Name: functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons
Uploaded: 2015-02-05T14:00:00
Duration: 15 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Эта работа финансировалась Национальным институтом Национального института здравоохранения аллергии и инфекционных заболеваний (IAA номер AOD12058-0001-0000) и обороны Агентство по уменьшению угрозы в - совместных научно-технических отделение, медицинская Отдел S &amp; T (номера грантов CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 и CBM.THRTOX.01.RC.014). Это исследование было проведено в то время как PB провел защиты от угроз Снижение Агентства Национальный исследовательский совет по исследованиям в Associateship премии и KH провел Национальный исследовательский совет по исследованиям в Associateship Award. Мы благодарим Ангела Адкинс и Кейли Tuznik (USAMRICD) для оказания технической помощи; и Синди Kronman (USAMRICD) за помощь в редактировании. Мнения, выраженные в этой статье, являются мнениями авторов и не отражают официальную политику Департамента армии, министерства обороны или американского правительства.

<ol>
	<li>Simpson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+steps+in+botulinum+toxin+action.">Identification of the major steps in botulinum toxin action.</a> Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).</li><li>Singh, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+neurotoxin+structure,+engineering,+and+novel+cellular+trafficking+and+targeting.">Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting.</a> Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).</li><li>Larsen, J. C. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Army+botulinum+neurotoxin+(BoNT)+medical+therapeutics+research+program:+past+accomplishments+and+future+directions.">Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions.</a> Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).</li><li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists.">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+quantitative+detection+of+botulinum+neurotoxin+in+neurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).</li><li>Mesngon, M., McNutt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Latrotoxin+Rescues+SNAP-25+from+BoNT/A-Mediated+Proteolysis+in+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons.</a> Toxins. 3, 489-503 (2011).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Whitemarsh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+human+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+highly+sensitive+botulinum+neurotoxin+detection.">Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection.</a> Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).</li><li>Hubbard, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+derivation+of+enriched+glutamatergic+neurons+from+suspension-cultured+mouse+ESCs+for+neurotoxicology+research.">High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research.</a> BMC Neurosci. 13, 127 (2012).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).</li><li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines:+formation+of+visceral+yolk+sac,+blood+islands+and+myocardium.">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+RNA+sequencing+of+the+deep+transcriptome+during+neurogenesis+of+cortical+glutamatergic+neurons+from+murine+ESCs.">Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs.</a> F1000Research. 2 (35), (2013).</li><li>Gut, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+stem+cell-derived+neurons+to+evaluate+the+time-+and+dose-dependent+progression+of+excitotoxic+injury.">Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury.</a> PLoS One. 8, e64423 (2013).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Capek, P., Dickerson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+the+deadliest+toxin:+technologies+for+botulinum+neurotoxin+detection.">Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection.</a> Toxins. 2, 24-53 (2010).</li><li>Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+interactions+in+vivo:+evidence+from+botulinum+A,+C,+D+and+E+action+at+frog+neuromuscular+junction.">Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction.</a> The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).</li><li>Baskaran, P., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+effects+of+botulinum+neurotoxin+a+on+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction.</a> Muscle &amp; Nerve. 50, 206-215 (2014).</li></ol>

The U.S. Government has filed two international patent applications that incorporate methods described in this article: PCT/US2014/22042, titled &#8220;Methods of detecting neurotoxin using synaptic activity&#8221;; and PCT/US13/40641, titled &#8220;Toxin detection using stem cell-derived neurons.&#8221;

Ток золотой стандарт для обнаружения УНТ, определения серотипа и количественного определения ГНД. MLA опрашивает весь диапазон хоста: токсин, необходимых для взаимодействия интоксикации происходит в естественных условиях (например, токсин связывания с рецептором клеточной поверхности, интернализации токсина-рецепторного комплекса, LC транслокации в цитоплазму, LC-опосредованного расщеплени субстрата и ингибирование синаптической нейротрансмиссии) 18. Однако, несмотря на ГНД предлагает физиологический модель опьянения, это ресурсоемкий, можно смешивать загрязнителями и включает в себя большое количество мышей со смертью в качестве конечной точки. Альтернативно, анализы на основе клеток для детекции и количественного BoNT были ограничены первичных культурах нейронов, которые также требуют использования животных, или линий клеток нейробластомы, которые не способны формировать синапсы и, как правило, обладают низкой чувствительностью к нейротоксинов 8. На сегодняшний день, большинство измерений интоксикации в гоESE платформы на основе клеток полагались на обнаружении протеолитического расщепления SNAP-25, VAMP1 / 2 или синтаксина-1 11. Это проблематично, поскольку SNARE белка расщепление было показано, что нелинейно связаны с ингибированием синаптической в естественных условиях, и, следовательно, не может точно отражать интоксикацию или восстановление после интоксикации 19,20. Идеальный сотовый основе модели системы для обнаружения УНТ бы (я) будет нейрон основе; (II) можно синаптически в сочетании с neurotypic электрических ответов; (III) весьма чувствительны ко всем серотипов УНТ или подтипов; и (IV) предложение масштабируемости, производительности и аналитические раз, эквивалентные или улучшенные над ОМС, по более низкой цене, и без необходимости использования животных. Для удовлетворения этих требований, мы разработали способ получения больших количеств высокообогащенного, сетевых культур глутаматэргическую и ГАМК нейронов из коммерчески доступных мыши ЭСК линий. Затем мы разработали туман анализа для количественногосинаптической торможения в ответ на интоксикацию с палаткой и BoNT / A- / G. В то время как MIST анализ может проводиться на любом синаптически активного нейрона населения (например, первичные нейроны или срезах мозга), в настоящее время номеров ESN являются только в пробирке происходит модель нейрона, что воспроизводимо развивается сеть поведения возникающие и поэтому подходит для MIST исследовании. Производство достаточного количества нейронов определенного рода для исследований УНТ потребовалось несколько нововведений в ESC культуры и дифференциации. Во-первых, путем выбора для культивирования и ESCs, которые могут выжить подвески-адаптации, мы исключили возможность загрязнения фидерными клетками и необходимостью очистки фидерные клетки от ESCs в начале дифференциации. Хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе суспензионного адаптации неизвестны, подвески приспособлены ЭСК оставаться митотически активны, сохраняют Oct3 / 4 выражение и продолжают быть нейрогенной. Используя этот метод, ~ 1,5 х 10 7 EСК, как правило, восстанавливается каждый проход. Во-вторых, производство НПС была увеличена ~ 300% за счет включения механическое перемешивание, чтобы предотвратить агломерацию в процессе дифференциации, якобы повышение доступности питательных веществ интерьеров агрегатов. В процессе мы обнаружили, что сыворотка используется для ESC культуры и дифференцировки нейронов является наиболее важным компонентом в поддержании нейрогенные ЭСК. Для лучшего успеха, мы рекомендуем подвеску с адаптацией ЭС клетки к каждому участку сыворотки и накопления запасов сыворотку при -20 ° С, чтобы поддержать ESC культуры и дифференцировку нейронов в течение срока действия. Как и в большинстве синаптически активными культурами, DIV 14 + номеров ESN очень чувствительны к резким изменениям рН, и даже кратковременного воздействия атмосферных концентраций СО 2 может привести к нейротоксичности в течение 24 часов. Для экспериментов, требующих лечения культур с последующим инкубации продолжительностью O / N или больше, нейроны должны рассматриваться непосредственно яп инкубатор или переданы на постоянное CO 2 камеры до эксперимента. Различные методы подтвердил нейрогенез и нейронов созревания, в том числе МТП, транскрипции профилирования и целых клеток патч-зажим электрофизиологии. Временные изменения в экспрессии генов и нейронов морфологии согласуются с быстрым прогрессированием через стадии развития нейрогенеза, и DIV 16, номеров ESN выставлены возбуждающие и подавляющие миниатюрные постсинаптические токи с возникшей сети поведения 16. Свидетельство синаптической активности предположил, что номеров ESN может повторить pathophysiologies, ответственных за клиническими проявлениями ботулизма и столбняка. Это было подтверждено с помощью MIST, чтобы показать, что интоксикация ботулинического токсина / A- / г или палатку нарушение mEPSC частот от&gt; 95% по сравнению с обработанных носителем или необработанными нейронами. Измерения чувствительности туманом на BoNT / A указал на средние ингибирующиеконцентрация (IC 50) 0,013 мкМ (эквивалентно 0,5 мыши летальной ед / мл) и предела-о-обнаружения ниже 0,005 мкМ, измеренный при 20 ч после ванны того. Основываясь на этих ценностях, MIST примерно в два раза чувствительнее и 2 - 4 раза быстрее, чем ОМС и в 30 раз более чувствительны, чем иммуноблот на основе обнаружения расщепленных SNAP-25. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сетевые популяции клеток, полученных нейронов стволовых предлагают физиологический, клеточно-ориентированная модель опьянения. В сочетании с улучшенными методами, чтобы получить сетевые культуры ESN от подвески приспособлены ЭСК, использование MIST должны уменьшить необходимость проведения испытаний на животных и их недостатки, затрат и этических проблем, ОМС, обеспечивая более быстрое, чувствительные и специфические меры интоксикация. Хотя цельноклеточная патч-зажим электрофизиологии является метод с низкой пропускной для идентификации присутствия активных нейротоксинов, он предлагает разрешение и спеЭду, что недостижимо с помощью молекулярных методов. Эти результаты также свидетельствуют о том, что применение активности в зависимости от методов оценки синаптической активности и поведение сети может позволить быстрое и специфической детекции нейротоксинов. Такие подходы выше пропускная бы механистические исследования, терапевтическое или диагностических анализов возможные для широкого круга neuromodulatory агентов, в том числе УНТ.

Основная цель данного метода заключается в функционально оценить синаптической активности в сетевых культур клеток, полученных нейронов стволовых подверженных нейротоксинов клостридий. Это первая демонстрация в пробирке, полученной модели, которая функционально повторяет pathophysiologies, ответственных за клиническими проявлениями ботулизма и проверяет номеров ESN в подходящей модели для обнаружения УНТ, терапевтического обследования и механических исследований. BoNTs являются крайне опасная бактериальная нейротоксины, полученные членами вида Clostridium. В том числе недавно предложенной ботулинического токсина / ч, восемь отличающихся по антигенам серотипов ботулинического токсина были описаны (/ A- / ч) 1,2. Все серотипы выражены в 150 кДа пептидов, которые посттрансляционно прорезей для получения dichain, состоящую из 100 кДа тяжелой цепи (НС) и 50 кДа легкой цепи (LC), связанный дисульфидной связью 3. HC посредником связывание с пресинаптических рецепторов и ЛОРRy токсина в нейрон через синаптические эндоцитоза. Во время эндосомный обработки, HC подвергается структурной реорганизации, чтобы сформировать пор в везикулы мембраны, что облегчает перемещение в ЛЦ в пресинаптической цитозоле. LC затем специально ориентирована и расщепляет растворимый N -ethylmaleimide чувствительных привязанность слияние белка-рецептора (SNARE) белки в пресинаптической отсека: SNAP-25 (BoNT /, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) или синтаксин (BoNT / C) 1. Расщепление любой из этих SNARE белков предотвращает сборку синаптической экзоцитоза техники, тем самым блокируя высвобождение нейромедиаторов. Эта комбинация эффективного нейронов адресности и пресинаптической локализации оказывает BoNTs самые мощные яды известно, по оценкам смертельных доз человека, как низко как 0,1 - 1 нг / кг 1. Биохимические анализы могут быть использованы для обнаружения присутствия или активности CNT ЖК с высокой чувствительностью. Тем не менее, эти методы не Interrogate способность к связыванию токсина, ENTER, активировать и функции в нейронах, и поэтому косвенные и, возможно, вводящие в заблуждение меры присутствии активного токсина. В отличие от этого, функциональные пробы интоксикации, такие как мышь летальности анализа (MLA) всесторонне оценить способность УНТ успешно вести переговоры на всех этапах внедрения и активации, обеспечивая более актуальных и конкретных оценок токсина деятельности. В то время как MLA является золотым стандартом обнаружения ботулинического токсина, это метод, в естественных условиях, которая использует смерть, как конечной точки и, следовательно, имеет ограниченное применение в качестве платформы исследования. Попытки разработать модели на основе клеток УНТ опьянения, подходящей для механистических исследований и лечебных скрининга также понесли значительные ограничения. В то время как первичные культуры нейронов обеспечивают высокую степень физиологической релевантности, их использование осложняется рядом факторов, в том числе высокую стоимость ресурсов, относительно низким выходом, при наличии множественных нейронов субвиды и обширная нормативно-административный надзор связан с использованием животных. В качестве альтернативы первичных нейронов, нейрогенные клеточные линии (которые могут быть вызваны, чтобы принять нейроноподобных свойства от химической стимуляции), такие как нейробластомы и надпочечников хромаффинных клеток были использованы в качестве моделей в пробирке интоксикации. Поскольку эти клетки являются постоянно культивируют до индукции, они с высокой степенью масштабируемости и поэтому хорошо подходит для умеренно-пропускной подходов. Тем не менее, их актуальность вызывает сомнения, так как индуцированные фенотипы, как правило, неоднородны, плохо чувствительны к УНТ и не проявляют критических нейронов поведения, в том числе неспособность сформировать до и после синаптические отсеков, которые собираются в функциональную синапсов 4. При отсутствии физиологически интактных пресинаптических отсеков, полный спектр токсин: нейронных взаимодействий не могут быть воспроизведены, и поэтому функциональные измерения опьянения не возможно 5. Нетт удивительно, попытки провести механистические исследования или скрининг снадобья для BoNTs с использованием индуцированных нейрогенные клеточных линий привели в результатах, которые несовместимы с в естественных условиях и первичных исследований нейронных 6. Было предложено, что стволовые центральной нервной системы (ЦНС) нейроны клеток получают может обеспечить следующего поколения на основе клеток платформу для исследования ботулинического токсина, который сочетает релевантности первичных нейронов с гибкостью культивируемых клеточных линий 7-10. В частности, клеток, полученных нейроны стволовых мыши (номеров ESN) были найдены, чтобы быть очень чувствительны к физиологических доз BoNT / A- / г и повторить многие в естественных ответов на интоксикации, в том числе дифференциальных persistences, с повышенной активностью интоксикации, и серотипа -специфические потенции 5,8,11. Такое поведение предположить, что в естественных условиях механизмов поглощения ботулинического токсина, обработки, торговли и деятельности сохраняются в номеров ESN. Тем не менее, ингибирование синаптической Activitу есть подпись проявление ботулизма, и, следовательно, демонстрируя потерю синаптической активности после интоксикации УНТ необходимо до заключения, что номеров ESN являются подходящими в пробирке, полученной модели на основе клеток для исследований УНТ. Для измерения влияния интоксикации УНТ на синаптической активности, цельноклеточная патч-зажим электрофизиологии был использован для количественного моносинаптические токи в обработанных носителем или CNT-лечение DIV 21 + номеров ESN. Мы обнаружили, что опьянение номеров ESN с BoNT / A- / г или TeNT причиной&gt; 95% потерю активности синаптической течение 20 ч во всех случаях. Дальнейшая характеристика провели 20 ч после интоксикации BoNT / показал дозозависимое влияние на синаптической активности, с пределом обнаружения ниже 0,005 мкм и IC 50 значения 0,013 мкМ. Эти результаты показывают, что чувствительность и временные рамки электрофизиологического обнаружения интоксикации значительно улучшилось по сравнению с сопоставимыми иммуноблот на основе анализирует о SNAP-25 расщеплению и в естественных условиях мыши летальности анализов, показывающие, что функциональные измерения интоксикации синаптически активных культур нейронов может способствовать более чувствительной, конкретные и быстрые методы, чтобы охарактеризовать клеточный ответ на BoNT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. ESC and ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC culture medium 
			Formulation and notes: 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES qualified FBS</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>90 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>1.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>107 Units/mL LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>60 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC differentiation medium 
			Formulation and notes: 436.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC-qualified serum</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Media: NPC trypsinization medium 
			Formulation and notes: 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (18.3%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>Media: freeze in 5 mL aliquote 
			Formulation and notes: 0.266 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Media: Surface coating solutions 
			Formulation and notes: 2.5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Media: use within 1 wk 
			Formulation and notes: 100 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>Media: NPC culture medium 
			Formulation and notes: 492.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N2 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888-022</td>
			<td>Media: ESN culture medium 
			Formulation and notes: 482.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up 1 month 
			Formulation and notes: 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 &#176;C 
			Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Formulation and notes: store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 &#176;C. Stable for 6 mos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. MIST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: Extracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60135</td>
			<td>Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) 
			Final Concentration (mM): 74.56 
			MW: 3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 119.98 
			MW: 1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td>Final Concentration (mM): 180.16 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td>Media: Intracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 234.5 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 507.18 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Final Concentration (mM): 523.18 
			MW: 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>380.35</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 380.35 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicuculline</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>131</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 417.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 276.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8001</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.005 
			MW: 645.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BoNT/A-/G</td>
			<td>Metabiologics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Media: 
			Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetanus toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3194</td>
			<td>Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL-2</td>
			<td>Final Concentration (mM): N/A 
			MW: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAnalysis (version 6.0.7)</td>
			<td>Synaptosoft, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Event detection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro (version 6.22A)</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for visualization of recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Heka</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>patch-clamp amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>ECB10USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Corning 7740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm glass coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stovall Belly Dancer Shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adhesion dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-101</td>
			<td>Corning 3262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons

Терапевтические и механистические исследования пресинаптически целевых нейротоксинов клостридий (УНТ) были ограничены необходимостью масштабируемой, клеточно-ориентированная модель, которая производит функционирования синапсов и подвергается физиологические реакции к интоксикации. Здесь мы опишем простой и надежный способ эффективно дифференцировать мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в определенные происхождений синаптически активных, сетевых нейронов. После протокола дифференцировки 8 дней, клеток получают нейроны мышиных эмбриональных стволовых (номеров ESN) быстро выражать и по полочкам neurotypic белки, образуют нейронные морфологии и развивать внутренние электрические ответы. К 18 дней после дифференцировки (Div 18), демонстрируют активную номеров ESN глутаматэргических и γ-аминомасляной кислоты (GABA) ергических синапсов и возникающих сетевых поведение характеризуется возбуждающим: ингибирующее баланс. Чтобы определить, интоксикация УНТ функционально противодействует ли синаптическую передачу нервного, таким образом, тиражирование йе в естественных условиях патофизиологии, который отвечает за клинические проявления ботулизма или столбняка, цельноклеточная патч зажим электрофизиологии был использован для количественного спонтанные миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи (mEPSCs) в номеров ESN, подверженных столбняка нейротоксина (тент) или ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) серотипов / A- / G. Во всех случаях, номеров ESN выставлены почти полную потерю синаптической активности в пределах 20 часов. Хмельные нейроны остаются жизнеспособными, о чем свидетельствует неизменных отдыха мембранных потенциалов и собственных электрических ответов. Для дополнительной характеристики чувствительности этого подхода, зависимые от дозы эффект интоксикации по синаптической активности были измерены 20 ч после добавления BoNT / A. Отравление с 0,005 мкМ BoNT / A приводит к значительному декремента в mEPSCs, со средним ингибирующей концентрации (IC 50) 0,013 мкМ. Сравнение средние дозы показывают, что функциональные измерения синаптической торможения быстрее, точнее и чувствительнее, чем SNAREАнализы расщепления или мышь летальность анализа. Эти данные проверки использования синаптически сочетании, стволовых клеток получены нейроны для очень специфической и чувствительного обнаружения УНТ.

Мы разработали протокол дифференциации, которая позволяет экономичное производство большого количества клеток, полученных нейронов высокой чистоты стволовых из ЭСК мыши (подробно в рис 1а) 8,11. Этот метод был использован в течение года, чтобы воспроизводимо отличить частным образом, и коммерчески доступные ESC линии в нейронах определенных линий 12-14. Критические элементы этого протокола включают в себя (1) адаптацию ЭСК фидерными бесклеточной культуральной суспензии; (2) надлежащее обслуживание суспензионных культур; и (3) дифференциации в соответствии с поворотными условиях. Переход к суспензионной культуре значительно сокращает время и затраты на обслуживание ESC, и устраняет необходимость снимать фидерные клетки до дифференциации. После адаптации подвески, Oct3 / 4 выражение соответствует по крайней мере 30 проходов, с указанием, что адаптация подвески не изменять экспрессию маркеров плюрипотентности (рис 1B-D </stroнг&gt;). ЭСК подходят для дифференцировки нейронов раз выход клеток последовательно превышает 1 х 10 7 клеток за один проход. Это обычно происходит в течение десяти проходов после адаптации подвески или пять проходов после оттаивания ЭСК, которые ранее были подвеска адаптированы. Механическое вращение дифференциации агрегатов также установлено, что решающее значение для увеличения нейронной урожая. Добавление ротационном шейкере устранены супер-образования агрегатов, увеличение совокупного жизнеспособности и получени увеличение выхода нейронных клеток-предшественников (НПС) в DIV 0 (рис 1E) ~ 300%. Типичный дифференциация начинается с 3,5 х 10 6 ЭСК в DIV -8 и производит 115 х 10 6 NPC, на DIV 0, примерно 60% из которых будет выжить и стать нейроны. Остальные 40% включают в себя не-нейрональных клеток и в значительной степени устранены в сыворотке лишением между DIV 0 - 1. Небольшое количество сохраняющихся глии могут быть удалены путем добавления митотических Inhibitors из DIV 2 - 4 или DIV 8 - 12. Плотность Покрытие имеет решающее значение в DIV 0; нейроны покрытием слишком редко не доживает до 2 недель. Через несколько дней после посева, дифференцированные нейроны обладают нейронные морфологии и по полочкам neurotypic белки, такие как somatodendritic маркера MAP2 и аксонов маркера Тау (рис 2А). По DIV 14 Синапсины-1 + Puncta могут быть определены на axodendritic интерфейсов, указывающие на формирование синапсов. Это согласуется с экспрессией маркерных белков синаптических предшествующих DIV 7 8,11. Нервные морфологии продолжают созревать через DIV 21, в это время культуры демонстрируют сложные axodendritic беседок и большой синаптической Puncta (рис 2а). Если ведется надлежащим образом, номеров ESN остаются жизнеспособными и активными в течение по крайней мере 4 недели после посева. Продольный профилирование выражения с РНК-последовательность подтверждается морфологическими и протеомный доказательства нейронов спецификации апбы созревания 11,15. Представительства маркеры прогрессирования развития выставлены профили экспрессии стадии конкретных, в том числе Oct3 / 4, нестин, DCX, NeuN и KCC2 (рис 2b). По DIV 0, номеров ESN выразил обильные копии нейронных конкретных структурных белков, в том числе MAP2 и Тау. В соответствии с предыдущими выводами, наблюдались маркеры только для двух нейронных подтипов: vGluT2-выражения среднего мозга / задний мозг глутаматергические нейроны и ГАМКергические интернейронов 8. Соответственно, широкий спектр глутаматэргических и ГАМК маркеров выставлены резкое увеличение в экспрессии между DIV 0 и DIV 7, в том числе пресинаптических белков SNARE, необходимых для высвобождения нейромедиатора; рецепторы нейротрансмиттеров, необходимых для пост-синаптических ответов; и леса белков, необходимых для троса эти рецепторы постсинаптической мембраны. Нейроны обладают зрелые внутренние электрические характеристики на DIV 14 и спонтанных миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов DIV16 16. Измеряется Ингибирование синаптической передачи (MIST) анализа была использована для оценки влияния интоксикации на синаптической активности. Сравнивая частоты mEPSC между опьянения и обработанной носителем DIV 24 + номеров ESN, туман дает количественную и измерения удельной опьянения на основе функционального торможения синаптической активности (рис 3А). MIST используют для измерения влияния BoNT / A- / г или палатке на синаптической активности в номеров ESN на 20 ч после ванны добавлением каждого токсина. Токсины были добавлены при концентрации, эквивалентной 10-кратное значение EC 50, как определено ранее иммуноблот анализа SNARE расщепления белка 11. Все токсинов снижается частоты mEPSC до менее чем 5% от обработанных носителем контрольных. Сокращение синаптических ставок не были связаны с клеточной гибели или изменены внутренние ответов, так как в состоянии алкогольного опьянения номеров ESN были пригодны исправлена, уволен повторные потенциалы действияв ответ на подачу тока и не проявлял никакого существенного изменения в мембранный потенциал покоя (рис 3б, в). Для сравнения чувствительности туман существующих методов для обнаружения УНТ, предел обнаружения и средние ингибирующие концентрации (IC 50) были определены 20 ч после добавления BoNT / A до номеров ESN. Интоксикация как мало, как 0,005 мкМ BoNT / A производится статистически значимое снижение частоты mEPSC, с IC 50 значением 0,013 мкМ и полного молчания синаптической активности, выше 12:05 вечера (рис 4а). Это IC 50 значение соответствует приблизительно 0,5 мыши летальных единиц / мл, предполагая, что туман в два раза чувствительны и от 2 до 4-кратного быстрее, чем ОМС в обнаружения присутствия BoNT / A. Измерения иммуноблот SNAP-25 расщепления произвел EC 50 значения 12:38 вечера и минимальной обнаруживаемой дозе 12:05 вечера, указывая, что MIST примерно в 30 раз более чувствительнычем иммуноблот на основе обнаружения расщепленных SNARE белков (рис 4б). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" /> Рисунок 1. Подвеска приспособлены номеров ESN остаются митотически стабильной и выразить маркеры плюрипотентности. () Схема обслуживания и дифференциации ESC. Наличие или отсутствие ретиноевой кислоты (RA) или ингибирующий лейкоз фактор (LIF) отмечен + или -. Сравнение между дней в пробирке (DIV) и классических стадий развития (DS) для первичных культур нейрон 17. (B) распространение тарифы на R1, D3 и клеточных линий C57BL / 6J ES стабилизировать пяти проходов после перехода на суспензионной культуре. (C) проточной цитометрии данные не демонстрируют существенные изменения в Oct3 / 4 выражения в R1, D3 и клеточных линий C57BL / 6J ES измеренное в 25 проходов в суспензионной культуре (N = 6 для каждого). (D) Фактический ресурс клеток при рутинной пассажей для подвески приспособлены R1 ESC линии, измеренной между проходами 5 и 30 (черная линия). Теоретические кумулятивные выходы, если клетки не отбрасываются при пассирования также представлены (красная линия). (E) светлого поля изображения DIV 0 агрегатов, выпускаемых под статической (слева) и поворотные условиях (справа). Поворотные условия производства сферические агрегаты без агломерации и увеличение NPC дает 3 раза (р &lt;0,001, определяется с использованием т-теста Стьюдента) 11. * Обозначает Р &lt;0,05. Эта цифра была изменена от Хаббарда и др. 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Фиг.2" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" /> Рисунок 2. Морфологические, прoteomic и транскриптомных свидетельствует о нейронов спецификации и созревания () Иммуноцитохимия от DIV 7 -. DIV 49 демонстрирует нейронов разветвление и внешний вид синаптической Puncta на axodendritic интерфейсов. Аксоны помечены Тау (зеленый), дендриты помечены MAP2 (красный), пресинаптических отсеков помечены Синапсины (белый), и ядра окрашиваются DAPI (синий). (B) Продольная выражение профилирование представительных генов, демонстрирующих процесс развития выражение стадии конкретных и указанием нейронов подтипов. Все генные транскрипты выражается в приблизительном количестве транскриптов на клетку. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" /> Рисунок 3. номеров ESN под. перейти ингибирование синаптической активности при воздействии BoNT / AG и палаточные () Характерные следы от номеров ESN собраны 20 ч после ванны добавлением ~ 10 х EC 50 значения BoNT / A - / G, палатка или транспортного средства. Каждый нейротоксин уменьшается синаптической активности более чем на 95% по сравнению с контрольной группой. (B) Хмельные нейроны оставались в состоянии стрелять повторные точки доступа в ответ на деполяризации тока инжекции (как показано на BoNT / A, но наблюдалось во всех опьянения культур) и (С) показывает отсутствие изменений в отрицательном мембранный потенциал покоя (С, N&gt; 18 для каждой обработки). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" /> Рисунок 4. Определение чувствительности Туман в BoNT / A-лечениеИзмерения туман синаптической активности 20 ч после ванны добавления BoNT / A номеров ESN. (). Представительства сегменты напряжения зажим следы выставлены снижение частоты mEPSC следующий BoNT / A воздействия (левая сторона). Количественный mEPSC частоты (гистограммы, справа, N = 20 в контрольной группе; N = 11 - 22 для каждой дозы) подтверждает дозозависимое снижение частоты mEPSC. Средние ингибирующие концентрации определяли с помощью наименьших квадратов из нелинейной регрессии с использованием переменным наклоном четыре параметра (R 2&gt; 0,91). Обратите внимание на предел обнаружения тумана в номеров ESN, по крайней мере 0,005 мкм. (B) BoNT / интоксикация приводит номеров ESN в расщеплении SNAP-25, как визуализировать сдвигами гель мобильности (представительство западной пятно на левой стороне с собой диаграмму, показывающую количественного SNAP-25 расщепления на право, N = 4) , Обратите внимание на снижение чувствительности с помощью расщепления белка SNARE (SNAP-25) в качестве конечной точки (EC 50 12:36 вечера) по сравнению с </eм&gt; MIST (IC 50 0,013 мкМ). * Обозначает Р &lt;0,05; *** Указывает на P &lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Травма Paradigm по расследованию центральной нервной системы в ремонт<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Прямая Внутрижелудочковая поставке лекарственных препаратов грызунов центральной нервной системы

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

В естественных условиях допроса центральной нервной системы Translatome по Polyribosome фракционирования

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Внутритековая доставка антисмысловых олигонуклеотидов в центральной нервной системе Крысы

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...