Name: differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

Vi erkänner Julie Heward för att hjälpa i beredningen av hNSCs och Lavaniya Thanabalasundaram för hennes teknisk support med HeLa odling och transfektion.

1. HNSC differentiering på Tredimensionell (3D) Kultur OBS: Isolera och härleda hNSCs, ur ett etiskt godkänd vävnad, som beskrivs i en tidigare publikation 2. Följ etiska och institutionella riktlinjer när du följer denna procedur. 1,1) 3D kultur med användning 12-brunnar <ol><li> Använd aseptisk teknik under hela förfarandet. I ett biologiskt säkerhetsskåp, återfukta ställningar genom att lägga 2 ml / brunn av 70% etanol framställs med användning av vatten för bevattning (WFIr). Undvik att röra vid ställningar genom dispensering av 70% etanol ner väggen i varje brunn. </li><li> Försiktigt aspirera 70% etanol och omedelbart tvätta ställningar med 2 ml / brunn DMEM: F12 i 1 min. Upprepa tvättningen två gånger. Försiktigt aspirera DMEM: F12 efter sista tvätten. </li><li> Coat byggnadsställningar genom att lägga 2 ml / brunn av laminin (10 | ig / ml) i DMEM: F12. Inkubera plattan vid 37 ° C i en 5% CO 2 brumidified inkubator under minst 2 h. Tvätta plattan med varmt DMEM: F12. </li><li> Seed varje byggnadsställning med ca 500.000 hNSCs i en volym av 150 | il RMM + GFs. </li><li> Inkubera plattan under 3 h vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator för att tillåta cellerna att sedimentera i byggnadsställningar. </li><li> Lägg 3,5 ml av RMM till varje brunn noga med att inte rubba celler från byggnadsställningar. </li><li> Inkubera plattan under 7 dagar; byt RMM medium (3,5 ml / brunn) efter 1 dag (första utfodring) och igen efter 2-3 dagar från den första utfodring. </li><li> Efter 7 dagar, ta bort medium och fixera celler med 4% paraformaldehyd (PFA) för immuncytokemi (ICC) eller lägga 500 l / brunn av lysisreagens för total RNA-extraktion (butiksplatta vid ≤ -80 ° C eller gå vidare till total RNA-extraktion) . </li></ol> 1.2) Mätning av Axon Process utväxt <ol><li> Fläck 4% PFA fast differentierade hNSCs enligt ett standardprotokoll ICC 20 med hjälp av β3-tubulin (TUBB3) primär antikropp detekteras med en fluorokrom konjugerad sekundär antikropp. Motfärga cellkärnor med Hoechst (1 M). </li><li> Fånga representativa bilder av β3-tubulin färgade celler med hjälp av en fluorescerande mikroskop; spara bilder som tiff eller jpeg. Mått på Axon process utväxt med hjälp av en mätning mjukvaran (t.ex. Image-Pro Plus). </li><li> Öppna bilden, alternativet väljer mätningar i verktygsfältet och väljer spårfunktionen. </li><li> För att starta spårningen, välja startpunkten på axonet utväxt genom att klicka på musknappen. Trace längs hela längden av axonet utväxt; högerklicka för att avsluta varje spår. Upprepa för att mäta allt axonet outgrowthswith i synfältet. </li><li> Express mätningar som pixlar eller im (avvaktan kalibrering inrättat). Exportera längd mätningar till ett kalkylprogram för prov komparativ och statistisk analys. </li></ol> 2. Mirna Expression Använda en stamcellslinjer ochUtvecklingspathways Fokuserad miRNA PCR Array 2.1) miRNA total RNA-extraktion <ol><li> Utför miRNA utvinning på byggnadsställningar och 2D odlade prover (differentierade och odifferentierade, hNSC kontroll). </li><li> Tina byggnadsställningar, införd i en 12-brunnsplatta, om så erfordras. Kombinera lyseringsreagenset innehåll (500 l) av 2 brunnar i samma 1,5 ml Eppendorf-rör, slutlig volym 1 ml Lysisreagens. Var noga med att lämna ställningen i brunnen. </li><li> För tidigare insamlade som torrpellet 2D vuxit prover (differentierade hNSC 2D kulturer och odifferentierad kontroll) tillsätt 1 ml lysisreagens och överföra innehållet till 1,5 ml mikrocentrifugrör. </li><li> Homogeni varje testprov med användning av en 1 ml spruta och en kort 20-25 gauge nål. Passera lysatet genom nålen med hjälp av en 1 ml sprutan upp till 5 gånger tills en homogen lysat uppnås. </li><li> Lägg 200 pl kloroform till varje Eppendorf-rör och locket ordentligt. Invertera och vortexrör tillBlanda innehållet. </li><li> Centrifugera varje 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande homogenatet under 15 min vid ≥12,000 x g. </li><li> Överför den övre vattenhaltiga fasen av varje prov (undvika att överföra någon interfas, rosafärgad vätska) till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 750 | il av 100% etanol. Blanda noggrant genom att vända. </li><li> Pipettera upp till 700 | il av varje testprov, inklusive eventuell fällning, till en mini-kolonn i en 2 ml uppsamlingsrör. Stäng locket och centrifugera vid ≥8,000 xg under cirka 30 sekunder vid rumstemperatur. Kassera genomströmning. Upprepa detta steg med hjälp av återstoden av provet. </li><li> Utför en DNA digere under 15 min. </li><li> Lägg 700 l buffert RWT till mini kolumnen och centrifugera i ca 30 sekunder vid ≥8,000 x g. Kassera genomströmning. </li><li> Tvätta mini kolumn genom att tillsätta 500 l buffert RPE och centrifugering för ca 30 sek vid ≥8,000 x g. Kassera genomströmning. Upprepa wash.Centrifuge vid ≥12,000 xg under 1 min för att torka membranet ytterligare. </li><li> Eluera totalt RNA i en 1,5 ml Eppendorf-rör genom tillsats 40 ^ il RNas-fritt vatten till mini kolonnen och centrifugering under 1 min vid ≥8,000 x g. Mät den totala RNA-koncentration med hjälp av en lämplig spektrofotometer. </li></ol> 2,2) miRNA cDNA-framställning <ol><li> Förbered omvänd transkription Master Mix. Varje prov kräver 4 pl av 5x miScript Hispec buffert, 2 ^ il 10 x nucleics mixen miScript 2 il omvänt transkriptas mix. </li><li> Alikvot 8 pl av masterblandning i ett PCR-rör, tillsätt önskad volym av totalt RNA (250 ng), och tillsätt RNase-fritt vatten till en slutlig volym av 20 | il. </li><li> Inkubera under 60 minuter vid 37 ° C.Incubate under 5 min vid 95 ° C för att inaktivera miScript Reverse Transcriptase Mix. </li><li> Lägg 200 pl RNase-fritt vatten till varje 20 ul omvänd-transkriptionsreaktion, förvara vid -20 ° C, eller vidare med real-timig PCR omedelbart. </li></ol> 2.3) Stamceller och utvecklingsvägar Fokuserade miRNA PCR Array <ol><li> Bered PCR komponenter mixen i ett 15 ml rör genom tillsats 1375 pl av 2x SYBR grön Master Mix, 100 | il miRNA cDNA-beredning, 275 ul av 10x miScript Universal Primer, och 1000 | il RNas-fritt vatten (total volym 2750 pl). </li><li> Överför PCR komponenter mix på en PCR lastning reservoar. Försiktigt bort 96-brunnar PCR array från dess förseglade påsen. </li><li> Lägg 25 | il PCR-komponenter blandning till varje brunn i PCR-array med en 8-kanals pipett, eller en 12-kanals pipett med användning av endast 8 spetsar. Ändra pipettspetsar efter varje pipettering steg för att undvika korskontaminering mellan brunnarna. </li><li> Förslut plattan med optisk självhäftande film, och centrifugera i 1 min vid 1000 xg vid rumstemperatur (15-25 ° C) för att avlägsna bubblor. Inspektera plattan underifrån för att garantera att inga bubblor i brunnarna. </li><li> Placera 96 ​​brunnars platta PCR matrisen i realtid cycler. </li><li> Programmera realtids cycler enlighet med detta: 1 cykel vid 95 ° C under 10 min och 45 cykler för 15 sek vid 95 ° C och en minut vid 60 ° C ställa en enda (insamling fluorescens data). </li><li> Exportera Ct-värdena för alla brunnar till ett tomt Excel-ark för användning med PCR Array Data Analysis Mall Excel och webbaserad programvara. OBS: Programvaran finns på <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Beräknings Analys för miRNA Mål Prediction och validering av Target mRNA från Reporter plasmidtransfektion och Ddual Luciferase Assay. 3,1) Beräkningsanalys för miRNA Target Prediction <ol><li> Bläddra PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, på nätet tillgängligt algoritm för identifiering av miRNA rikta förutsägelse mRNA. </li><li> Klicka på &quot;klicka här för PicTar förutsägelse på ryggradsdjur&quot;. En ny sida öppnas. </li><li> I den nya sidan, PicTar webbgränssnitt, välj arter i rullgardinsmenyn och sätt miRNA av intresse för miRNA ID rutan. Klicka sökandet efter mål av en miRNA. </li><li> Observera en lista med mål-mRNA efter aPicTar poäng. OBS: PicTar beräknar en poäng avspeglar sannolikheten att en given UTR riktas av den valda miRNA, och baseras på utsädes komplementaritet, termodynamik och en kombinato prognos för gemensamma mål i uppsättningar av co-uttryckta miRNA 22. </li><li> Likaså hämta listan över målgrupp mRNA använder DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, och TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativt på linje finns algoritmer. </li><li> Sammanställ en jämförande tabell över miRNAs baserat på ranking erhålls med hjälp av olika programverktyg. PicTar rankas efter poäng, DianaLab med precision (baserat på signal-brusförhållande och en precision poäng för utvärdering av betydelsen av de förväntade resultaten), och TargetScan av aggregerad PCT (baserat på utsäde komplementaritet, Fri energi bindnings, bevarande över olika arter), se tabell 1. </li></ol> 3.2) Validering av Target mRNA från Reporter plasmidtransfektion och Dual Luciferase Assay. OBS: 3 &#39;UTR luciferas reportrar för validering av mål-mRNA har tidigare beskrivits 25. <ol><li> Transfektion <ol><li> Seed HeLa-celler vid en densitet av 10 5 celler / brunn i 24-brunnars platta. </li><li> Efter 24 h, sam-transfektera HeLa-celler med 1,5 | il av transfektionsreagens och antingen 100 ng av NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR-plasmid, såväl som 20 nM miRNA härmar (HSA-MIR-96-5p för SOX5 3217; UTR, och HSA-MIR-7-5p, och HSA-MIR-17-5p för NR4A3 3 &#39;UTR respektive) per brunn. </li><li> Co-transfektera kontrollbrunnar med NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid och fluorokroma märkt negativa kontroll siRNA. Den transfektion av kontrollbrunnar med fluorokrom märkta negativa kontroll siRNA möjliggör utvärdering av transfektionseffektiviteten och står för härma miRNA 3&#39;UTR binder specificitet. </li></ol></li><li> Mätning av Dual luciferasaktiviteter <ol><li> Mät Firefly och Renilla luciferasaktiviteter 24 h efter transfektion. Avlägsna celltillväxtmedium. </li><li> Bered arbetslösn I genom tillsats av 50 | il substrat I i 10 ml av Lösning I; blanda väl. Lägg 300 pl arbetslösning I in i varje 24 brunn. </li><li> Överför innehållet i varje 24 väl in i tre brunnar i en 96 vit platta, 100 pl vardera. Vänta 10 minuter och mät Eldflugeluciferas i luminometer set för luminiscens förvärv. </li><li> Bered arbets solutjon II genom att tillsätta 50 | il substrat II i 10 ml av lösning II; blanda väl. Lägg 100 pl arbetslösning I i var 96 väl redan innehåller 100 pl arbetslösning I. </li><li> Vänta 10 minuter och mät Renilla luciferas i luminometer set för luminiscens förvärv. Beräkna förhållandet luminiscens från Eldflugeluciferas till Renilla luciferas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+repair:+cell+therapy+in+stroke.">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li><li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+feel+the+difference.">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li><li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells.">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).</li><li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype.">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li><li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alvetex(R):+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture.">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture:+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity.">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures.">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data.">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels.">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).</li><li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Alla författare är anställda, lager och / eller optionsinnehavarna i ReNeuron Ltd eller dess moderbolag. Denna studie stöds av ReNeuron (RENE.L).

Utvecklingen av nya in vitro-analyser för att utvärdera och förbättra differentiering av stamceller har alltid inneburit en utmaning för utredning av deras funktioner och terapeutiska möjligheter. Långsiktig och stabil infästning av hNSCs, som krävs för att utveckla en robust 3D i differentiering vitro, togs upp av att testa flera 3D substrat med olika egenskaper vad gäller material och strukturer. Som en del av analysutveckling vi också bedömt optimal cellsådd koncentration och identifierade kravet för byggnadsställningar som ska lamininbelagda. Även våra hNSCs spontant kan skilja på 4-OHT och tillväxtfaktor borttagning, genomförandet av en 3D odlingssystem visade en signifikant förbättring i deras differentiering förmåga mätt med Axon process utväxt jämfört med vanliga 2D differentierade hNSCs. För att undersöka effekten av 3D inducerad differentiation på hNSC miRNA uttryck vi använde en PCR-array. Jämfört med standard chip microarray-PCR array erbjuder fördelarna med en direkt kvantifiering och validering av miRNA av intresse. Även PCR array är begränsad i tid av totala antalet miRNA per matris, till exempel i här mindre än 96, kan den anpassas till specifikt omfatta miRNA av intresse, i vårt fall som tidigare rapporterats i stamcellsutveckling. Uttrycket av pathway fokuserade miRNA var profilerade i 3D och 2D differentierade hNSCs jämfört med odifferentierade hNSCs. De mest markant nedregleras miRNA valdes ut och analyserats för att utvärdera sina förmodade målgrupp mRNA med avsikt att bestämma deras funktionalitet och biologisk tolkning använder nätet tillgängliga algoritmer (DIANA Lab, PicTar och TargetScans). En enda miRNA kan känna igen hundratals mål och därför vi validerade miRNA interaktioner med 3 &#39;UTR mRNAsthat kan vara lämpliga kandidater i ettxonal reglering. NR4A3, ett mål av HSA-MIR-7, och MIR-17 familjen, är medlem av NR4A familjen nukleära receptorer som, beroende på deras nivå av uttryck, är involverade i differentiering, överlevnad, apoptos och reglering av hippocampus axon vägledning 26. Likaså SOX5, ett mål av HSA-MIR-96, rapporteras att kontrollera cellcykelprogression hos neurala stamceller 27 Axon längd 28, migration, post vandrande differentiering, och projektioner av nervceller 29. Både SOX5 och NR4A3 identifierades som ett direkt mål mRNA av HSA-MIR-96, och HSA-MIR-7 respektive 17 av dubbla luciferas reporter analyser. Dubbla luciferas (Firefly och Renilla) åberopat två olika rapportgener i samma plasmid och erbjuder ett förbättrat system möjliggör normalisering för effekter orsakade av suboptimal transfektion och cytotoxiska effekter jämfört med en enda luciferas plasmid systemet. Som en del av vår analysutveckling vi optimerat också vår transfektion conditions för att erhålla hög verkningsgrad. Den protocolsdescribed häri kan utnyttjas för att ytterligare optimera och karakterisera in vitro hNSC differentiering som kan beimplemented intransplantation protokoll för prekliniska studier och framtida kliniska tillämpningar.

Stamcellsforskning spelar en central roll i regenerativ medicin, som också spänner disciplinerna vävnadsteknik, utvecklings cellbiologi, cellulära terapi, genterapi, och biomaterial (byggnadsställningar och matriser). Stamceller är viktiga i både organ developmentand vävnad reparera; förstå hur stamceller fungerar är avgörande för att utveckla nya stamcellsbaserade behandlingar en. CTX0E03 är en klonal, villkor förevigat neurala stamceller människa (hNSC) linje 2 isolerad från första trimestern human foster cortex. CTX0E03 har definierat kvalitetsegenskaper som är väsentliga för klinisk cellbank enligt god tillverkningssed (GMP) 3. HNSCs kan spontant differentiera till neuroner, Glia, och oligodendrocyter och har visat sig lindra neurologiska underskott när transplanterade i en gnagare modell av fokal ischemi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs är för närvarande i kliniska prövningar för stroke disabillighet (NCT01151124 6 och NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNA har en genomsnittlig 22 nukleotider långa och har visat reglerande molekyler 7, de inte kodar för proteiner, utan snarare binder 3 prime otranslaterad region (3&#39;UTR) i mRNA, som reglerar deras stabilitet och översättning till protein. MiRNA rapporteras att delta i regleringen av ett antal cellulära processer, inklusive utveckling, proliferation och differentiering 8. Flera miRNA har varit inblandade i regleringen öde och specifikation av neurala stamceller 9. I tvådimensionell (2D) standardkulturmiljön komplexiteten i in vivo miljön inte matchas, och följaktligen induktion och reglering av hNSC differentiering inte är optimal. In vivo celler omgivna av en tredimensionell (3D) mikromiljö bestående av andra celler och extracellulära ligander, däribland mångatyper av kollagener, laminin och andra matrixproteiner (extracellulär matrix, ECM). Tidigare studier har rapporterat att den arkitektoniska topografi materialen härma ECM och deras geometri påverkar cellfenotyp och öde 10-15. Ett antal kommersiellt tillgängliga 3D byggnadsställningar är tillgängliga; vi använde en mycket porös polystyren byggnadsställning konstruerad med en väldefinierad och enhetlig arkitektur i en 200 | im tjockt membran som ger en 3D-utrymme i vilket celler kan invadera och differentiera 16-18. Häri 2D och 3D differentierings analyser används för att bedöma axonprocess utväxt. Dessutom beskriver vi en metod för att profilera miRNA uttryck för en klinisk kvalitet hNSC linje att närmare undersöka miRNA effekter på dess differentiering. Metoderna på här illustrerade är baserade på vad som tidigare beskrivits i 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Neurala stamceller (NSCs) har förmåga att självförnyelse och differentiering till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter under specifika lokala mikromiljöer. Här inne, presenterar vi en rad metoder som används för tredimensionell (3D) differentiering och miRNA analys av en klonal human neural stamcell (hNSC) linje, för närvarande i kliniska prövningar för stroke funktionshinder (NCT01151124 och NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs härleddes ur ett etiskt godkänd första trimestern human foster cortex och villkor förevigat med hjälp retroviral integrering av ett enda exemplar av c-mycER TAM konstruera. Vi beskriver hur man mäter axon process utväxt av hNSCs differentierade på 3D byggnadsställningar och hur man kvantifiera tillhörande förändringar i miRNA uttryck använder PCR array. Vidare exemplifierar vi beräkningsanalys i syfte att välja miRNA förmodade mål. SOX5 och NR4A3 identifierades som lämpliga miRNA förmodade målet utvalda betydligt nedreglerad miRNA i differentierad hNSC. Mirna målet validering utfördes på SOX5 och NR4A3 3&#39;UTRs genom dubbel reporter plasmidtransfektion och dubbla luciferasanalys.

I figur 1 åskådlig utredningen och kvantifiering av hNSC differentiering på 3D-ställningar jämfört med traditionella platta ytan kulturer (2D) och expressedas axon process utväxt mätningar. I figur 2 är representedthe arbetsflöde och resultaten för miRNA kvantifiering med hjälp av stamceller och utvecklingsvägar fokuserade miRNA PCR array att undersöka differentiell uttryck av miRNA i 2D- och 3D-differentierade hNSCs jämfört med odifferentierad kontroll. Efter miRNA jämförande analys mellan differentierade och odifferentierade hNSCs och beräkningsanalys för mål prediktion, SOX5 och NR4A3 (NOR1) identifierades som förmodade målgrupp mRNA. För att studera direkt interaktion mellan miRNA och deras förmodade plats på 3&#39;UTR mRNA vi använt två kommersiellt tillgängliga plasmider som innehåller antingen SOX5 eller NR4A3 3&#39;UTR sekvens insatt nedströms eldfluga luciferasreportergenen, en<html> nd innehåller i samma plasmid Renilla luciferasgen för normalisering. De representativa resultaten av 3 &#39;UTR luciferasaktivitet nedreglering presenteras i figur 3. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figur 1:. Differentiering av hNSCs på 3D byggnadsställningar, och mätning av Axon process es utväxt (A) Efter standard ICC färgning för β3-tubulin (grön) och kärnor motfärgade med Hoechst (blå) representativa mikroförvärvades och mätning av axon processer var utförs med hjälp av en bildanalysmjukvara. (B) Diagram rapportering mätning av axonet process utväxt utförs i 2D och 3D differentierade hNSCs för 1 (1W) eller 3 veckor (3W).com / filer / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figur 2:. Schematisk arbetsflöde av miRNA profilering i differentierade hNSCs Total RNA, inklusive miRNA, extraherades från antingen differentierade hNSCs på 3D byggnadsställningar och standard 2D kulturer, eller odifferentierad kontroll. 250 ng av totalt RNA var retro transkriberas med en metod som underlättar den selektiva omvandlingen av mogna miRNA till cDNA lämplig för miRNA kvantifiering med mänsklig celldifferentiering och utveckling miScript miRNA PCR array. Den geo-medelvärdet av SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A och RNU6-2 användes för dataanalys baserad på 2 -ΔΔct metoden. Väsentliga förändringar definierades som +/- 1,5 fälla upp och ner reglering till en staiskt signifikant utsträckning. Data analyserades med hjälp av webbaserad programvara finns på Resultaten uttrycks som en clustergram. Modifierad från figur 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figur 3: Validering av miRNA mål förutspådde mRNA med hjälp av en dubbel luciferas rapport analys. (A) representant diagram över en dubbel luciferasrapportör plasmid används som ett verktyg för att validera 3&#39;UTR sekvens som ett direkt mål för ett miRNA. (B) representant mikrofotografi visar transfektionseffektivitet. (C) &#160; Signaler, uttryckt som relativ luciferasaktivitet, från människa 3 &amp; #39; UTR reportrar ofSOX5 och NR4A3 gener betydligt knockade i närvaro av HSA-MIR-96, och HSA-MIR-7 och 17 miRNA härmar respektive. Modifierad från figur 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Målgen </td><td> Målställen / gener hittade </td><td> Precision </td><td> Värdering </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> HSA-MIR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6,74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0,72 </td><td> 4,75 </td><td> 0,85 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0,84 </td><td> 3,05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> 0,96 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1,61 </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0,17 </td><td> NF </td><td> 0,88 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,85 </td><td> 5,87 </td><td> 0,63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-MIR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,9 </td><td> 5,87 </td><td> 0,63 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,9 </td><td> 5,38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0,97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0,94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Förteckning över miRNA mål förutsägelse mRNA. Representant bord miRNA, rikta prediktiva gener, och algoritmer analys (förutsägajon / poäng / aggregat tillhandahålls med hjälp Diana Lab, PicTar och TargetScan respektive). Modifierad från tabell 3 19.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiering av SH-SY5Y humana neuroblastom cellinje

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generation av genetiskt modifierade Organotypiska Skin kulturer Använda devitaliserad Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Odling av humana pluripotenta och neurala stamceller i en sluten cellodlingssystem för Basic och preklinisk forskning

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Zika Virus infektion av odlade mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för Immunocytochemical analys

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensionella Organotypic kulturer av vestibulära och auditiv sinnesorgan

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...