Name: differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

हम हेला संवर्धन और अभिकर्मक के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए hNSCs की तैयारी में मदद करने के लिए जूली Heward, और Lavaniya Thanabalasundaram स्वीकार करते हैं।

<ol>
	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. 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P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

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आकलन और स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को सुधारने के लिए इन विट्रो assays में नए के विकास को हमेशा अपने functionalities और चिकित्सीय क्षमताओं की जांच के लिए एक चुनौती पेश की है। दीर्घकालिक और इन विट्रो भेदभाव परख में एक मजबूत 3 डी के विकास के लिए आवश्यक hNSCs के स्थिर लगाव, सामग्री और संरचनाओं के कार्यकाल में विभिन्न विशेषताओं के साथ कई 3 ​​डी substrates के परीक्षण के द्वारा संबोधित किया गया था। परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी इष्टतम सेल बोने एकाग्रता और मूल्यांकन scaffolds के laminin लेपित किया जा करने के लिए आवश्यकता की पहचान की। हमारे hNSCs अनायास पर अंतर कर सकते हैं हालांकि मानक 2D विभेदित hNSCs की तुलना में जब अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम द्वारा मापा के रूप में चार-OHT और विकास का पहलू को हटाने, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली के कार्यान्वयन उनके भेदभाव क्षमता में एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाया। 3 डी प्रेरित विभिन्न के प्रभाव की जांच करने के लिएhNSC miRNA अभिव्यक्ति पर ntiation हम एक पीसीआर सरणी का इस्तेमाल किया। मानक चिप माइक्रोएरे मुकाबले के साथ पीसीआर सरणी ब्याज की miRNA का एक सीधा मात्रा का ठहराव और सत्यापन का लाभ प्रदान करता है। पीसीआर सरणी 96 से यहां भी कम समय में, उदाहरण के लिए सरणी प्रति miRNA की कुल संख्या के कार्यकाल में ही सीमित है, यह पहले से स्टेम सेल के विकास में सूचना दी कि हमारे मामले में, विशेष रूप से ब्याज की miRNAs को शामिल करने के आधार पर किया जा सकता है। मार्ग ध्यान केंद्रित miRNAs की अभिव्यक्ति समान hNSCs के साथ तुलना में 3 डी और 2 डी विभेदित hNSCs में profiled गया था। सबसे महत्वपूर्ण नीचे विनियमित miRNAs चयनित और ऑनलाइन उपलब्ध एल्गोरिदम (डायना लैब, PicTar, और TargetScans) का उपयोग कर अपनी कार्यक्षमता और जैविक व्याख्या का निर्धारण करने के इरादे के साथ उनके ख्यात लक्ष्य mRNAs का आकलन करने के लिए विश्लेषण किया गया। एक एकल miRNA लक्ष्य के सैकड़ों पहचान कर सकते हैं और इस कारण हम एक में उपयुक्त उम्मीदवार हो सकता है 3 &#39;UTR mRNAsthat साथ miRNA बातचीत मान्यxonal विनियमन। NR4A3, HSA-मीर 7, और मीर-17 परिवार का एक लक्ष्य, हिप्पोकैम्पस अक्षतंतु के भेदभाव, अस्तित्व, apoptosis और विनियमन में शामिल कर रहे हैं, अभिव्यक्ति के अपने स्तर पर निर्भर करता है जो NR4A परिवार परमाणु रिसेप्टर्स के एक सदस्य है, मार्गदर्शन 26। इसी प्रकार SOX5, HSA-मीर 96 का लक्ष्य, तंत्रिका progenitors 27 अक्षतंतु लंबाई 28, प्रवास, बाद प्रवासी भेदभाव, और न्यूरॉन्स 29 के अनुमानों में कोशिका चक्र प्रगति को नियंत्रित करने की सूचना दी है। SOX5 और NR4A3 दोनों HSA-मीर 96 का एक सीधा लक्ष्य mRNA के रूप में पहचान है, और दोहरी luciferase संवाददाता assays के द्वारा क्रमशः HSA-मीर 7 और 17 थे। दोहरी luciferase (जुगनू और Renilla) एक ही प्लाज्मिड में दो अलग-अलग संवाददाता जीन पर निर्भर करता है और suboptimal अभिकर्मक और एक एकल luciferase प्लाज्मिड प्रणाली के साथ तुलना में साइटोटोक्सिक प्रभाव की वजह से प्रभाव के लिए सामान्य बनाने की इजाजत दी एक बेहतर प्रणाली प्रदान करता है। हमारे परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी अपने अभिकर्मक conditi अनुकूलितआदेश में ons उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए। protocolsdescribed इस के साथ साथ आगे का अनुकूलन और पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन और भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए intransplantation प्रोटोकॉल beimplemented सकता है जो इन विट्रो hNSC भेदभाव को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

स्टेम सेल अनुसंधान भी ऊतक इंजीनियरिंग, विकास कोशिका जीव विज्ञान, सेलुलर चिकित्सा विज्ञान, जीन थेरेपी के विषयों तक फैला है जो पुनर्योजी चिकित्सा, में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और biomaterials (scaffolds और Matrices)। स्टेम कोशिकाओं दोनों अंग developmentand ऊतकों की मरम्मत में महत्वपूर्ण हैं; स्टेम कोशिकाओं कैसे काम समझने नई स्टेम सेल आधारित उपचार एक के विकास के लिए निर्णायक है। CTX0E03 पहली तिमाही के मानव भ्रूण प्रांतस्था से अलग एक प्रतिरूप, सशर्त अमर मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) पंक्ति 2 है। CTX0E03 अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) 3 के तहत नैदानिक ​​सेल बैंकिंग के लिए आवश्यक हैं कि गुणवत्ता विशेषताओं को परिभाषित किया गया है। HNSCs अनायास न्यूरॉन्स, glia, और oligodendrocytes में अंतर कर सकते हैं और फोकल ischemia के 2,4,5 के कृंतक मॉडल में प्रत्यारोपित जब न्यूरोलॉजिकल घाटा सुधारने के लिए सिद्ध किया गया है। CTX0E03 hNSCs स्ट्रोक disabil के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैंअल्पसंख्यक (NCT01151124 6 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov)। MiRNAs लंबाई में एक औसत 22 न्यूक्लियोटाइड है और विनियामक अणुओं 7 साबित हो रहे हैं, वे प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में नहीं है, बल्कि प्रोटीन में अपनी स्थिरता और अनुवाद को विनियमित करने, mRNAs का तीन प्रधानमंत्री untranslated क्षेत्र (3&#39;UTR) बाँध। MiRNAs विकास, प्रसार, और भेदभाव 8 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर के नियमन में भाग लेने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। कई miRNAs तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 9 के भाग्य और विनिर्देश को विनियमित करने में फंसाया गया है। मानक संस्कृति वातावरण दो आयामी (2 डी) में vivo वातावरण की जटिलता के अनुरूप नहीं है, और फलस्वरूप hNSC भेदभाव की प्रेरण और विनियमन इष्टतम नहीं है। में vivo, कोशिकाओं अन्य द्वारा रचित एक तीन आयामी (3 डी) microenvironment से घिरे रहे हैं कई सहित कोशिकाओं और बाह्य ligands के,कोलेजन, laminin, और अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन (बाह्य मैट्रिक्स, ईसीएम) के प्रकार। पिछले अध्ययनों की सूचना दी है कि ECMs और उनके ज्यामिति प्रभाव सेल phenotype और भाग्य 10-15 नकल उतार सामग्री की स्थापत्य स्थलाकृति। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी scaffolds के एक संख्या में उपलब्ध हैं; हम कोशिकाओं पर आक्रमण और 16-18 अंतर कर सकते हैं जिसमें एक 3 डी अंतरिक्ष प्रदान करता है जो एक 200 माइक्रोन मोटी झिल्ली में एक अच्छी तरह से परिभाषित किया है और वर्दी वास्तुकला के साथ इंजीनियर एक अत्यंत झरझरा polystyrene के पाड़ प्रयोग किया जाता है। इस के साथ साथ 2 डी और 3 डी भेदभाव assays के axonprocess परिणाम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, हम आगे अपनी भेदभाव पर miRNA के प्रभाव की जांच के लिए एक नैदानिक ​​ग्रेड hNSC लाइन की miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए एक विधि का वर्णन। सचित्र यहाँ में तरीकों मूल रूप से 19 में वर्णित लोगों पर आधारित हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) विशिष्ट स्थानीय microenvironments तहत न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes में आत्म नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। यहाँ में, हम वर्तमान में स्ट्रोक विकलांगता (NCT01151124 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov) के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में, तीन आयामी (3 डी) भेदभाव और एक प्रतिरूप मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) लाइन की miRNA विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का एक सेट प्रस्तुत करते हैं। HNSCs एक नैतिक अनुमोदित पहली तिमाही के मानव भ्रूण कॉर्टेक्स से ली गई है और सशर्त निर्माण सी-mycER टैम की एक प्रति की रेट्रोवायरल एकीकरण का उपयोग कर अमर हो गया। हम 3 डी scaffolds और कैसे पीसीआर सरणी का उपयोग miRNA अभिव्यक्ति में एसोसिएटेड परिवर्तन यों पर भेदभाव hNSCs के अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम को मापने के लिए कैसे का वर्णन। इसके अलावा हम miRNA के ख्यात लक्ष्य का चयन करने के उद्देश्य से कम्प्यूटेशनल विश्लेषण उदाहरण देना। SOX5 और NR4A3 काफी चयनित की उपयुक्त miRNA के ख्यात लक्ष्य के रूप में पहचान की गई नीचे विनियमितविभेदित hNSC में डी miRNAs। Mirna लक्ष्य सत्यापन दोहरी संवाददाता प्लाज्मिड अभिकर्मक और दोहरी luciferase परख द्वारा SOX5 और NR4A3 3&#39;UTRs पर प्रदर्शन किया गया था।

चित्र 1 में पारंपरिक फ्लैट सतह संस्कृतियों (2 डी) के साथ तुलना में 3 डी scaffolds पर hNSC भेदभाव की जांच और मात्रा का ठहराव कल्पना और अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम माप expressedas है। चित्रा 2 में representedthe कार्यप्रवाह और स्टेम कोशिकाओं का उपयोग miRNA मात्रा का ठहराव के लिए परिणाम है और विकास के रास्ते समान नियंत्रण के साथ तुलना में 2 डी और 3 डी विभेदित hNSCs में miRNAs की अंतर अभिव्यक्ति की जांच के लिए miRNA पीसीआर सरणी ध्यान केंद्रित किया। विभेदित और समान hNSCs, और लक्ष्य भविष्यवाणी, SOX5 और NR4A3 (NOR1) के लिए कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के बीच निम्न miRNA के तुलनात्मक विश्लेषण ख्यात लक्ष्य mRNAs के रूप में पहचान की गई। MiRNAs और हम SOX5 या NR4A3 3&#39;UTR अनुक्रम या तो युक्त दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन के बहाव डाला इस्तेमाल किया 3&#39;UTR mRNA के, पर उनके ख्यात साइट के बीच सीधी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक<html> एन डी सामान्य बनाने के लिए एक ही प्लाज्मिड renilla luciferase जीन में से युक्त। 3 &#39;UTR luciferase गतिविधि नीचे विनियमन के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में प्रस्तुत किया है। <img alt="चित्र 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> चित्रा 1:। 3 डी scaffolds पर hNSCs के भेदभाव, और अक्षतंतु प्रक्रिया तों परिणाम की माप (ए) β3 ट्यूबिलिन (हरा) और Hoechst (नीला) प्रतिनिधि microphotographs साथ counterstained नाभिक के लिए मानक आईसीसी धुंधला के बाद हासिल किया गया और अक्षतंतु प्रक्रियाओं की माप थे एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की सहायता से प्रदर्शन किया। (बी) 1 (1W) या तीन सप्ताह (3W) के लिए 2 डी और 3 डी विभेदित hNSCs में प्रदर्शन अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम की माप रिपोर्टिंग चित्र।कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,410 / 52410fig1highres.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> चित्रा 2:। विभेदित hNSCs में miRNA रूपरेखा के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह कुल शाही सेना, miRNAs सहित 3 डी scaffolds और मानक 2D संस्कृतियों, या undifferentiated नियंत्रण पर विभेदित hNSCs तो से निकाला गया था। कुल शाही सेना के 250 एनजी रेट्रो लिखित मानव सेल भेदभाव और विकास miScript miRNA पीसीआर सरणी के साथ miRNA मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त सीडीएनए में परिपक्व miRNAs की चयनात्मक रूपांतरण की सुविधा है कि एक विधि के साथ थे। SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, और RNU6-2 की भू-मतलब दो -ΔΔct पद्धति पर आधारित डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। महत्वपूर्ण परिवर्तन एक स्टेशन को गुना +/- 1.5 और नीचे विनियमन के रूप में परिभाषित किया गयाtistically महत्वपूर्ण हद तक। डाटा एक clustergram के रूप में व्यक्त कर रहे हैं परिणामों पर उपलब्ध वेब आधारित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। चित्रा 3 19 से संशोधित। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> चित्रा 3: miRNA लक्ष्य के मान्यकरण एक दोहरी luciferase रिपोर्ट परख का उपयोग mRNA की भविष्यवाणी की। (ए) एक miRNA के एक सीधा लक्ष्य के रूप में 3&#39;UTR अनुक्रम मान्य करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल एक दोहरी luciferase संवाददाता प्लाज्मिड के प्रतिनिधि आरेख। (बी) अभिकर्मक दक्षता दिखा प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। (सी) &#160; सिग्नल, मानव 3 &amp; # से, रिश्तेदार luciferase गतिविधि के रूप में व्यक्त39; UTR संवाददाताओं ofSOX5 और NR4A3 जीन काफी HSA-मीर 96 की उपस्थिति में नीचे गिरा दिया गया था, और HSA-मीर 7 और 17 miRNA mimics क्रमशः। चित्रा 5 19 से संशोधित। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> लक्ष्य जीन </td><td> लक्ष्य साइटों / जीन पाया </td><td> शुद्धता </td><td> स्कोर </td><td> सकल पी सीटी </td></tr><tr><td> HSA-मीर 96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;टीडी&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-मीर 183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-मीर 302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> एनएफ </td></tr><tr><td> HSA-मीर 182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> एनएफ </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-मीर 7 </td><td> NR4A3 </td><td> एनएफ </td><td> एनएफ </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-मीर 7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> एनएफ </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-मीर-20A </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><stronG&gt; HSA-मीर 20B </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-मीर 17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-मीर-20A </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> एनएफ </td><td> एनएफ </td></tr><tr><td> HSA-मीर 20B </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> एनएफ </td><td> एनएफ </td></tr><tr><td> HSA-मीर 17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> एनएफ </td><td> एनएफ </td></tr></tbody></table> तालिका 1: miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी mRNAs की सूची। MiRNAs की प्रतिनिधि मेज, भविष्य कहनेवाला जीनों को लक्ष्य बनाते हैं, और एल्गोरिदम विश्लेषण (भविष्यवाणीआयन / स्कोर / कुल क्रमश: डायना लैब, PicTar, और TargetScan का उपयोग करते हुए प्रदान की)। 3 टेबल 19 से संशोधित।

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

तीन आयामी संस्कृति, MicroRNA का विश्लेषण और ख्यात लक्ष्य जीन पर एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल लाइन के भेदभाव

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

एसएच SY5Y मानव neuroblastoma सेल लाइन के भेदभाव

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

बेसिक और preclinical अनुसंधान के लिए एक संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली में मानव pluripotent और तंत्रिका स्टेम सेल संवर्धन

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

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Immunocytochemical विश्लेषण के लिए प्रसंस्कृत मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के Zika वायरस संक्रमण

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

तीन आयामी प्रतिपादन और Immunolabeled का विश्लेषण, स्पष्ट मानव अपरा Villous संवहनी नेटवर्क

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की तीन आयामी Organotypic संस्कृतियों

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...