Name: a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

Мы благодарим доктора. Энтони Корнел и Лора Норрис Калифорнийского университета в Дэвисе и доктора Катарина Kreppel в университете Глазго для обеспечения комаров образцы из Танзании. Мы благодарим г-жу Смита Дас и д-р Дуглас Норрис из школы Джона Хопкинса здравоохранения для обмена образцы комаров из Замбии. Мы также благодарим г-н Ли В. Millon в лаборатории генетики ветеринарной для обучения по дизайну анализа. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья грант R01AI 078183 и R21AI062929.

1. ПЦР-амплификация <ol><li> Смешайте все ПЦР-праймеров (см дополнительный таблице S1) в 1,5 мл микропробирок. Каждый SNP имеет два праймера (вперед и назад). Убедитесь, что концентрация запас каждого ПЦР-праймера выдерживают при 100 мкМ. Оставьте достаточно смесь праймеров для 500-1000 реакций, чтоб?...

MDA состоит из пяти основных этапов: ПЦР-амплификации, креветки щелочной фосфатазы (SAP) реакции, расширения SNP, кондиционирования расширение продукт, и матрица-активированная лазерная десорбция / ионизации - времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии 33-37. Первый усиления стадия ПЦР у?...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii и Anopheles gambiae являются основными векторами, ответственные за передачу малярии в Африке 1. Эти три вида морфологически неотличимы 2 и может быть выделен только молекулярного анализа 3-9. Кроме того, есть много вниз по течению анализы регулярно проводимые чтобы помочь эпидемиологические и популяционные генетики исследований. Они включают в себя (1) определяют генотип анализ для видообразования островов 10-12 (2) генотипирование анализа признания, не синонимичные ОНП в 1014-м аминокислоты кодона положение гена пара (сопротивление нокдаун, или KDR, SNP) 13 -18 (3) обнаружения паразита ПЦР 19-23, и (4) Скрининг на хост-специфической ДНК в популяции комаров midguts 24,25. Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все эти анализы в одном мультиплексной реакции с цельюalyzing эпидемиологически важных характеристик переносчиками малярии в Африке. MDA анализ включает в себя несколько маркеров для выявления (1) видов (A. arabiensis, А. gambiae, А. coluzzii, или другая информация (ни один из трех)), (2) устойчивости к инсектицидам, представленных в КДР ОНП (как L1014F и L1014S) (3) Наличие двух крупных малярийных паразитов, Plasmodium тропической и П. трехдневной, и (4) Источник крови одного птичьего гриппа и шесть хозяев млекопитающих. Традиционно эти анализы были проведены в отдельных полимеразной цепной реакции. Когда все эти анализы сделаны с использованием обычной платформы ПЦР, что требует проведения реакции ПЦР 8-10 анализов и сопровождающих гель электрофореза шаги. Каждый человек ПЦР от подготовки к документированию результатов занимает 4-5 ч, в то время как метод MDA, представленные здесь занимает около 5 ч в совокупности. Это эквивалентно 90% экономии затрат на оплату труда в одиночку. MDA, представленные здесь стоит $ 5по образцу генотип все 33 ОНП. Это значительно дешевле, чем одиночных геля агарозы на основе анализа, который стоит около $ 1,50 за образец. Анализы выявления всех особенностей, охватываемые MDA потребует минимум 8-10 отдельных геля агарозы на основе анализов по цене $ 12-15 за образец. Кроме того, MDA значительно снижает вероятность получения ложно положительный или отрицательный, используя, по крайней мере три маркера для каждого паразита или источника Обнаружение хоста. Платформа мы использовали не ограничивается переносчиков малярии, но может быть использован в широком спектре приложений, таких как медицине, ветеринарии, а также основной биологии 26-28. Углубленные исследования Ассоциации или популяционной генетики исследования с привлечением большого (в порядке 100s) число образцов требуют экономически эффективных анализов скрининга для одновременного нескольких маркеров. Большинство исследований, которые используют два или более отдельных ПЦР могли бы реализовать MDA для более быстрых результатов при меньших затратах. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

Комплекс Anopheles gambiae видов включает в себя основную малярии комарами в Африке. Поскольку эти виды такого медицинское значение, несколько черт, как правило, характеризуется использованием молекулярных анализов, чтобы помочь в эпидемиологических исследованиях. Эти черты включают определение видов, стойкости к инсектицидам, состояние паразитарная инфекция, и предпочтение хозяина. Поскольку население комплекса Anopheles gambiae морфологически неразличимы, полимеразная цепная реакция (ПЦР) традиционно используются для идентификации видов. После того, как вид известен, регулярно проводится несколько ниже по течению анализы, чтобы выяснить дальнейшие характеристики. Например, мутации, известные как KDR в гене пара придает устойчивость к ДДТ и пиретроидов инсектицидов. Кроме того, фермент-иммуноферментный анализ (ИФА) или Plasmodium паразита обнаружения ДНК ПЦР используются для обнаружения паразитов, присутствующих в тканях комаров. Наконец, combinatioп ПЦР и рестриктаз дайджесты могут быть использованы для выяснения предпочтений хозяина (например, человеческая против крови животных) путем скрининга комаров bloodmeal для принимающей конкретных ДНК. Мы разработали анализ с несколькими обнаружения (MDA), который сочетает в себе все вышеперечисленные анализы в единый мультиплекс реакция генотипирования 33SNPs для 96 или 384 образцов одновременно. Потому что MDA включает в себя несколько маркеров для видов, выявление Plasmodium и принимающей идентификации крови, вероятность генерации ложных срабатываний или негативов значительно снижается по сравнению с предыдущими анализами, которые включают только один маркер за чертой. Этот надежный и простой анализ может обнаружить эти ключевые комаров черты экономически эффективно и в доли время существующие анализов.

Идентификация видов: Следующие 5 ОНП вместе выделить три вида (А. arabiensis, А. coluzzii и А. gambiae) (таблица 4). Если образец не является одним из трех видов, три ОНП (01073-213, 04679-157 и 10313 -052) не усиливаются. KDR генотип выведение резистентность ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Анализ Multi-обнаружения малярии комарами

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Evolution

Speciation and Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Протокол Mosquito воспитание (А. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Протокол Plasmodium Инфекции в тропической Определение фенотипа Комары и инфекции

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

Население Замена стратегий борьбы с векторным населения и использование Wolbachia pipientis генной Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Протокол Анализы RNAi у взрослых комаров (А. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Предотвращение распространения малярии и лихорадки денге с использованием генетически модифицированных комаров

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Строительство Лучше Mosquito: Идентификация генов Включение малярия и лихорадка денге Сопротивления в gambiae А. и А. aegypti комаров

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Передача вирусов растений Использование Белокрылки

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Токсикологические анализы для тестирования воздействию эпигенетические препарата на развития, плодовитость и выживаемость малярийных комаров

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...