 <ol><li> Forberede vevskulturstudier behandlede retter minst en dag før plating. Tilsett tilstrekkelig polyetylenimin (PEI; 25 ug / ml i steril H2O) eller poly-D-lysin (PDL, 100 ug / ml i steril H2O) for å dekke vev-kultur-behandlet plastskåler og inkuberes O / N i 37 ° C. </li><li> Morgenen plating, vaske to ganger med dobbeltdestillert H2O og en gang med PBS. Etter den siste vask, tilsett tilstrekkelig N2-medium for å dekke formen (f.eks, 1 ml pr brønn i en 12-brønners skål eller 4 ml pr 6 cm plate). </li><li> Forbered 18 mm dekkglass minst en dag før neuron plating. Rene Dekk av plasma-rensing for 4 min. </li><li> Umiddelbart overføre renset dekkglass i en etanolvasket parafilm i bunnen av enstor steril form og legg i 400 mL av PEI eller PDL løsning, utarbeidet som i trinn 4.1. Inkuber O / N ved 37 ° C i en vevskulturinkubator. </li><li> På morgenen dekkvask tre ganger med vann og tilsett 5 ug / ml laminin i PBS i 1 - 3 timer ved 37 ° C. Før dissociating nevroner, aspirer laminin og umiddelbart overføre dekkglass til en brønn i en 12-godt fatet inneholder 1 ml av NPC medium, være sikker på å holde det behandlede siden opp. </li><li> Butikk retter og Dekk ved 37 ° C til NPCer er klar til plate. </li></ol> 5. Vedlikehold av nevroner <ol><li> På DIV 1, aspirer medium og erstatte med N2 kultur medium. </li><li> På DIV 2 og 4, aspirer medium og erstatte med B27 kultur medium. </li><li> På DIV 8, til aspirer medium og erstatte med B27 kultur medium som inneholder mitotiske hemmere eliminere forurensende ikke-nevronale celler. </li><li> På DIV 12, erstatte med B27 kultur medium. </li><li> Ikke fjern DIV12 + ESNs fra 5% CO 2 til den er klar til bruk. </li></ol> 6. Målt Hemming av Synaptic Transmission (MIST) analyse for Kvantifisering Miniatyr Excitatory Post-synaptiske Currents FORSIKTIG: clostridial nervegifter er de mest giftige stoffer kjent, med estimert menneskelig LD 50 verdier så lave som 0,1 til 1 ng / kg. Innhente nødvendige godkjenninger før du bruker disse giftstoffene og ta nødvendige forholdsregler. <ol><li> Forsiktig fortynnet bont / A 100x den ønskede sluttkonsentrasjon i ESN kulturmedium og varm til 37 ° C. Legg passende volum av toksinet til div 21 + ESN kulturer, virvle dyrkningsskålen, og gå tilbake til inkubatoren. </li><li> Dersom cellene blir analysert mer enn 4 timer etter forgiftning, tilsett toksin til fatet og virvel uten å fjerne fra 5% CO2, som for eksempel direkte i kuvøse eller i et konstant CO to kammer. </li><li> På passende tidspunkt, Aspirate ESN kulturmedium og vask to ganger med ekstracellulær opptaksbuffer (ERB). Legg 4 ml ERB supplert med 5,0 mikrometer tetrodotoksin og 10 mikrometer bicuculline, blokkerer aksjonspotensialer og motvirke GABA A reseptor aktivitet, henholdsvis. </li><li> Overføre rett til elektrofysiologi rigg. Verken perfusjon eller temperaturkontroll er nødvendig for TÅKE analysen. </li><li> Trekk borsilikatglass bruker en mikropipette avtrekker for å produsere en innspilling pipette med 5-10 mÊ av motstand og fyll med intracellulære opptak buffer. Forsiktig dyppe fylt opptak pipette i silikonsiering reagent før opptak. </li><li> Ved hjelp av en luftfylt sprøyte, gir positivt trykk som opptaks pipette senkes ned i ERB. Etter forsiktig landing opptaket pipetten på soma av nervecellen som skal tas opp, fjerne positivt trykk og danne en gigaseal. Redusere beholdningen spenning til -70 mV. Nøye bruke negativt press for å bryte seg inn i hel-celle konfigurasjon. </li><li> Bytt til strøm klemme å overvåke og registrere hvilemembranpotensialet. Uten justering for flytende koblings potensialer, vil hvilemembranpotensialet være mellom -67 til -82 mV. </li><li> Utføre en kontinuerlig -70 mV spennings klemme opptak i 4 - 5 min å oppdage miniatyr eksitatoriske postsynaptiske strømmer (mEPSCs). </li><li> Analyser 4 min av registrerte data for mEPSC deteksjon ved hjelp pigg deteksjon programvare med følgende innstillinger: Threshold, 5; Periode for å søke et lokalt maksimum, 10.000 usek; Tid før en topp for baseline, 5000 usek; Periode for å søke en forråtnelse tid, 20.000 usek; Brøkdel av topp for å finne en forråtnelse tid, 0,37; Periode til gjennomsnittlig en baseline, 1000 usek; Område terskel, 20; Antall poeng til gjennomsnittlig topp, 1; Retning av peak, negativ. </li><li> Samle og lagre informasjon på oppdagede hendelser. Dele antall oppdagede hendelser i 4 min ved 240 å bestemme mEPSC frekvens i Hz. </li><li> Samle mEPSC frekvenser for 8-12 fortsrols og 8-12 Bont-behandlede prøver for hver eksponering tilstand. Analysere frekvens mot alders- og parti-matchet kontroller. Bestemme den statistiske signifikansen av% inhibering av synaptisk aktivitet ved anvendelse av enveis ANOVA Dunnetfs test og post-hoc test. </li></ol>

<ol>
	<li>Simpson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+steps+in+botulinum+toxin+action.">Identification of the major steps in botulinum toxin action.</a> Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).</li><li>Singh, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+neurotoxin+structure,+engineering,+and+novel+cellular+trafficking+and+targeting.">Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting.</a> Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).</li><li>Larsen, J. C. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Army+botulinum+neurotoxin+(BoNT)+medical+therapeutics+research+program:+past+accomplishments+and+future+directions.">Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions.</a> Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).</li><li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists.">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+quantitative+detection+of+botulinum+neurotoxin+in+neurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).</li><li>Mesngon, M., McNutt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Latrotoxin+Rescues+SNAP-25+from+BoNT/A-Mediated+Proteolysis+in+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons.</a> Toxins. 3, 489-503 (2011).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Whitemarsh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+human+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+highly+sensitive+botulinum+neurotoxin+detection.">Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection.</a> Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).</li><li>Hubbard, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+derivation+of+enriched+glutamatergic+neurons+from+suspension-cultured+mouse+ESCs+for+neurotoxicology+research.">High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research.</a> BMC Neurosci. 13, 127 (2012).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).</li><li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines:+formation+of+visceral+yolk+sac,+blood+islands+and+myocardium.">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+RNA+sequencing+of+the+deep+transcriptome+during+neurogenesis+of+cortical+glutamatergic+neurons+from+murine+ESCs.">Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs.</a> F1000Research. 2 (35), (2013).</li><li>Gut, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+stem+cell-derived+neurons+to+evaluate+the+time-+and+dose-dependent+progression+of+excitotoxic+injury.">Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury.</a> PLoS One. 8, e64423 (2013).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Capek, P., Dickerson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+the+deadliest+toxin:+technologies+for+botulinum+neurotoxin+detection.">Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection.</a> Toxins. 2, 24-53 (2010).</li><li>Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+interactions+in+vivo:+evidence+from+botulinum+A,+C,+D+and+E+action+at+frog+neuromuscular+junction.">Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction.</a> The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).</li><li>Baskaran, P., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+effects+of+botulinum+neurotoxin+a+on+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction.</a> Muscle &amp; Nerve. 50, 206-215 (2014).</li></ol>

The U.S. Government has filed two international patent applications that incorporate methods described in this article: PCT/US2014/22042, titled &#8220;Methods of detecting neurotoxin using synaptic activity&#8221;; and PCT/US13/40641, titled &#8220;Toxin detection using stem cell-derived neurons.&#8221;

Dagens gullstandard for CNT deteksjon, serotype besluttsomhet og kvantifisering er MLA. MLA interrogates hele bredden av verts: toksin interaksjoner som er nødvendige for forgiftning forekommer in vivo (f.eks toksin binding til en celleoverflatereseptor, internalisering av toksinet-reseptor-komplekset, LC translokasjon inn i cytoplasma, LC-formidlet kløyving av substrat og hemming av synaptiske nerveoverføringer) 18. Men selv om MLA tilbyr en fysiologisk relevant modell av rus, er det ressurskrevende, kan bli gjort til skamme av forurensninger og involverer et stort antall mus med døden som et endepunkt. Alternativt har cellebaserte assayer for påvisning og kvantifisering bont vært begrenset til primære nevronkulturer, noe som også krever bruk av dyr, eller for å neuroblastom-cellelinjene, som ikke klarer å danne synapser og typisk oppviser dårlig følsomhet overfor neurotoksiner 8. Hittil har de fleste målinger av rus i thESE celle-baserte plattformer har stolt på påvisning av proteolytisk spalting av SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-1 11. Dette er problematisk, fordi SNARE protein spalting er blitt vist å være ikke-lineært forbundet med synaptisk inhibering in vivo, og kan derfor ikke nøyaktig representerer forgiftning eller utvinning fra forgiftning 19,20. En ideell cellebasert modellsystem for deteksjon ville CNT (i) være neuron-baserte; (Ii) være postsynaptisk kombinert med neurotypic elektriske svar; (Iii) være svært følsom for alle CNT serotyper eller undertyper; og (iv) tilbyr skalerbarhet, gjennomstrømming og analyse tider som er lik eller bedre enn den MLA, til en lavere kostnad, og uten å kreve bruk av dyr. For å møte disse kravene, har vi utviklet en metode for å produsere store mengder høyanriket, nettverksbaserte kulturer av glutamaterg og gabaergic nevroner fra kommersielt tilgjengelige mus ESC linjer. Vi deretter utviklet MIST analyse for å kvantifiseresynaptic hemming som svar på forgiftning med telt og Bont / A- / G. Mens MIST analysen kan gjennomføres på noen postsynaptisk aktiv nevron befolkningen (f.eks primære nevroner eller hjerneskiver), for tiden ESNs er de eneste in vitro avledet nevron modell som reproduserbart utvikler framnettverks atferd og er derfor egnet for MIST analysen. Produsere tilstrekkelige mengder av nevroner av definert avstamning for CNT studier kreves flere nyvinninger i ESC kultur og differensiering. Først, ved å velge for og dyrke ESCs som kan overleve suspensjon-tilpasning, elimineres vi muligheten for forurensning av feeder-celler og behovet for å rense mateceller fra ESCs ved starten av differensieringen. Selv om de molekylære mekanismene bak suspensjon-tilpasning er ukjent, suspensjon-tilpasset ESCs forbli mitotisk aktiv, beholde Oct3 / 4 uttrykk og fortsette å være nevrogen. Ved hjelp av denne metoden, ~ 1,5 x 10 7 ESentre er vanligvis utvinnes hver passering. Sekund, produksjon av NPCer ble økt ~ ​​300% ved å innlemme mekanisk agitasjon for å hindre tettbebyggelse under differensiering, tilsynelatende økende næringsstoff tilgjengelighet til interiøret av aggregater. I løpet av prosessen, fant vi at serum brukes for ESC kultur og nevronale differensiering er den mest kritiske komponenten i å opprettholde nevrogene ESCs. For best suksess, anbefaler vi suspensjon tilpasse ES-celler til hvert parti av serum og lagring serum ved -20 ° C for å støtte ESC kultur og nevronale differensiering gjennom utløpsdatoen. Som med de fleste postsynaptisk aktive kulturer, DIV 14 + ESNs er svært utsatt for brå endringer i pH, og selv en kort eksponering for atmosfærisk CO 2 konsentrasjoner kan føre til nevro innen 24 timer. For eksperimentene som krever behandling av kulturer fulgt av inkubasjoner med varighet O / N eller lenger, nevroner bør behandles direkte in inkubatoren eller overføres til en konstant CO 2 kammer før eksperimentering. En rekke forskjellige teknikker bekreftet nevrogenesen og neuronal modning, inkludert ICC, transkripsjonen profilering og hel-celle-patch-clamp elektrofysiologi. Tidsmessige endringer i genuttrykk og neuron morfologi var i samsvar med en rask progresjon gjennom utviklingsstadier av neurogenesis, og av DIV 16, ESNs utstilt eksitatoriske og hemmende miniatyr postsynaptiske strømninger som utvikler nettverk Adferd 16. Bevis på synaptisk aktivitet antydet at ESNs kan gjenskape pathophysiologies ansvarlige for de kliniske manifestasjoner av botulisme og stivkrampe. Dette ble bekreftet ved hjelp av MIST å vise at rus med Bont / A- / G eller telt svekket mEPSC frekvenser ved&gt; 95% sammenlignet med placebobehandlede eller ubehandlede nevroner. Målinger av følsomheten av tåke for bont / A indikerte en midlere inhiberendekonsentrasjon (IC50) av 0,013 pM (tilsvarende 0,5 mus dødelige enheter / ml) og en ramme-for-påvisning under 0.005 pM, målt ved 20 timer etter tilsetning bad. Basert på disse verdiene, er MIST omtrent dobbelt så følsom som og 2 - 4 ganger raskere enn den MLA og 30 ganger mer følsom enn immunoblot-basert gjenkjenning av kløyvde SNAP-25. Sammen er disse dataene antyder at bestander av stamcelle-avledet nevroner nettverk tilbyr en fysiologisk relevant, cellebasert modell av beruselse. I kombinasjon med forbedrede metoder for å utlede nettverks ESN kulturer fra suspensjon tilpassede ESCs, bør bruk av MIST redusere behovet for dyreforsøk og de tilhørende ulemper, kostnader og etiske bekymringene til MLA samtidig som det gir en mer hurtig, sensitiv og spesifikk mål på beruselse. Selv hel-celle patch-clamp elektrofysiologi er en lav-throughput metode for å identifisere tilstedeværelsen av aktive nervegifter, og tilbyr en oppløsning og speed som er uoppnåelig bruker molekylære metoder. Disse funn gir også bevis for at anvendelsen av aktivitetsavhengige metoder for å evaluere synaptisk aktivitet og nettverks oppførsel kan muliggjøre rask og spesifikk påvisning av nervegifter. Slike høyere throughput tilnærminger ville gjøre mekanistiske studier, terapeutisk screening eller diagnostiske analyser gjennomførbare for et bredt spekter av neuromodulatory agenter, inkludert CNTs.

Det overordnede målet med denne metoden er å funksjonelt evaluere synaptisk aktivitet i nettverks kulturer av stamcelle-avledet nevroner utsatt for clostridial nervegifter. Dette er den første demonstrasjonen av en in vitro avledet modell som funksjonelt reproduserer pathophysiologies ansvarlige for kliniske manifestasjoner av botulisme og validerer ESNs som en egnet modell for påvisning av CNTs, terapeutisk screening og mekanistiske studier. BoNTs er svært dødelige bakterie neurotoxins produsert av medlemmer av Clostridium arter. Inkludert den nylig foreslåtte Bont / H, har åtte antigenically distinkte Bont serotyper er beskrevet (/ A- / H) 1,2. Alle serotyper er uttrykt som 150 kDa peptidene som er post-translasjonelt bretter for å produsere en dichain sammensatt av et 100 kDa-tungkjede (HC) og en 50 kDa lettkjede (LC) forbundet med en disulfidbinding 3. HC medierer binding til presynaptiske reseptorer og entry av toksinet inn i nervecellen via synaptic endocytose. Under endosomale behandling, gjennomgår HC strukturell omorganisering for å danne en pore i vesikkelmembranen, legge til rette for translokasjon av LC i presynaptiske cytosol. LC da spesielt rettet mot og kløyver løselig N -ethylmaleimide følsomme fusjon vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner i den presynaptiske rommet: SNAP-25 (Bont / A, / C, / E), VAMP2 (Bont / B, / D, / F / G) eller syntaxin (bont / C) 1. Spalting av en hvilken som helst av disse SNARE proteiner forhindrer montering av synaptiske exocytose maskiner, for derved å blokkere neurotransmitterfrigjørelse. Denne kombinasjonen av effektive neuronal målretting og presynaptisk lokalisering gjengir BoNTs de mest potente kjente giftstoff, med estimerte humane letale doser så lave som 0,1 til 1 ng / kg 1. Biokjemiske analyser kan bli anvendt for å detektere tilstedeværelse eller aktivitet av CNT LC&#39;er med høy følsomhet. Imidlertid er disse metoder ikke klarer å interrogate evne til å binde toksinet, angir, aktivere og funksjon i nerveceller, og derfor er indirekte og eventuelt villedende mål på nærvær av aktivt toksin. I kontrast, funksjonelle analyser av rus som mus letalitetsprøven (MLA) grundig vurdere muligheten av CNTs å kunne forhandle alle faser av opptak og aktivisering, og gir mer relevante og konkrete vurderinger av toksin aktivitet. Mens MLA er gull-standarden på bont deteksjon, er det en in vivo metode som bruker død som et sluttpunkt, og har derfor begrenset anvendelse som et forskningsplattform. Forsøk på å utvikle cellebaserte modeller av CNT rus egnet for mekanistiske studier og terapeutisk screening har også lidd betydelige begrensninger. Mens primære nevronkulturer tilby en høy grad av fysiologisk betydning, er deres bruk kompliseres av en rekke faktorer, inkludert høy ressurs kost, relativt lavt utbytte, tilstedeværelse av multiple neuronal subtyper og omfattende regelverk og administrativ forglemmelse involvert med dyr bruk. Som et alternativ til primære neuroner, har nevrogene cellelinjer (som kan bli indusert til å adoptere neuron-lignende egenskaper ved kjemisk stimulering) som neuroblastomer og adrenale kromaffinceller blitt anvendt som in vitro-modeller av intoksikasjon. Siden disse cellene er dyrket kontinuerlig før induksjon, er de svært skalerbar, og derfor godt egnet for moderat gjennomstrømning tilnærminger. Imidlertid er deres relevans tvilsom siden induserte fenotyper er typisk heterogene, er dårlig følsomme for CNTs og ikke klarer å stille kritiske nevronale atferd, herunder manglende evne til å danne pre- og postsynaptiske avdelinger som settes sammen til fungerende synapser 4. I fravær av fysiologisk intakte presynaptiske avdelinger, hele spekteret av toksin: kan Nevron interaksjoner ikke bli kopiert og derfor funksjonelle målinger av beruselse er ikke mulig 5. Ikket overraskende, forsøk på å gjennomføre mekanistiske studier eller narkotika screening for BoNTs bruker indusert nevrogene cellelinjer har resultert i funn som er i strid med in vivo og primær nevroner studier 6. Det har blitt foreslått at stamcelle-avledet sentralnervesystemet (CNS) nevroner kan gi neste generasjons cellebasert plattform for Bont forskning som kombinerer relevansen av primære nevroner med fleksibiliteten til dyrkede cellelinjer 7-10. Spesielt har musestamcelle-avledede nevroner (ESNs) blitt funnet å være meget følsom for fysiologiske doser av bont / A- / g og til å replikere i mange vivo responser til forgiftning, inkludert differensial persistences, aktivitet med forbedret rus og serotype -spesifikke potenser 5,8,11. Disse atferd tyder på at in vivo mekanismer for Bont opptak, prosessering, handel og aktivitet er konservert i ESNs. Imidlertid inhibering av synaptisk activity er signaturen manifestasjon av botulisme, og derfor viser et tap av synaptisk aktivitet etter forgiftning ved CNTs er viktig før de konkluderer med at ESNs er en passende in vitro avledet celle-basert modell for CNT studier. For å måle effekten av rus med CNTs på synaptisk aktivitet, ble hel-celle patch-clamp elektrofysiologi brukes til å kvantifisere monosynaptisk strømninger i vehikkelbehandlede eller CNT-behandlet DIV 21 + ESNs. Vi fant ut at rus av ESNs med Bont / A- / G eller telt forårsaket&gt; 95% tap av synaptisk aktivitet innen 20 timer i alle tilfeller. Ytterligere karakterisering utført 20 timer etter forgiftning med bont / A viste en doseavhengig effekt på synaptisk aktivitet med en deteksjonsgrense på under 0.005 pM og en IC50-verdi på 0,013 pM. Disse funnene tyder på at følsomheten og tidsramme for elektrofysiologisk registrering av rus er betydelig forbedret i forhold til sammenlignbare immunoblot-baserte analyserer av SNAP-25 cleavage og in vivo-mus dødelighet analyser, som viser at funksjonelle målinger av rus i postsynaptisk aktive nevroner kulturer kan bidra til mer sensitive, spesifikke og raske metoder for å karakterisere den cellulære responsen til Bont.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. ESC and ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC culture medium 
			Formulation and notes: 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES qualified FBS</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>90 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>1.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>107 Units/mL LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>60 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC differentiation medium 
			Formulation and notes: 436.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC-qualified serum</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Media: NPC trypsinization medium 
			Formulation and notes: 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (18.3%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>Media: freeze in 5 mL aliquote 
			Formulation and notes: 0.266 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Media: Surface coating solutions 
			Formulation and notes: 2.5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Media: use within 1 wk 
			Formulation and notes: 100 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>Media: NPC culture medium 
			Formulation and notes: 492.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N2 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888-022</td>
			<td>Media: ESN culture medium 
			Formulation and notes: 482.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up 1 month 
			Formulation and notes: 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 &#176;C 
			Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Formulation and notes: store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 &#176;C. Stable for 6 mos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. MIST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: Extracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60135</td>
			<td>Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) 
			Final Concentration (mM): 74.56 
			MW: 3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 119.98 
			MW: 1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td>Final Concentration (mM): 180.16 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td>Media: Intracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 234.5 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 507.18 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Final Concentration (mM): 523.18 
			MW: 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>380.35</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 380.35 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicuculline</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>131</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 417.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 276.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8001</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.005 
			MW: 645.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BoNT/A-/G</td>
			<td>Metabiologics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Media: 
			Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetanus toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3194</td>
			<td>Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL-2</td>
			<td>Final Concentration (mM): N/A 
			MW: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAnalysis (version 6.0.7)</td>
			<td>Synaptosoft, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Event detection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro (version 6.22A)</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for visualization of recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Heka</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>patch-clamp amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>ECB10USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Corning 7740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm glass coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stovall Belly Dancer Shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adhesion dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-101</td>
			<td>Corning 3262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons

Terapeutiske og mekanistiske studier av presynaptisk målrettede clostridial nervegifter (CNTs) har vært begrenset av behovet for en skalerbar, celle-basert modell som produserer fungerende synapser og gjennomgår fysiologiske responser til rus. Her beskriver vi en enkel og robust metode for å effektivt skille mus embryonale stamceller (ESCs) i definerte linjer av postsynaptisk aktive, nettverksbaserte nevroner. Etter en åtte dagers differensiering protokollen, mus embryonale stamcelle-avledet nevroner (ESNs) raskt uttrykke og compartmentalize neurotypic proteiner, danner nevrale morfologi og utvikle iboende elektriske responser. Etter 18 dager etter differensiering (DIV 18), ESNs vise aktiv glutamaterg og γ-aminosmørsyre (GABA) giske synapser og emergent nettverks atferd preget av en eksitatoriske: hemmende balanse. Å avgjøre om rus med CNTs funksjonelt antagonizes synaptic nevrotransmisjon, og dermed kopiere the in vivo patofysiologi som er ansvarlig for kliniske manifestasjoner av botulisme eller stivkrampe, ble hel-celle patch clamp elektrofysiologi brukes til å kvantifisere spontane miniatyr eksitatoriske postsynaptiske strømmer (mEPSCs) i ESNs utsatt for stivkrampe neurotoxin (telt) eller botulinumnevrotoksin (Bont) serotyper / A- / G. I alle tilfeller, ESNs oppviste nesten fullstendig tap av synaptisk aktivitet innen 20 timer. Berusede nevroner forble levedyktig, som demonstrert ved uendret hviler membranpotensialer og iboende elektriske responser. For ytterligere å karakterisere følsomheten av denne tilnærmingen, ble doseavhengige virkninger av forgiftning på synaptisk aktivitet målt 20 timer etter tilsetning av bont / A. Forgiftning med 0.005 pM bont / A resulterte i en betydelig minsk i mEPSCs, med en median inhiberende konsentrasjon (IC50) på 0,013 pM. Sammenligninger av median doser indikerer at funksjonelle målinger av synaptic hemming er raskere, mer konkret og mer sensitiv enn SNAREcleavage analyser eller musen letalitetsprøven. Disse data validere bruk av postsynaptisk kombinert, stamcelle-avledet nevroner for svært spesifikk og sensitiv påvisning av CNTs.

Vi har utviklet en differensiering protokoll som muliggjør økonomisk fremstilling av store mengder av meget rent stamcelleavledet nerveceller fra mus ESCs (vist i detalj i figur 1 A) 8,11. Denne metoden har vært brukt over en periode på flere år til reproduserbart skille privat generert og kommersielt tilgjengelige ESC linjer inn nevroner av definerte linjene 12-14. Kritiske elementer av denne protokollen omfatter (1) tilpasning av ESCs å mater celle-fri suspensjon kultur; (2) riktig vedlikehold av suspensjonskulturer; og (3) i henhold til differensiering roterende betingelser. Overgang til suspensjon kultur dramatisk reduserer tid og kostnader for ESC vedlikehold, og fjerner behovet for å fjerne mateceller før differensiering. Etter suspensjon tilpasning, er Oct3 / 4 ekspresjon konsistent gjennom minst 30 passasjer, noe som indikerer at suspensjonen tilpasning ikke endrer ekspresjonen av pluripotency markører (figur 1B-D </strong&gt;). ESCs er egnet for neuronal differensiering når celleutbytte konsekvent overstiger 1 x 10 7 celler per passasje. Dette skjer vanligvis i løpet av ti passasjer etter suspensjon tilpasning eller fem passasjer etter tining av ESCs som tidligere var suspensjon tilpasset. Mekanisk rotasjon differensiere aggregater ble også funnet å være kritisk til økt nevronale yield. Tilsetningen av en rotasjonsrister eliminert super-aggregatdannelse, økende aggregat levedyktighet og produsere et ~ 300% økning i utbyttet av nevrale stamceller (NPC) ved DIV 0 (figur 1E). En typisk differensiering starter med 3,5 x 10 6 ESCs på DIV -8 og produserer 115 x 10 6 NPCer på DIV 0, omtrent 60% av de som vil overleve og bli nerveceller. De resterende 40% består av ikke-neuronale celler og er i stor grad eliminert ved serum deprivasjon mellom DIV 0 - 1. Det lille antall vedvarende gliaceller kan fjernes ved tilsetning av mitotiske inhibitors fra DIV 2 - 4 eller DIV 8 - 12. plating tettheten er kritisk på DIV 0; nevroner belagt altfor tynt vil ikke overleve utover 2 uker. Innen dager etter plating, differensierte nevroner vise nevronale morfologi og compartmentalize neurotypic proteiner, slik som den somatodendritic markør MAP2 og aksonal markør Tau (Figur 2A). Av DIV 14 synapsin-1 + puncta kan identifiseres ved axodendritic grensesnitt, som kan tyde på synapse formasjon. Dette er forenlig med ekspresjon av synaptiske markørproteiner før DIV 7 8,11. Nevronale morfologi fortsetter å modnes gjennom DIV 21, der tidskulturer utviser forseggjort axodendritic arbors og store synaptic puncta (Figur 2A). Hvis vedlikeholdes riktig, ESNs forbli levedyktig og aktiv i minst fire uker etter plating. Langsgående uttrykk profilering ved hjelp av RNA-sekvense bekreftet morfologisk og proteomikk bevis for nevronale spesifikasjonen end modning 11,15. Representative markører for utviklings progresjon utstilt scenen spesifikke uttrykk profiler, inkludert Oct3 / 4, nestin, DCX, Neun og KCC2 (figur 2B). Av DIV 0, ESNs uttrykt rikelig kopier av nevroner spesifikke strukturelle proteiner, inkludert MAP2 og Tau. Konsistent med tidligere funn, ble markører for bare to nevronale subtyper observert: vGluT2-uttrykke midthjernen / hindbrain glutamaterge nevroner og gabaergic interneuroner 8. Tilsvarende et bredt utvalg av glutamaterge og gabaergic markører utstilt skarpe økninger i uttrykk mellom DIV 0 og DIV 7, inkludert presynaptiske SNARE proteiner som kreves for neurotransmitterfrigivning; nevrotransmitterreseptorer som kreves for post-synaptiske responser; og stillas proteiner som kreves for å tjore disse reseptorene til den postsynaptiske membran. Nevroner utviser modne iboende elektriske egenskaper ved DIV 14 og spontane miniatyr eksitatoriske postsynaptiske strømninger av DIV16 16. Den målte Inhibering av synaptisk transmisjon (tåkedis) assay ble anvendt for å evaluere effekten av forgiftning på synaptisk aktivitet. Ved å sammenligne mEPSC frekvenser mellom beruset og kjøretøy-behandlet DIV 24 + ESNs, gir MIST en kvantitativ og spesifikk måling av rus basert på den funksjonelle hemming av synaptisk aktivitet (figur 3A). MIST ble brukt til å måle effekten av Bont / A- / G eller telt på synaptisk aktivitet i ESNs ved 20 timer etter badet tillegg av hver toksin. Giftstoffer ble tilsatt ved en konsentrasjon tilsvarende 10 ganger den EC50 verdi, som tidligere bestemt ved immunoblotanalyse av SNARE protein spalting 11. Alle toksiner redusert mEPSC frekvenser til mindre enn 5% av bærer-behandlede kontroller. Reduksjoner i synaptiske priser var ikke skyldes celledød eller endret egenverdi svar, siden berusede ESNs var i stand til å bli lappet, sparket gjentatte aksjonspotensialeri respons til strøminjeksjon og viste ingen signifikant endring i hvilende membranpotensial (figur 3B, C). For å sammenligne følsomheten av tåke til eksisterende metoder for å detektere CNTs, deteksjonsgrense og median inhiberende konsentrasjon (IC50) ble bestemt 20 timer etter tilsetning av bont / A til ESNs. Rus med så lite som 0,005 pM Bont / A produsert en statistisk signifikant reduksjon i mEPSC frekvens, med en IC 50 verdi av 0,013 pM og fullstendig knebling av synaptisk aktivitet ovenfor 24:05 (Figur 4A). Denne IC 50-verdien tilsvarer ca. 0,5 muse letale enheter / ml, noe som tyder på at tåke dobbelt så følsomme og 2- til 4-ganger raskere enn MLA i påvisning av nærvær av bont / A. Immunoblotanalyse målinger av SNAP-25 cleavage produsert en EC 50 verdi på 24:38 og en minste detekterbare dose av 24:05, noe som indikerer at MIST er omtrent 30 ganger mer følsomenn immunoblot-basert deteksjon av spaltede SNARE proteiner (Figur 4B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" /> Figur 1. Suspensjon tilpassede ESNs forbli mitotisk stabil og uttrykke markører for pluripotency. (A) Skjematisk av ESC vedlikehold og differensiering. Tilstedeværelsen eller fraværet av retinsyre (RA) eller leukemi-inhiberende faktor (LIF) er markert med + eller -. En sammenligning mellom dager in vitro (DIV) og klassiske utviklingsstadier (DS) for primære nevroner kulturer er gitt 17. (B) Formerinasanalyse priser for R1, D3 og C57BL / 6J ES cellelinjer stabiliseres innen fem passasjer etter overgangen til suspensjon kultur. (C) Flowcytometri data viser ingen materielle endringer i Oct3 / 4 uttrykk i R1, D3 og C57BL / 6J ES cellelinjer målt over 25 passasjer i suspensjon kultur (n = 6 for hver). (D) Faktiske celleutbytter under rutine aging for en suspensjon tilpasset R1 ESC linje målt mellom passasjer 5 og 30 (svart linje). Teoretiske kumulative avkastning hvis ingen celler blir kassert under aging blir også presentert (rød linje). (E) Bright-feltet bilder av DIV 0 aggregater produsert under statisk (venstre) eller roterende forhold (til høyre). Roterende forhold produsert sfæriske aggregater uten tettbebyggelse og økt NPC gir tre ganger (p &lt;0,001, bestemmes ved hjelp av T-test) 11. * Angir en P &lt;0,05. Dette tallet har blitt forandret fra Hubbard et al. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" /> Figur 2. Morfologisk, proteomic og transcriptomic bevis på neuronal spesifikasjon og modning (A) Immunocytochemistry fra DIV 7 -. DIV 49 demonstrerer neuronal arborization og utseendet av synaptiske puncta ved axodendritic grensesnitt. Aksoner er merket med Tau (grønn), er dendritter merket med MAP2 (rød), er presynaptiske avdelinger merket med synapsin (hvit), og atomkjerner er farget med DAPI (blå). (B) Longitudinal uttrykk profilering av representative gener som viser utviklingsstadiet spesifikke uttrykk og angivelse nevrale subtyper. Alle gentranskriptene er uttrykt som omtrentlig antall utskrifter per celle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" /> Figur 3. ESNs henhold. gå hemming av synaptisk aktivitet når de utsettes for Bont / AG og telt (A) Representative spor fra ESNs samlet 20 timer etter badet tillegg av ~ 10 x EC 50 verdier av Bont / A - / G, telt eller kjøretøy. Hver neurotoxin redusert synaptisk aktivitet med mer enn 95% i forhold til kontrollene. (B) Berusede nevroner forble i stand til å avfyre ​​gjentatte APs svar på depolariserende aktuell injeksjon (som demonstrert for Bont / A, men observert i alle berusede kulturer) og (C) viste ingen endringer i den negative hvilemembranpotensialet (C; n&gt; 18 for hver behandling). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" /> Figur 4. Fastsettelse av sensitiviteten av MIST i Bont / A-behandletESNs. (A) MIST målinger av synaptisk aktivitet 20 timer etter badet tilsetning av bont / A. Representative voltage-clamp spor segmenter viste en nedgang i mEPSC frekvens følgende Bont / A eksponering (venstre side). Kvantitering av mEPSC frekvens (søylediagram, på høyre side, n = 20 for kontroller; n = 11 - 22 For hver dose) bekrefter en doseavhengig reduksjon i mEPSC frekvens. Median inhibitorisk konsentrasjon ble bestemt ved hjelp av en minste kvadraters tilpasning av en ikke-lineær regresjon ved anvendelse av en fire-parameter variabel helling (R2&gt; 0,91). Oppmerksom deteksjonsgrensen ved MIST i ESNs er minst 0,005 pM. (B) Bont / A rus av ESNs resultater i spalting av SNAP-25 som visualiseres ved gel mobilitet turnus (en representant western blot på venstre side med et søylediagram som viser kvantifisering av SNAP-25 cleavage på høyre; n = 4) . Legg merke til redusert følsomhet ved hjelp SNARE protein cleavage (SNAP-25) som et endepunkt (EF 50 av 24:36) vs. </em&gt; MIST (IC 50 av 0,013 pM). * Viser en P &lt;0,05; *** Indikerer en P &lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Funksjonell Evaluering av biologisk nervegifter i Nettbaserte Kulturer av Stem Cell-avledet sentralnervesystemet nevroner

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Optisk Clearing av musen sentralnervesystemet Bruke Passiv CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Intratekal levering av Antisens Oligonukleotider i Rat Central nervesystemet

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...