Name: influenza virus propagation in embryonated chicken eggs
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00
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The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

NOTA: Observações gerais: executar todos os procedimentos que envolvem a manipulação do ovo em condições estéreis, e uma técnica estéril deve ser usado em conformidade. Pré-limpa todos os equipamentos com etanol 70% antes do uso. Em geral, a inoculação e colheita vírus influenza deve ser realizado em um laboratório BSL-2. No entanto, se esse protocolo é usado para propagar muito mais patogênico vírus da gripe (por exemplo, cepas pandêmicas e pré-pandemia, estirpes que representam um perigo pa...

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	<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li><li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus.">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li><li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus:+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice.">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li><li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+and+the+challenge+for+immunology.">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li><li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuing+challenges+in+influenza.">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+15G.1+Influenza:+propagation,+quantification,+and+storage.+.">Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. .</a> Current protocols in microbiology. , (2006).</li><li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome.">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li><li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection.">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li><li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses.">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells).">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li></ol>

Influenza provoca uma grande carga global de doenças, eo trabalho continua para a compreensão da patogênese da lesão pulmonar 7. Para facilitar a investigação nesta doença mortal, vários métodos têm sido desenvolvidos para propagar o vírus da gripe 6. Aqui, descrevemos uma técnica para produzir vírus influenza em ovos de galinha. A vantagem deste método é que é altamente reprodutível e resulta em grandes quantidades de estoques de vírus de título elevado gripe, o que é muitas ve...

Influenza A continua a ser uma grande ameaça para a saúde humana. É uma doença respiratória potencialmente devastador com uma grande carga global causando até 500.000 mortes no mundo anualmente 1. Os vírus da gripe estão na família Orthomyxoviridae e levar de cadeia simples RNA 8 negativas-sense em seu genoma 1,2. A mutabilidade alta (isto é, &quot;deriva&quot; antigénico) do genoma viral impede a imunidade a longo prazo. Além disso, a gripe é cada vez mais resistentes aos medicamentos anti-virais 3. A pandemia de gripe H1N1 2009 em destaque todas as questões desafiadoras associados à doença influenza (estirpe pandémica, a resistência anti-viral, a produção de vacinas em atraso). A formulação da vacina é determinado anualmente pela Organização Mundial de Saúde para as cepas de influenza provavelmente patogênicos (um para cada H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Uma vez que este método é baseado na estirpe da gripe previus, estirpes patogénicas são ocasionalmente incorretamente identificado e eficácia da vacina cai drasticamente. Além disso, o surgimento de novas cepas de influenza pode contornar esses programas preventivos que causam doenças pandêmicas 2. A criação de uma vacina contra a gripe universal tem sido difícil 5. Portanto, a pesquisa deve continuar na compreensão da patogênese da lesão pulmonar. Para pesquisas de laboratório instalação, vários métodos foram desenvolvidos para o isolamento viral e propagação 6. Os vírus influenza humanos pode ser amplificado em uma variedade de substratos de células de mamíferos. No entanto, gerando vírus de título elevado em grandes quantidades são atingidas mais facilmente em ovos embrionados. O protocolo seguinte descreve uma técnica para a propagação de vírus influenza A e armazenamento de stocks de vírus existentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="873">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:225px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:225px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:128px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&#160;</td>
			<td>VALO BioMedia</td>
			<td style="width:128px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">humidified egg incubator&#160;</td>
			<td>FARM iNNOVATORS</td>
			<td>Model 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">automatic egg turner</td>
			<td>FARM iNNOVATORS</td>
			<td>Model 3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg candler</td>
			<td>FARM iNNOVATORS</td>
			<td>Model 3300&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:225px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:128px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">18G needle</td>
			<td style="width:225px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:128px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">20G / 22G needle</td>
			<td style="width:225px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:128px;">305176 / 305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">HEPES</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol, &#62;99.5%</td>
			<td style="width:225px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">459844</td>
			<td>diluted to 70% using water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">glue gun &#34;Ad tech Hi Temp Project Pro&#34;</td>
			<td style="width:225px;">Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td>
			<td>Model 1105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">glue &#34;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&#34;</td>
			<td style="width:225px;">Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td>
			<td>220-34ZIP30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">MDCK cells</td>
			<td style="width:225px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td>
			<td style="width:225px;">Lampire Biological Laboratories</td>
			<td>724908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

influenza virus propagation in embryonated chicken eggs

A infecção por influenza está associada com cerca de 36.000 mortes e mais de 200 mil internações por ano nos Estados Unidos. O surgimento contínuo de novas estirpes do vírus da influenza, devido a mutação e de re-sortido complica o controlo do vírus e necessita o desenvolvimento permanente de novas drogas e vacinas. O estudo baseado em laboratório da gripe requer um método confiável e de custo eficaz para a propagação do vírus. Aqui, um protocolo global prestada para influenza A propagação do vírus em ovos de galinhas férteis, que consistentemente produz stocks virais título elevado. Em breve, isentos de agentes patogénicos (SPF) de ovos de galinha fertilizados de soro são incubadas a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. Durante este período, o desenvolvimento do embrião pode ser facilmente monitorizado utilizando um candler ovo. A inoculação do virus é realizada por injecção de estoque de vírus na cavidade alantóide usando uma agulha. Após 2 dias de incubação a 37 ° C, os ovos sãorefrigeradas durante pelo menos 4 horas a 4 ° C. A casca de ovo de cima do saco de ar e a membrana corioalantóica são então cuidadosamente aberto e o fluido alantóide que contém o vírus é colhido. O fluido é limpa de detritos por centrifugação, aliquotado e transferido para -80 ° C para armazenamento a longo prazo. A grande quantidade (5-10 ml de fluido por ovo contendo vírus) e título de alta vírus quais geralmente são obtidas com este protocolo fez com que o uso de ovos para a preparação de vírus nosso método favorável, em particular, para estudos in vitro que necessitem de grandes quantidades de vírus em que são necessárias doses elevadas da mesma reserva de vírus.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para titular o vírus da gripe. Uma consideração na escolha de um método adequado é que alguns determinar partículas totais, independentemente da viabilidade (por exemplo, o ensaio de hemaglutinina), enquanto outros são baseados em infectividade, que avaliará virions viáveis ​​(por exemplo, teste de placas) 6. Aqui, o título virai de líquido alantóico recolhidas a partir de ovos de galinha inoculados com um vírus da gripe adaptada-rato...

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Estudos do Vírus Influenza A em um Modelo de Infecção de Camundongos

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...