Name: differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

我々は、HeLa培養およびトランスフェクションと彼女の技術的なサポートのためたhNSCの準備で助けるためのジュリーHeward、およびLavaniya Thanabalasundaramを認める。

3次元（3D）文化1. HNSC分化注：以前の出版物2に記載された倫理的に承認組織から、たhNSCを分離して導き出す。この手順に従いながら、倫理的、制度的なガイドラインに従ってください。 1.1）3D培養は、12ウェルプレートを使用して、 <ol><li>作業中は無菌技術を使用してください。生物学的安全キャビネットの中で、70％エタノールを2ml /ウェルを添加することにより再水和足場は、灌漑（WFIr）のために水を用いて調製。各ウェルの壁ダウン70％エタノールを分配することによって足場に触れないようにしてください。 </li><li>慎重に70％エタノールを吸引し、すぐに2ミリリットル/ウェルのDMEMで足場を洗浄する：1分間F12。二回洗浄手順を繰り返します。最終洗浄後にF12：慎重にDMEMを吸引。 </li><li> F12：DMEM 2 mlのラミニン/ウェル（10μg/ ml）を添加することによりコート足場。 5％のCO 2ハムで37℃でプレートをインキュベート2時間の最低idifiedインキュベーター。暖かいDMEMで洗浄プレート：F12。 </li><li> RMM +のGF150μlの容積の約50万たhNSCで各足場をシード。 </li><li>細胞が足場に落ち着くことができるように、5％CO 2加湿インキュベーター中、37℃で3時間静置します。 </li><li>よく足場から細胞を取り除くしないように注意しながらそれぞれにRMMの3.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 7日間プレートをインキュベート。 RMM培地を交換（3.5ミリリットル/ウェル）1日（最初の給餌）の後に、もう一度最初の給餌から2〜3日後。 </li><li> 7日後、培地を除去し、免疫細胞化学（ICC）のために4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定したり/ウェルの全RNA抽出のための溶解試薬500μlの追加（≤-80℃で保存プレートを、または全RNA抽出に進む） 。 </li></ol>軸索プロセスの伸長の1.2）測定<ol><li> 4％PFAを標準ICCプロトコル20を用いてβに応じた差別たhNSCを固定染色3チューブリン（TUBB3）蛍光色素結合二次抗体を用いて検出した一次抗体。ヘキスト（1μM）との対比染色細胞核。 </li><li>蛍光顕微鏡を用いてβ3チューブリン染色された細胞の代表的な画像をキャプチャ。 TIFFやJPEGなどの画像を保存します。ソフトウェア測定ツール（ 例えば、イメージ·プロ·プラス）を使用して軸索プロセス伸長の尺度。 </li><li> 、画像を開いて、ツールバーでの測定オプションを選択して、トレース機能を選択します。 </li><li>トレースを開始するには、マウスボタンをクリックすることにより、軸索伸長上の開始点を選択します。軸索伸長の全長に沿ってトレースする。右の各トレースをクリックして終了します。視野内のすべての軸索outgrowthswithを測定するために繰り返します。 </li><li>ピクセルまたはミクロン（保留中のキャリブレーション設定する）などの測定値を表す。サンプルの比較や統計分析のためにスプレッドシートプログラムにエクスポート長さの測定。 </li></ol> 2. miRNA発現幹細胞を用いたと発生経路集束のmiRNA PCRアレイ 2.1）のmiRNA全RNA抽出<ol><li>足場および2D成長したサンプル（分化し、未分化、hNSCコントロール）上のmiRNA抽出を行う。 </li><li>必要に応じて、12ウェルプレートに挿入融解足場。同じ1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中で2つのウェル、最終体積溶解試薬の1ミリリットルの溶解試薬の内容（500μl）を組み合わせる。ウェルの足場を残すように注意してください。 </li><li>以前に収集されたとして乾電池をペレット化2D成長したサンプル（差別hNSC 2D培養および未分化制御）のために溶解試薬の1ミリリットルを追加し、1.5 mlのマイクロチューブに内容を転送。 </li><li> 1mlシリンジおよび短い20〜25ゲージ針を用いて各試験サンプルをホモジナイズする。均質な溶解液が達成されるまで、1ミリリットルを5回まで注射器を用いて針を介して溶解液を渡します。 </li><li>各エッペンドルフチュー​​ブに200μlのクロロホルムを加え、しっかりとキャップ。反転とボルテックスチューブに内容物を混合。 </li><li>遠心し≥12,000X gで15分間ホモジネートを含む各1.5ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li> 100％エタノール750μlのを含む新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに（すべての相間、ピンク色の液体を移送避ける）各サンプルの上部の水相を転送します。反転により完全に混合。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにミニカラム内に、沈殿物を含む各試験サンプル700μlの、最大ピペット。室温で約30秒間≥8,000×gで蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。サンプルの残りを使用して、この手順を繰り返します。 </li><li> 15分間のDNAダイジェストを実行します。 </li><li> ≥8,000×gで約30秒間のミニコラムや遠心分離機に700μlのバッファーRWTを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 500μlのバッファーRPEを追加し、≥8,000×gで約30秒間遠心分離することにより、ミニカラムを洗浄。フロースルーを捨てます。繰り返しwash.Ce1分間≥12,000×gでntrifugeはさらに、膜を乾燥させる。 </li><li>ミニカラムにRNaseフリー水を40μlを添加し、≥8,000×gで1分間遠心分離することにより、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに総RNAを溶出する。適切な分光光度計を用いて全RNA濃度を測定します。 </li></ol> 2.2）のmiRNA cDNAを準備<ol><li>逆転写マスターミックスを調製する。各サンプルを5倍miScript混錬バッファー4μlの、10倍nucleicsミックス2μlのを必要とし、2μlを転写酵素ミ​​ックスを逆miScript。 </li><li> PCRチューブ内のマスターミックスのアリコート8μlの総RNA（250 ng）を所要の体積を追加し、20μlの最終容量にRNaseフリー水を加える。 </li><li> miScript逆転写酵素ミ​​ックスを不活性化するために95℃で5分間、37℃C.Incubateで60分間インキュベートする。 </li><li> -20℃で、それぞれ20μlの逆転写反応に店舗を200μlのRNaseフリー水を追加、またはリアルタイムTIを進める私はすぐにPCR。 </li></ol> 2.3）幹細胞および発生経路は、miRNA PCRアレイの集束<ol><li> 2X SYBRグリーンマスターミックスの1375μL、100μLのmiRNA cDNA調製、10倍miScriptユニバーサルプライマーの275μlの、およびRNaseフリー水（総容量2,750μl）を1000μlのを追加して15ミリリットルチューブでPCR成分ミックスを調製する。 </li><li> PCR積載リザーバータンクのPCR成分ミックスを転送します。慎重に密封された袋から、96ウェルプレートのPCRアレイを削除。 </li><li> 8チャンネルピペッター、またはわずか8チップを使用して12チャネルピペッターを使用して、PCRアレイの各ウェルに25μlのPCR成分ミックスを加える。ウェル間の交差汚染を避けるために、各分注ステップ以下のピペットチップを変更します。 </li><li>気泡を除去するために室温（15~25℃）で、光学接着フィルムでプレートを密封し、1,000×gで1分間遠心する。視覚気泡ウェル中に存在しないことを確認するための下からプレートを検査。 </li><li>リアルタイムサイクラーで96ウェルプレートのPCR配列を配置します。 </li><li>プログラムは、それに応じてリアルタイムサーマルサイクラー：10分、および95℃で15秒間の45サイクル、および60℃で1分間、95℃で1サイクルは、単一の（蛍光データ収集）を設定する。 </li><li> PCRアレイデータ分析テンプレートExcelおよびWebベースのソフトウェアで使用するための空白のExcelスプレッドシートにすべてのウェルのCt値をエクスポートします。 注：ソフトウェアがで入手可能です<a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> 。 </li></ol> miRNAのターゲット予測とレポータープラスミドトランスフェクションおよびDdualルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの検証のための3.コンピュータ分析。 3.1）のmiRNAターゲット予測のためのコンピュータ解析<ol><li> [参照PicTar（ <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ）21、のmiRの識別のためのオンラインで利用可能なアルゴリズムNAは、予測のmRNAをターゲットにしています。 </li><li> 「脊椎動物でPicTar予測のためにはこちらをクリック」をクリックします。新しいページが開きます。 </li><li>新しいページ、PicTarのWebインターフェイスでは、ドロップダウンメニューで種を選択し、miRNAのID]ボックスに関心のmiRNAを挿入します。 miRNAのターゲットのための検索]をクリックします。 </li><li> aPicTarスコア順標的mRNAのリストを確認します。 注：PicTarが与えられたUTRは、選択したmiRNAの標的とし、種子の相補性、熱力学と共発現されたmiRNA 22のセットの中で共通の目標のためのコンビナトリアル予測に基づいてされる可能性を反映したスコアを計算します。 </li><li>同様にDIANA-LAB（使用して標的mRNAのリストを取得<a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ）23、及びTargetScan（ <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a>利用可能な回線上）24、代替案をアルゴリズム。 </li><li> Mの比較表をコンパイルしますのiRNA異なるソフトウェアツールを使用して得られた順位に基づい。 PicTarは終わっ保全、種子の相補性に基づいて集計PCT（、結合の熱力学的自由エネルギーによって（信号対雑音比と予測された結果の重要性を評価するための精密なスコアに信号に基づく）精度によって、スコアによってDianaLabをランク付けし、TargetScan異なる種）は、 表1を参照のこと。 </li></ol>レポータープラスミドトランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの3.2）の検証。 注：ターゲットmRNAの検証のための3 &#39;UTRルシフェラーゼレポーターは、以前に25を説明してきた。 <ol><li>トランスフェクション<ol><li> /ウェルで24ウェルプレート中に10 5細胞の密度でシードHeLa細胞。 </li><li>トランスフェクション試薬とNR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRプラスミド100ngのいずれかの1.5μlのと同様に、20 nMのmiRNAを模倣（SOX5 3用HSA-のmiR-96-5pと24時間、共同トランスフェクトしたHeLa細胞の後217。ウェルあたりUTR、およびHSA-MIR-7-5p、それぞれNR4A3 3 &#39;UTRのためのHSA-MIR-17-5p）。 </li><li> NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmidと蛍光色素ラベルネガティブコントロールsiRNAとの共トランスフェクト対照ウェル。蛍光標識されたネガティブコントロールsiRNA対照ウェルのトランスフェクションは、トランスフェクション効率の評価を可能にし、模倣のmiRNA 3&#39;UTR結合特異性を占める。 </li></ol></li><li>デュアルルシフェラーゼ活性の測定<ol><li>ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を24時間後にトランスフェクションを測定します。細胞増殖培地を除去します。 </li><li>私は、溶液Iの10ミリリットルに50μlの基質を添加することにより、作業溶液を準備。完全に混合する。私は、各ウェル24内にワーキング溶液を300μlを追加します。 </li><li> 96白いプレートの3ウェル、100μlのそれぞれに各24の内容を転送します。 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでホタルルシフェラーゼを測定する。 </li><li>作業solutを準備イオンII溶液IIの10ミリリットルに基板IIの50μlのを追加することで、完全に混合する。私はすでに作業溶液Iの100μlのを含む各96ウェルに作業溶液100μlのを追加します。 </li><li> 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでウミシイタケルシフェラーゼを測定する。ウミシイタケルシフェラーゼのホタルルシフェラーゼからの発光の比率を計算します。 </li></ol></li></ol>

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すべての著者は、従業員、株式および/ ​​またはReNeuron株式会社またはその親会社におけるストックオプション保有者である。 本研究は、ReNeuron（RENE.L）によってサポートされていました。

幹細胞の分化を評価し、改善するためのインビトロアッセイ新しい開発は、常にそれらの機能性および治療 ​​機能の調査のための課題を提示した。長期及びin vitro分化アッセイにおける強固な3Dの開発に必要なたhNSCの安定した取り付けは、材料や構造の点で特性の異なる複数の3Dの基板をテストすることによって対処されました。アッセイ開発の一環として、我々はまた、最適な細胞播種濃度を評価し、足場がラミニンは、被覆されるための要件を特定した。私たちたhNSC自発的に4-OHT及び増殖因子を除去すると分化することができるものの、標準的な2D分化したhNSCと比較した場合、軸索伸長工程によって測定されるように、3D培養システムの実装は、それらの分化能力の有意な改善を示した。 3D誘起differeの影響を調査するために、我々は、PCR配列を使用hNSC miRNA発現にntiation。標準チップマイクロアレイPCRアレイと比較して興味のあるmiRNAの直接定量と検証の利点を提供しています。 PCRアレイは96より少なく、ここで例えばアレイ当たりのmiRNAの総数の用語に制限されるが、それは以前に幹細胞の発生に報告我々の場合、特に関心のmiRNAを含むように調整することができる。経路当てmiRNAの発現は、未分化たhNSCと比べて3Dと2D区別たhNSCで紹介した。最も有意にダウンレギュレートされたmiRNAを選択し、オンラインで利用可能なアルゴリズム（DIANAラボ、PicTar、およびTargetScans）を使用して、それらの機能および生物学的解釈を決定することを意図し、その推定標的mRNAを評価するために分析した。 シングルmiRNAは、ターゲットの数百人を認識することができ、この理由のため、我々は中の適切な候補となり得る3 &#39;UTR mRNAsthatとのmiRNAの相互作用を検証xonal規制。 NR4A3、HSA-のmiR-7の目標、及びmiR-17ファミリーは、それらの発現レベルに応じて、海馬軸索の分化、生存、アポトーシスおよび調節に関与している、NR4Aファミリー核内受容体のメンバーである指導26。同様SOX5、HSA-のmiR-96の標的は、神経前駆体27の軸索の長さ28、マイグレーション後遊走、分化、およびニューロン29の投影における細胞周期の進行を制御することが報告されている。 SOX5およびNR4A3両方は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにより、それぞれ直接標的HSA-は、miR-96、およびHSA-のmiR-7及び17のmRNAとして同定された。デュアルルシフェラーゼ（ホタルおよびウミシイタケ）は同じプラスミド内の2つの異なるレポーター遺伝子に依存しており、単一のルシフェラーゼプラスミド系と比較して次善のトランスフェクションおよび細胞毒性効果による影響のために正規化を可能にする改良されたシステムを提供しています。私たちのアッセイ開発の一環として、我々はまた、当社のトランスフェクションconditiを最適化順番にアドオンは、高効率を得ることができる。 protocolsdescribedはここにさらに最適化し、前臨床試験および将来の臨床応用のためのintransplantationプロトコルをbeimplementedことがin vitroで hNSC分化を特徴づけるために利用することができる。

幹細胞研究はまた、組織工学、発達、細胞生物学、細胞治療、遺伝子治療の分野にまたがる再生医療において中心的な役割を果たしており、生体材料（足場と行列）。幹細胞は、両方の臓器developmentand組織修復において重要である。幹細胞がどのように機能するかを理解することは、新しい幹細胞ベースの治療法1を開発するための極めて重要である。 CTX0E03は妊娠初期ヒト胎児皮質から分離されたクローン、条件付きで不死化したヒト神経幹細胞（hNSC）ライン2である。 CTX0E03は適正製造基準（GMP）3の下で臨床細胞バンクに不可欠な品質特性を定義している。たhNSCは自然発生的に、ニューロン、グリア、およびオリゴデンドロサイトに分化することができると焦点虚血2,4,5のげっ歯類モデルに移植すると神経障害を改善することが証明されている。 CTX0E03たhNSCはストロークdisabilのための臨床試験に現在あるITY（NCT01151124 6とNCT02117635、Clinicaltrials.gov）。 miRNAは、長さが平均22個のヌクレオチドを有し、調節分子7であることが証明され、それらはタンパク質をコードしないが、むしろタンパク質へのそれらの安定性および翻訳を調節、mRNAの3プライム非翻訳領域（3&#39;UTR）に結合する。 miRNAは、開発、増殖、および分化8を含む多くの細胞プロセスの調節に関与することが報告されている。いくつかのmiRNAは、神経幹細胞9の運命および仕様の調節に関与している。 標準的な培養環境の二次元（2D）でのin vivo環境の複雑さが一致しない、ひいてはhNSC分化の誘導および調節は、最適ではない。 インビボで 、細胞が他の作曲3次元（3D）の微小環境に囲まれている多く含む細胞と細胞外のリガンド、コラーゲン、ラミニン、およびその他のマトリックスタンパク質（細胞外マトリックス、ECM）の種類。これまでの研究では、材料の建築の地形はECMを、それらの幾何学影響細胞の表現型と運命10-15を模倣することを報告した。市販の3D足場の数が利用可能です。我々は、細胞が侵入し、16〜18を区別することができますその中に3D空間を提供して厚さ200μmの膜の中に明確に定義された均一なアーキテクチャで設計され、高度に多孔質ポリスチレン足場を使用していました。 本明細書中に2Dおよび3D分化アッセイaxonprocess伸長を評価するために使用される。さらに、我々はさらに、その分化のmiRNAの効果を調べるために臨床グレードhNSCラインのmiRNA発現をプロファイリングするための方法を記載する。示され、ここでの方法は、もともと19に記載されているものに基づいています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

神経幹細胞（NSCは）特定の局所微小環境下で、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトへの自己再生および分化が可能である。ここでは、現在のストローク障害（NCT01151124とNCT02117635、Clinicaltrials.gov）の臨床試験において、3次元（3D）の分化およびクローンヒト神経幹細胞（hNSC）ラインのmiRNA解析に用いられる方法のセットを提示する。たhNSCは倫理的に承認妊娠初期のヒト胎児皮質から誘導され、条件付きで構築するC-mycER TAMの単一コピーのレトロウイルスの統合を用いて不死化された。私たちは、3D足場および方法PCRアレイを用いたmiRNA発現の関連する変化を定量化するために区別たhNSCの軸索プロセス伸長を測定する方法について説明します。さらに我々は、miRNAの推定標的を選択することを目的とコンピュータ解析を例示する。 SOX5とNR4A3が大幅に選ばのに適したmiRNA推定標的として同定された下方制御する差別hNSCでDのmiRNA。のmiRNA標的の検証は、デュアルレポータープラスミドのトランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイによってSOX5およびNR4A3の3&#39;UTRで行った。

図1では、伝統的な平面培養（2D）と比較し、軸索プロセス伸長測定をexpressedas 3D足場にhNSC分化の調査と定量化を可視化される。 図2にrepresentedtheワークフローであり、幹細胞および発生経路を使用して、miRNAの定量の結果は、未分化の対照と比較して、2Dおよび3D分化したhNSCにおけるmiRNAの差次的発現を調べるためのmiRNA PCRアレイを当てた。 miRNAは、分化および未分化たhNSCの間の比較分析、およびターゲットの予測のための計算分析後、SOX5およびNR4A3（NOR1）は、推定上の標的mRNAとして同定された。 3&#39;UTR mRNA上のmiRNAおよびそれらの推定上の部位との間の直接の相互作用を研究するために、我々は、A、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流に挿入SOX5またはNR4A3 3&#39;UTR配列のいずれかを含む2市販のプラスミドを使用<html> ND正規化のための同じプラスミドウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に含む。 3 &#39;UTRルシフェラーゼ活性のダウンレギュレーションの代表的な結果を図3に示されている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> 図1：3D足場上たhNSCの分化、および軸索プロセスES伸長の測定（A）β3チューブリン（緑）、ヘキスト（青）代表顕微鏡写真で対比原子核のための標準的なICC染色後は、取得したと軸索プロセスの測定であった画像解析ソフトウェアを用いて行った。 （B）1（1W）または3週間（3W）のための2Dおよび3D区別たhNSCで行われる軸索のプロセス伸長の測定を報告するダイアグラム。COM /ファイル/ ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> 図2：差別たhNSCにおけるmiRNAプロファイリングの概略ワークフローの全RNA、miRNAを含むが、3D足場および標準2D文化、または未分化制御上の差別たhNSCのいずれかから抽出した。総RNA 250ngのは、ヒト細胞の分化および発達miScriptのmiRNA PCRアレイを有するmiRNAの定量に適したcDNAに成熟miRNAの選択的変換を容易にする方法でレトロ転写した。 SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、およびRNU6-2の地理平均2-ΔΔCT法に基づくデータ解析に使用した。有意な変化はSTAに畳む+/- 1.5およびダウンレギュレーションのように定義されたtisticallyかなりの程度。データはclustergramとして表される結果で利用可能なウェブベースのソフトウェアを用いて分析した。 図3 19から変更。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> 図3：miRNA標的の検証は、デュアルルシフェラーゼレポーター試験を用いてmRNAを予測した。 （A）miRNAの直接の標的として3&#39;UTR配列を検証するためのツールとして使用するデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドの代表的な図。 （B）トランスフェクション効率を示す代表的な顕微鏡写真。 （C） &#160;の信号は、人間の3＆＃から、相対ルシフェラーゼ活性として表現39; UTR記者ofSOX5とNR4A3遺伝子が大幅にそれぞれHSA-のmiR-96の存在下でのノックダウン、およびHSA-MIR-7と17のmiRNA模倣された。 図5 19から変更。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNAの </td><td> 標的遺伝子 </td><td> 標的部位は/遺伝子が見つかりました。 </td><td> 精度 </td><td> スコア </td><td> 集計P CT </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;TD&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 190分の302 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-302A </td><td> NR4A3 </td><td> 473分の863 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 136分の399 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20A </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><stronG&gt; HSA-MIR-20B </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20A </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20B </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> 表1：miRNAのターゲット予測mRNAのリスト 。 miRNAの代表表は、予測的遺伝子を標的、およびアルゴリズム分析（予測イオン/スコア/集計それぞれダイアナ·ラボ、PicTar、およびTargetScanを使用して提供される）。 表3 19から変更された。

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